Name: Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Öğrenin, suprakiazmatik nükleus nöronlarında eşzamanlı elektrofizyolojik kayıt ve kalsiyum görüntüleme yöntemini. Bu teknik, sinir hücresi aktivitesi ve kalsiyum dinamikleri arasındaki ilişkiyi incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Çalışma, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden (GM096972) bir hibe ile finanse edildi.

1. Hipotalamik Beyin Dilimlerinin Hazırlanması
<ol>
	<li>Hayvanları içeren herhangi bir prosedür için Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) onayını önceden alın. Burada açıklanan hayvan prosedürleri, Hayvanların Ötenazisi için AVMA Yönergeleri 2013 ile uyumludur ve Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi IACUC tarafından önceden onaylanmıştır.</li>
	<li>MgCl2 ve CaCl2 olmadan 500 ml dilimleme tamponu hazırlayın (Tablo 1). Çözeltiyi oda sıcaklığında %95O2 ve %5 CO2 ile köpürtün, ardından havalandırmaya devam ederken MgCl2 ve CaCl2 ekleyin. Sükroz ile ozmolariteyi 300 mOsm'ye ayarlayın. Ozmolarite, bir buhar basıncı ozmolarometresi ile ölçülür.</li>
	<li>MgCl2 ve CaCl2 olmadan 1 L kayıt ortamı hazırlayın (Tablo 2). Çözeltiyi %95O2 ve %5 CO2 ile köpürtün, ardından havalandırmaya devam ederken MgCl2 ve CaCl2 ekleyin. NaOH (10 N) ile pH'ı 7.2-7.4'e ve sükroz ile ozmolariteyi 300 mOsm'ye ayarlayın. HEPES tamponunun eklenmesi isteğe bağlıdır ve pH'ı daha da stabilize etmek için kullanılmıştır.</li>
	<li>Dilimleme ve kayıt çözeltileri, kullanımdan önce birkaç gün buzdolabında saklanabilir.</li>
	<li>% 3 agaroz hazırlayın ve steril bir Petri kabına (6 mm derinliğinde) dökün ve soğutun.</li>
	<li>Yaklaşık 6 mm x 6 mm x 6 mm boyutlarında üç küp agaroz kesin.</li>
	<li>Dört ila sekiz haftalık bir Sprague-Dawley sıçanı izofluran ile derinlemesine anestezi uygulayın. Anestezi derinliğini test edin. Ayak tabanının sıkıştırılmasını takiben arka bacakta çekilme refleksi olmadığında anestezi derinliği uygun kabul edilir. Uygun şekilde anestezi uygulandıktan sonra, sıçan hızlı dekapitasyon ile ötenazi yapılır. </li>
	<li>Önce optik sinirleri kesmeye dikkat ederek beyni hızla çıkarın ve% 5 CO2 ve% 95 O2 ile doyurulmuş buz gibi soğuk dilimleme çözeltisine koyun ve 2-3 dakika soğumaya bırakın.</li>
	<li>Beyni kırpın. Beyni, buz üzerinde duran bir cam Petri kabının üzerine yerleştirilmiş nemli (dilimleme solüsyonu ile) dairesel bir filtre kağıdına forseps kullanarak yerleştirin.</li>
	<li>Kalan beyincik ve beyin sapını, ardından rostral korteksi ve yanları çıkarmak için beyni koronal olarak kesin, böylece SCN, optik sinirler ve optik kiazma içeren tarafı dikkatlice koruyarak hipotalamus içeren bir beyin bloğu bırakın.</li>
	<li>Beyni ve agaroz bloklarını buz gibi soğuk ama kuru bir mikrotom dilimleme odasına yapıştıracak kadar büyük ince bir siyanoakrilik yapıştırıcı tabakası yayın.</li>
	<li>Buz gibi soğuk beyin bloğunu, kaudal tarafı aşağı bakacak şekilde, SCN'yi içeren taraf, optik sinirler yukarıyı gösteren bir "V" oluşturacak şekilde önce kesmek için konumlandırılacak şekilde yapıştırıcının üzerine aktarın.</li>
	<li>Agaroz bloklarını diğer 3 tarafa yerleştirin. Hazneyi sürekli olarak %5 CO2 ve% 95 O2 ile köpürtülmüş buz gibi soğuk dilimleme tamponu ile doldurun. Siyanoakrilik yapıştırıcı, beyni ve agaroz bloklarını yerinde tutan nem ile katılaşacaktır.</li>
	<li>SCN'yi içeren koronal hipotalamik dilimleri (220-250 μm kalınlığında) titreşimli bıçak mikrotomu ile kesin. Tipik olarak, optik kiazmanın yaklaşık 2-4 mm genişliğinde olduğu, SCN'nin sadece dorsal olduğu beyaz bir bant gibi görünen, 3. ventrikülün her iki tarafındaki optik kiazmada iki küçük "girinti" olarak görünen bir dilim seçilir (Şekil 1A).</li>
	<li>Dilimleri bir Leica DMLFS mikroskobunun tablasına monte edilmiş kayıt odasına (36 °C) yerleştirin. Hazne, %95 O2 ve% 5 CO2 ile havalandırılan sürekli akan kayıt çözeltisi (2 ml / dak) ile doldurulur ve bir hat içi ısıtıcı ile önceden ısıtılır.</li>
	<li>Dilim hazırlığından 0.5-8 saat sonra SCN nöronlarında tam hücre yama kelepçesi ve kalsiyum görüntüleme kayıtları yapın.</li>
</ol>
2. Yama Kelepçesi Kaydı
<ol>
	<li>Elektrot çözeltisini (hücre içi) çözeltisini toplam nihai su hacminin yarısında hazırlayın.</li>
	<li>Çözeltiyi KOH (1 N) ile pH 7.3'e ayarlayın.</li>
	<li>Kalan suyu ekleyin. Çözeltinin nihai ozmolaritesi 280-290 mOsm aralığında olmalıdır.</li>
	<li>Elektrot çözeltisini 0.2 μm'lik bir filtreden geçirin, alikot (0.5 ml) mikrofüj tüplerine aktarın ve -20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>1 mg bis-fura-2 heksapotasyum tuzunu 99.29 μl 0.2 μm filtrelenmiş su ile karıştırarak kalsiyum probu bis-fura-2 hekzapotasyum tuzu stok çözeltisini (10 mM) hazırlayın.</li>
	<li>Ayrı tüplere (her biri 2-5 μl) ayırın ve dondurun (-20 °C).</li>
	<li>Kullanmadan kısa bir süre önce bir iç çözelti ve Ca2 + probunu çözün. Son 50 μM kalsiyum probu konsantrasyonu için 400 μl iç çözeltiye 2 μl bis-fura-2 stok çözeltisi ekleyin. Çözeltileri karıştırmak için kısaca ezin. Kalsiyum prob konsantrasyonu (10-250 μM) deneysel tasarıma ve görüntüleme sistemine bağlı olarak değişir. Bis-fura-2'nin iki bağlı fura-2 molekülünden oluştuğunu unutmayın.</li>
	<li>Tüm hücre yama elektrotlarını, hücre içi çözelti ile doldurulduğunda yaklaşık 1 μm'lik bir dış uç çapına ve 7-10 MΩ'luk dirençlere iki aşamada çekin.</li>
	<li>Elektrodu, bir Microfil tüpü aracılığıyla düşük hacimli numuneler için 4 mm'lik bir şırınga filtresi (0,2 μm) ile filtrelenmiş kalsiyum probunu içeren birkaç μl dahili solüsyonla doldurun.</li>
	<li>Bir video monitöründe görüntülenirken kırmızı ışık aydınlatması altında kayıt odasına yönlendirilirken elektroda az miktarda pozitif basınç uygulayın. </li>
	<li>Düşük güç hedefi (4X) kullanarak mikroelektrodu SCN'nin üzerine yerleştirin. SCN, üçüncü ventrikülün her iki yanında ve optik kiazmanın dorsalinde iki yarı saydam alan olarak tanımlanır (Şekil 1A).</li>
	<li>Mikroskobu yüksek güçlü bir büyütme oranına (40X veya 63X) geçirin. SCN'nin alt bölgeleri ve bireysel SCN nöronları, daha yüksek büyütmede kayıt için hedeflenebilir.</li>
	<li>Bir nöronun yüzeyine ilerletildiğinde mikroelektroda hafif pozitif basınç uygulayın.</li>
	<li>3-10 GΩ dirençli bir sızdırmazlık oluşturmak için mikroelektroda hafif negatif basınç uygulayın.</li>
	<li>Toplama yazılımı ile kontrol edilen amplifikatör ile membran voltajını -60 mV'a ayarlayın.</li>
	<li>Hücre zarını tüm hücre moduna yırtmak için elektroda ek negatif basınç uygulayın.</li>
	<li>Tüm hücre moduna girdikten sonra SCN, nöron, soma ve dendritler floresan prob ile dolar.</li>
	<li>Membran voltajı, kalsiyum probu görüntü verileri izlenirken ve saklanırken (aşağıda açıklanmıştır) akım-kelepçe modunda veya voltaj-kelepçe modunda akım ölçülür. Deney sırasında elde edilen görüntüleri 340 nm/380 nm oranlı floresan verilerinin bir grafiğiyle birlikte görüntüleyin.</li>
</ol>
3. Hücre İçi Ca2+ Ölçümü
<ol>
	<li>Kantitatif Ca2+ ölçümleri, 10 nm bant genişliğine sahip bir monokronometre aracılığıyla 340 nm ve 380 nm'de UV ışığı ile dokunun hızla uyarılması ve 400 nm'nin üzerindeki harmonik dalga boylarını sınırlamak için UG11 optik filtreden, 400 nm DCLP dikroik ve 510±40 nm emisyon filtresinden yayılan ışıktan geçirilmesiyle elde edilir.</li>
	<li>Görüntüler, foto ağartmayı en aza indirmek ve kayıt hızını en üst düzeye çıkarmak için çekim süresi ve gruplama ayarlanmış soğutulmuş bir CCD kamera kullanılarak elde edilir.</li>
	<li>Görüntüleri elde etmek ve görüntülemek için kantitatif görüntüleme yazılımı kullanılır.</li>
	<li>Bağıl floresan yoğunluk birimi verilerine (yani soma, dendrit, vb.) dönüştürülecek ilk görüntüden ilgilenilen bölgeleri seçin. Ayrıca arka plan floresansının ölçümü için bir bölge seçin (Şekil 1B).</li>
	<li>Ham görüntüler ve niceliksel optik veriler, deney sırasında sürekli olarak kaydedilir. Deneyden sonra, kaydedilen görüntüler genellikle ölçülecek ilgi alanlarını daha doğru bir şekilde seçmek için daha fazla zaman ayrılabildiğinde yeniden analiz edilir.</li>
	<li>Veriler, tahmini hücre içi kalsiyum konsantrasyonu (Est [Ca2 +] i) olarak sunulabilir. Kalsiyum konsantrasyonunu hesaplamak için 340 nm ve 380 nm'de maksimum ve minimum floresan ile birlikte 340 nm'de uyarma ve arka plan çıkarmanın ardından yayılan ışığın oranı (R), 380 nm'ye bölünür4. Arka plan çıkarma ve diğer hesaplamalar, veri analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir.</li>
	<li>Maksimum ve minimum bis-fura-2 floresansının in vitro tayini, Ca2+ bağlı için 10 mM CaCl2 ve Ca2+ serbest koşullar için 10 mM EGTA kullanılarak gerçekleştirilebilir. Probun Ca2+ ayrışma sabiti, Kd, bis-fura-2 (Invitrogen) için 370 nM olarak alınır.</li>
</ol>

<ol><li>Bading, H., Ginty, D. D., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gene+expression+in+hippocampal+neurons+by+distinct+calcium+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of gene expression in hippocampal neurons by distinct calcium signaling pathways.</a> Science. 260, 181-186 (1993).</li>
<li>Ghosh, A., Ginty, D. D., Bading, H., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+gene+expression+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of gene expression in neuronal cells.</a> J. Neurobiol. 25, 294-303 (1994).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high+resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Higley, M. J., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+dendrites+and+spines%3A+practical+and+functional+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in dendrites and spines: practical and functional considerations.</a> Neuron. 59, 902-913 (2008).</li>
<li>Colwell, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+calcium+levels+in+cells+in+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of calcium levels in cells in the suprachiasmatic nucleus.</a> Eur. J. Neurosci. 12, 571-576 (2000).</li>
<li>Ikeda, M., Yoshioka, T., Allen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+circadian+changes+in+Ca2%2B+mobilization+mediated+by+GABAA+and+NMDA+receptors+in+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Developmental and circadian changes in Ca2+ mobilization mediated by GABAA and NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus.</a> Eur. J. Neurosci. 17, 58-70 (2003).</li>
<li>Irwin, R. P., Allen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+signaling+induces+divergent+neuronal+Ca2%2B+responses+in+the+suprachiasmatic+nucleus+network%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic signaling induces divergent neuronal Ca2+ responses in the suprachiasmatic nucleus network.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 1462-1475 (2009).</li>
<li>Berson, D. M., Dunn, F. A., Takao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+by+retinal+ganglion+cells+that+set+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phototransduction by retinal ganglion cells that set the circadian clock.</a> Science. 295, 1070-1073 (2002).</li>
<li>Hattar, S., Liao, H. W., Takao, M., Berson, D. M., Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-containing+retinal+ganglion+cells%3A+architecture%2C+projections%2C+and+intrinsic+photosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity.</a> Science. 295, 1065-1070 (2002).</li>
<li>Hartwick, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Evoked+Calcium+Responses+of+Isolated+Melanopsin-Expressing+Retinal+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-Evoked Calcium Responses of Isolated Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells.</a> J. Neurosci. 27, 13468-13480 (2007).</li>
<li>Castel, M., Belenky, M., Cohen, S., Ottersen, O. P., Storm-Mathisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-like+immunoreactivity+in+retinal+terminals+of+the+mouse+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate-like immunoreactivity in retinal terminals of the mouse suprachiasmatic nucleus.</a> Eur. J. Neurosci. 5, 368-381 (1993).</li>
<li>Card, J. P., Moore, R. Y. The organization of visual circuits influencing the circadian activity of the suprachiasmatic nucleus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCard%2C+JP+%22In+Suprachiasmatic+Nucleus+-+The+Mind%27s+Clock%22">In Suprachiasmatic Nucleus - The Mind's Clock</a>. Reppert, S. M., Klein, D. C., Moore, R. Y. , Oxford University Press. Oxford. 51-76 (1991).</li>
<li>Shigeyoshi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+resetting+of+a+mammalian+circadian+clock+is+associated+with+rapid+induction+of+the+mPer1+transcript%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Light-induced resetting of a mammalian circadian clock is associated with rapid induction of the mPer1 transcript.</a> Cell. 91, 1043-1053 (1997).</li>
<li>Albrecht, U., Sun, Z. S., Eichele, G., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+response+of+two+putative+mammalian+circadian+regulators%2C+mper1+and+mper2%2C+to+light%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A differential response of two putative mammalian circadian regulators, mper1 and mper2, to light.</a> Cell. 91, 1055-1064 (1997).</li>
<li>Yan, L., Silver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+induction+and+localization+of+mPer1+and+mPer2+during+advancing+and+delaying+phase+shifts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential induction and localization of mPer1 and mPer2 during advancing and delaying phase shifts.</a> Eur. J. Neurosci. 16, 1531-1540 (2002).</li>
<li>Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+the+mammalian+circadian+system%3A+Photic+entrainment%2C+circadian+pacemaker+mechanisms%2C+and+posttranslational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of the mammalian circadian system: Photic entrainment, circadian pacemaker mechanisms, and posttranslational regulation.</a> Annu. Rev. Genet. 34, 533-562 (2000).</li>
<li>Ding, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+the+biological+clock%3A+Mediation+of+nocturnal+circadian+shifts+by+glutamate+and+NO%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting the biological clock: Mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO.</a> Science. 266, 1713-1717 (1994).</li>
<li>Ding, J. M., Fairman, L. E., Hurst, W. J., Kuriashkina, L. R., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+the+biological+clock%3A+mediation+of+nocturnal+CREB+phosphorylation+via+light%2C+glutamate%2C+and+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Resetting the biological clock: mediation of nocturnal CREB phosphorylation via light, glutamate, and nitric oxide.</a> J. Neurosci. 17, 667-675 (1997).</li>
<li>Ding, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+ryanodine+receptor+mediates+light-induced+phase+delays+of+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A neuronal ryanodine receptor mediates light-induced phase delays of the circadian clock.</a> Nature. 394, 381-384 (1998).</li>
<li>Bollmann, J. H., Helmchen, F., Borst, J. G., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+Ca2%2B+influx+mediated+by+three+different+pathways+during+synaptic+transmission+at+a+calyx-type+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic Ca2+ influx mediated by three different pathways during synaptic transmission at a calyx-type synapse.</a> J. Neurosci. 18, 10409-10419 (1998).</li>
<li>Irwin, R. P., Allen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Response+to+Retinohypothalamic+Tract+Synaptic+Transmission+in+Suprachiasmatic+Nucleus+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium Response to Retinohypothalamic Tract Synaptic Transmission in Suprachiasmatic Nucleus Neurons.</a> J. Neurosci. 27, 11748-11757 (2007).</li>
<li>Smetters, D., Majewska, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+action+potentials+in+neuronal+populations+with+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting action potentials in neuronal populations with calcium imaging.</a> Methods. 18, 215-221 (1999).</li>
<li>Spruston, N., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforated+patch-clamp+analysis+of+the+passive+membrane+properties+of+three+classes+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Perforated patch-clamp analysis of the passive membrane properties of three classes of hippocampal neurons.</a> J. Neurophysiol. 67, 508-528 (1992).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).</li>
<li>Marty, A., Neher, E. Tight-seal whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarty%2C+A+%22Single-channel+recording%22">Single-channel recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. 2, Plenum Press. New York. 31-52 (1995).</li>
<li>Sarantopoulos, C., McCallum, J. B., Kwok, W. M., Hogan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-escin+diminishes+voltage-gated+calcium+current+rundown+in+perforated+patch-clamp+recordings+from+rat+primary+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Beta-escin diminishes voltage-gated calcium current rundown in perforated patch-clamp recordings from rat primary afferent neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 139, 61-68 (2004).</li>
<li>Hatae, J., Fujishiro, N., Kawata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+properties+of+fluorescence+dye+fura-2+with+various+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic properties of fluorescence dye fura-2 with various divalent cations.</a> Jap. J. Physiol. 46, 423-429 (1996).</li>
<li>Poenie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+intracellular+Fura-2+fluorescence+by+viscosity%3A+a+simple+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Alteration of intracellular Fura-2 fluorescence by viscosity: a simple correction.</a> Cell Calcium. 11, 85-91 (1990).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Yukarıda açıklanan yöntemler, nöron zarı elektriksel aktivitesi ile hücre içi kalsiyum konsantrasyonu arasındaki bağlantıyı aynı anda kaydetmek için güçlü bir araç sağlar. Yöntemin, çok iyi karakterize edilmiş iki yöntemi birleştirmesi bakımından bir takım güçlü yönleri vardır - tüm hücre yama kelepçesi kaydı ve floresan boyalar kullanılarak hücre içi kalsiyumun ölçümü. Yaklaşımımız, diğer araştırmacılar tarafından tanımlananlara benzer6,23.
Yöntem kullanılırken bir dizi ...

Gen ekspresyonundaki değişikliklerin, sinaptik sinyalleşmenin bir sonucu olarak nöronlarda meydana geldiği bilinmektedir. Uyarıcı nörotransmitter glutamat tarafından yapılan sinyalleme, nöronal membran potansiyelini depolarize edebilir ve sonunda gen transkripsiyonuna ve translasyonayol açabilir 1,2. İyonotropik reseptörlerin glutamat tarafından aktivasyonu, hücre dışı kalsiyum iyonlarının hücreye girmesine izin verir, bu da gen transkripsiyonunu aktive etmede ikinci bir haberci olarak kritik bir rol oynadığı düşünülmektedir. Aksiyon potansiyeli ateşleme frekansı gibi membran elektriksel aktivitesi ile hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler arasındaki ilişkinin değerlendirilmesi, iki yöntemin kombinasyonunu gerektirir - tüm hücre yaması klempleme ve floresan kalsiyum problarının3-5 kantitatif görüntülenmesi, ilişkinin bireysel nöronlarda incelenmesine izin verir. Tek hücre kayıt tekniği, beynin tanımlanabilir bölümlerinde bireysel nöronların aktivitesinin kaydedilmesine izin verir. Tüm hücre kayıt tekniği, membran voltajının veya akımının kontrol edilmesine izin vererek, belirli iyon kanalı akımlarının deneysel manipülasyonuna izin verir. Floresan kalsiyum probları ile doldurulmuş mikropipetlerin kullanılması da nöronun kalsiyum probu ile iyi bir şekilde doldurulmasını sağlar. Bu teknik, yetişkin dilim preparatlarından beyin dilimi preparatları ile çalışırken açık bir avantaja sahiptir, çünkü bu nöronların daha yaygın hücre permean probları kullanılarak yüklenmesi özellikle zordur ve potansiyel arka plan floresan sorunlarınıazaltır 6-8.
Işık, memelilerin hipotalamik suprakiazmatik çekirdekte (SCN) bulunan sirkadiyen saatlerini ayarlamalarının temel yoludur. Retinada iletilen ışık bilgisi, SCN12,13'te glutamatın salındığı retinohipotalamik sistem (RHT) yoluyla 9-11 iletilir. Glutamat, SCN nöronları üzerinde bulunan NMDA ve AMPA iyonotropik reseptörlerini açar ve bir kalsiyum ve sodyum akışı üretir ve sonuçta14-17 saat genleri ailesinin ekspresyonunu değiştirmeye yol açan hücre içi bir sinyal kaskadını başlatır ve sirkadiyen saatin18-20 fazında kaymalar. Bununla birlikte, kalsiyum nöronlara doğrudan iyonotropik glutamat reseptörleri yoluyla veya membran depolarizasyonu ve voltaja bağlı kalsiyum kanallarının (VDCC) aktivasyonu yoluyla girebilir21. Bu nedenle, SCN nöronlarında hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ile membran elektriksel aktivitesi arasındaki ilişkiyi araştırmak için deneysel bir protokol geliştirdik, örneğin aksiyon potansiyeli ateşlemesi ve sinaptik giriş22'den meydana gelir.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Balıkçı Bilimsel A.Ş.</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Bilimsel A.Ş.</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&boğa; H2O</td><td>Sigma Kimya A.Ş.</td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<alt>2</alt> boğa; 6H2O</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl<alt>2</alt> boğa; 2H2O</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glikoz</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher Bilimsel A.Ş.</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum D-glukonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5 asal, - trifosfat dipotasyum tuzu dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>Guanozin 5 & asal; -trifosfat tris tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz (ultra saf)</td> <td>Hayat Teknolojiler</td><td>15510-027</td><td>Steril Petri kabına gözenekli jel 6 mm kalınlığında tabaka</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5881</td><td></td></tr><tr><td>Bis-fura-2, heksapotasyum tuzu</td><td>Invitrogen</td><td>B6810</td><td>Hücre geçirimli</td></tr><tr><td>Ekipman Adı</td><td></td><td>Şirket Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td>Doku dilimleme</td></tr><tr><td>Siyanoakrilik yapıştırıcı (Roti-Coll1)</td><td>Carl Roth GmbH+Co</td><td>Art-Nr. 0258.1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektrot çektirme</td><td>Narshige International USA</td><td>PP-83</td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektrot Kılcal Borular</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfil 34 g</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi</td><td>Corning</td> <td># 431212</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobu</td><td>Leica</td><td>DM LFS</td><td>4X, 40X UV ve 63X UV objektifleri ve epifloresan</td></tr><tr><td>CCD Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA ER</td><td>12 bit CCD</td></tr><tr><td>Fura-2 Filtre Küpü</td><td>Chroma</td><td>71500A</td><td>UG11 filtreli</td></tr><tr><td>Set Polikrom IV</td><td>Fotonik GmBH</td><td></td><td>Monokronometre</td></tr><tr><td>Ultraviyole engelleyici güvenlik gözlükleri</td><td>Ultraviyole Ürünler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPC-9 amplifikatör</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metafluor</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>Görüntüleme Yazılımı</td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td>Veri Toplama Yazılımı</td></tr><tr><td>Igor sürüm 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Elektrofizyoloji & Ca2+ Veri Analizi</td></tr><tr><td>VAPRO 5520</td><td>Westcor</td><td></td><td>Buhar basıncı ozmometresi</td></tr></tbody></table>

eşzamanlı elektrofizyolojik kayıt ve suprakiazmatik nucleus nöronlar kalsiyum görüntüleme

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun düzenlenmesinde membran potansiyeli veya akımındaki değişikliklerin rolünü incelemek için eş zamanlı elektrofizyolojik ve floresan görüntüleme kayıt yöntemleri kullanıldı. Aydınlık-karanlık döngüsü gibi değişen çevresel koşullar, nöronal ve sinir ağı aktivitesini ve memeli beynindeki ana sirkadiyen saatin konumu olan suprakiazmatik çekirdek (SCN) içindeki bir sirkadiyen saat genleri ailesinin ifadesini değiştirebilir. Uyarıcı sinaptik iletim, sirkadiyen saat genlerinin ritmik ekspresyonunu değiştiren sinyal yollarını aktive ettiğine inanılan postsinaptik Ca2 + konsantrasyonunda bir artışa yol açar. SCN içeren hipotalamik dilimler, kalsiyum indikatörü bis-fura-2 içeren bir iç çözelti ile doldurulmuş mikroelektrotlar kullanılarak yama klemplendi. Mikroelektrot ve SCN nöronal membranı arasında bir conta oluşturulduktan sonra, membran hafif emme kullanılarak yırtıldı ve kalsiyum probu hem soma hem de dendritleri dolduran nörona yayıldı. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun kantitatif oransal ölçümleri, membran potansiyeli veya akımı ile eş zamanlı olarak kaydedildi. Bu yöntemleri kullanarak, sinaptik aktivite ve bireysel nöronların aksiyon potansiyeli ateşlemesi tarafından üretilen hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişikliklerin rolünü incelemek mümkündür. Bu sunumda, beyin dilimlerinde tutulan bireysel SCN nöronlarından hücre içi kalsiyum ile birlikte elektrofizyolojik aktiviteyi aynı anda kaydetme yöntemlerini gösteriyoruz.

Hipotalamik beyin dilimleri kullanarak, hem voltaj hem de akım klempi koşulları altında, bütün hücre modunda hücre içi kalsiyumdaki değişimleri eş zamanlı olarak kaydettik. Şekil 1A'da gösterilen mikroelektrot, düşük miktarda uygulanan pozitif basınçla, yüksek büyütme altında (40X veya 63X UV objektifleri) uygun konuma indirilir. Nörona temas ettikten sonra, hafif bir vakumla gigaohm sızdırmazlığı oluşturulur. Voltaj klempi modunda hücre membran potansiyeli -60 mV'ye ayarlandıktan sonra, ek vakumla membr...

Prosedürler, membran potansiyelinin veya akımının eşzamanlı kayıtlarını ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri gerçekleştirmek için tanımlanır. Suprakiazmatik çekirdek nöronları, tüm hücre yama kelepçesi konfigürasyonunda bir yama kelepçe elektrodu kullanılarak kalsiyum indikatörü bis-fura-2 ile doldurulur.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, eylemdeki değişiklikler, potansiyel ateşleme frekansı ve supra matic çekirdek nöronlarındaki hücre içi kalsiyum konsantrasyonu gibi voltaj veya akımdaki değişiklikler arasındaki etkileşimi incelemektir. Bu, kalsiyuma duyarlı prob ile doldurulmuş bir mikro elektrot kullanılarak SMA çekirdek nöronlarının kaydı için beyin diliminin hazırlanmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak, mikro elektrot nöronal membran ile kapatılır.Daha sonra, mikro elektrot ile kapatılmış nöronal zar, kalsiyum floresan probunu tek tek nöronlara sokmak ve membran elektriksel aktivitesini kaydetmek için yırtılır ve iki dalga boyunda voltaj veya akım ölçümlerini ve kalsiyum probu floresan görüntülerini gösteren sonuçlar elde edilir, bu dalga boylarındaki floresan oranındaki değişiklik, nöron içindeki hücre içi kalsiyum değişimini yansıtır. Hücrenin kalsiyum konsantrasyonunu belirlemek için daha sonraki analizler yapılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sinaptik aktivasyon tarafından üretilen zar elektriksel aktivitesindeki ve hücre içi kalsiyumdaki değişikliklerin, bireysel supra kozmetik çekirdek nöronlarında aynı anda ölçülebilmesidir.Bu tekniği gösteren meslektaşım Dr.Robert Ir

simultaneous-electrophysiological-recording-calcium-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz, sinirsel aktivite ve kan oksijenlenme seviyesi bağımlı (BOLD) MRG sinyal arasındaki ilişkinin araştırılması için bir platform sağlayan, aynı anda fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme ve kemirgen beyin elektrofizyolojik kayıt için bir yöntem geliştirdik.

Kemirgen Beyin aynı anda fMRI ve Elektrofizyoloji

Kortikal nöronlarda işlev popülasyonlarının düzeyinde ortaya çıkar, çünkü omurgalı merkezi sinir sisteminin fonksiyon anlama çok nöronların kayıtları gerektirir. Burada tek hücreli ve tek başak çözünürlüğe sahip supratreshold nöral aktiviteyi kaydetmek için bir optik yöntem tarif, rasgele erişim tarama titrek. Kadar yüksek zamansal çözünürlüğe sahip 100 nöronlara Bu yöntem kayıtları somatik flüoresan kalsiyum sinyalleri. Maksimum-olabilirlik algoritması somatik flüoresan kalsiyum sinyallerinden...

Tek hücreli ve tek başak çözünürlüğe sahip supratreshold nöral aktivitenin Optik kaydı

İzole hipokampi akut beyin kesitleri, hem de astrosit ve nöronların eşzamanlı elektrofizyolojik...

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Biz su kaplan semender (gelen ince retina dilim hazırlanması...

Bir Amfibi Retina Dilim hazırlanması Fotoreseptörler ve İkinci dereceden nöronlar eş zamanlı tam hücreli Kayıtlar

İki farklı beyin neuropiles veya iki farklı anatomik yolları eşzamanlı dışı uzun süreli kayıtları arıları kuruldu. Bu kayıtlar farklı beyin bölgelerinde tek nörona yanı sıra davranıyor hayvanda topluluk düzeyinde karşısında nöronal işleme zamansal açıdan soruşturma izin.

Davranan Bal arısı iki nöronal İşleme Dönemlerinde Eşzamanlı Uzun vadeli Kayıtlar

Bu iletişim kuralı ortak yerelleştirilmiş elektroansefalografi (EEG) ve multi-Laminer yerel alan bir imzalat köstebeğiyle potansiyel eşzamanlı kayıt için basit bir yöntem açıklanır. Bir elektrot yerleştirilmesi için kafatası delinen burr deliği EEG sinyal önemsiz bozulma üretmek için gösterilir.

Co yerelleştirilmiş elektroansefalografi ve yerel alan potansiyel kemirgen eşzamanlı kayıt

Bu iletişim kuralı Caenorhabditis elegans solucanlar davranışlar içinde sinirsel aktivite içinde genetik olarak kodlanmış Ca2 + gazetecilere kayıt değişiklikleri açıklar.

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

Bu çalışmada yerel alan potansiyelleri beyin, Elektrokardiyogram, electromyograms aynı anda kayıt ve sinyalleri serbestçe hareket sıçan nefes bir yöntem sağlar. Deneysel maliyetlerini azaltır ve veri analizi kolaylaştırır, bu tekniği, beyin ve periferik organlarda arasındaki etkileşimler anlayış katkıda bulunacaktır.

Kortikal yerel alan potansiyelleri, Elektrokardiyogram, Electromyogram ve ritim serbestçe hareket bir sıçan gelen nefes eşzamanlı kayıt

Retina protezleri görsel algı oluşturma özelliğine sahiptir. Yeni protezlerin geliştirilmesini ilerletmek için, implantasyondan önce cihazları test etmek için ex vivo yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu makale, elektriksel stimülasyona maruz kaldığında retinal ganglion hücre tabakasındaki kalsiyum aktivitesini incelemek için kapsamlı bir protokol sunmaktadır.

Elektrikle Uyarılan Düz Monte Retinalarda Kalsiyum Görüntüleme

Bu protokol, birden fazla hafıza ile ilgili beyin bölgesinde nöronlardan ve astrositlerden gelen kalsiyum sinyallerinin eşzamanlı kaydı için kapsamlı bir yöntem tanımı sunar ve öğrenme ve hafıza davranışı paradigmasında uygulanmasını gösterir.

Öğrenme ve Hafıza Davranışları sırasında Astrosit-Nöron Aktivitesini Birden Fazla Beyin Bölgesinde KaydEtmek İçin İki Renkli Lif Fotometri Yöntemi

Öğrenin, suprakiazmatik nükleus nöronlarında eşzamanlı elektrofizyolojik kayıt ve kalsiyum görüntüleme yöntemini. Bu teknik, sinir hücresi aktivitesi ve kalsiyum dinamikleri arasındaki ilişkiyi incelemek için kullanılır.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Daha fazla video keşfet