Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, eylemdeki değişiklikler, potansiyel ateşleme frekansı ve supra matic çekirdek nöronlarındaki hücre içi kalsiyum konsantrasyonu gibi voltaj veya akımdaki değişiklikler arasındaki etkileşimi incelemektir. Bu, kalsiyuma duyarlı prob ile doldurulmuş bir mikro elektrot kullanılarak SMA çekirdek nöronlarının kaydı için beyin diliminin hazırlanmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak, mikro elektrot nöronal membran ile kapatılır.

Daha sonra, mikro elektrot ile kapatılmış nöronal zar, kalsiyum floresan probunu tek tek nöronlara sokmak ve membran elektriksel aktivitesini kaydetmek için yırtılır ve iki dalga boyunda voltaj veya akım ölçümlerini ve kalsiyum probu floresan görüntülerini gösteren sonuçlar elde edilir, bu dalga boylarındaki floresan oranındaki değişiklik, nöron içindeki hücre içi kalsiyum değişimini yansıtır. Hücrenin kalsiyum konsantrasyonunu belirlemek için daha sonraki analizler yapılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sinaptik aktivasyon tarafından üretilen zar elektriksel aktivitesindeki ve hücre içi kalsiyumdaki değişikliklerin, bireysel supra kozmetik çekirdek nöronlarında aynı anda ölçülebilmesidir.

Bu tekniği gösteren meslektaşım Dr.Robert Irwin olacak. Bu prosedüre, sıçan beynini bir cam Petri kabı üzerine dilimleme solüsyonu ile nemlendirilmiş dairesel bir filtre kağıdına yerleştirerek başlayın, buz üzerinde dinlendirin, beyin koronasını sadece beyincik ve beyin sapını çıkarmak için kesin ve korteksin sağ ve sol taraflarının kısımlarını kesin, hipotalamus içeren bir beyin bloğu bırakın ve SCN optik sinirleri ve optik kiazmayı içeren beynin ventral tarafını dikkatlice koruyun. Bundan sonra, buz gibi soğuk bir mikrotom dilimleme haznesine beyin ve aros bloklarını tutturacak kadar büyük ince bir Sano akrilik yapıştırıcı tabakası yayın.

Buz gibi beyin bloğunu, SCN'yi içeren taraf önce kesmek için konumlandırılmış ve optik sinirler yukarıyı gösterecek şekilde bir v oluşturacak şekilde yapıştırıcının üzerine aktarın, aros bloklarını diğer üç tarafa yerleştirin. Daha sonra hazneyi buz gibi soğuk dilimleme tamponu ile doldurun ve sürekli olarak karbojen ile köpürtün. Sano akrilik yapıştırıcı nem ile katılaşacak ve beyni ve aros bloklarını yerinde tutacaktır.

Daha sonra SCN içeren koronal hipotalamik dilimleri 220 ila 250 mikron kalınlığında kesin. Kesim sırasında sol aros bloğunun ayrıldığına dikkat edin. Yetersiz yapıştırıcı uygulanırsa bu olabilir.

Bundan sonra, SCN'yi içeren dilimi tanımlayın. Tipik olarak, optik kiazmanın yaklaşık iki ila dört milimetre boyunca beyaz bir bant gibi göründüğü ve SCN'nin sadece dorsal olarak üçüncü ventrikülün her iki tarafındaki optik kiazmada iki küçük girinti olarak göründüğü bir dilim seçilir. Bir dilimi mikroskop tablasına monte edilmiş 36 santigrat derece kayıt odasına aktarın.

Hazne, dakikada iki mililitre hızla sürekli akan kayıt çözeltisi ile doldurulur. % 95 karbojen ile havalandırılır ve sıralı bir ısıtıcı ile önceden ısıtılır. Üçüncü ventrikülün her iki yanında, iletilen ışıkla aydınlatıldığında siyah bir bant gibi görünen optik kiazmanın dorsalinde bulunan iki yarı saydam SCN çekirdeğini gözlemleyerek SCN'yi tanımlayın.

Mikro elektrodu kayıt için hazırlamak için, bir mikro doldurma tüpü aracılığıyla dört milimetrelik bir şırınga filtresi ile filtrelenmiş kalsiyum probunu içeren dahili çözelti ile doldurun. Ardından mikro elektrodu mikro elektrot tutucusuna yerleştirin. Ardından, elektroda az miktarda sürekli pozitif basınç uygulayın.

Kırmızı ışık aydınlatmasının rehberliğinde mikro elektrodu kayıt odasına indirin. Ardından mikro elektrodu düşük güç hedefi kullanarak SCN'nin üzerine yerleştirin. Bundan sonra, SCN'nin bir alt bölgesini ve tek bir SCN nöronunu seçmek için mikroskobu yüksek güçlü bir büyütmeye geçirin.

Hücre yüzeyine ilerletilen mikro elektroda hafif pozitif basınç uygulamaya devam edin. Yüzeye çıktıktan sonra, üç ila 10 giga ohm dirençli bir conta oluşturmak için hafif negatif basınç uygulayın. Bundan sonra, membran voltajını eksi 60 milivolta ayarlayın.

Daha sonra, tüm hücre yaması klemplemesini oluşturmak için hücre zarını yırtmak için elektroda ek negatif basınç uygulayın. Tüm hücre moduna girdikten sonra, SCN nöron soma ve dendritler floresan prob ile doldurulacaktır. Membran voltajını akım kelepçesi modunda veya akımı voltaj kelepçesi modunda ölçün.

Kalsiyum prob görüntü verileri izlenirken ve saklanırken, elde edilen görüntüler 340 nanometre ve 380 nanometre oranlı floresan verilerinin bir grafiği ile birlikte görüntülenebilir. Deney sırasında, SCN'yi hızlı bir şekilde UV ışığına maruz bırakarak kalsiyum ölçümlerini kantitatif olarak elde etmek için bir mono kronometre kullanılır. 340 nanometre ve 380 nanometrede, uyarma ışığı, harmonik dalga boylarını 400 nanometrenin üzerinde kısıtlamak için bir UG 11 optik filtreden geçer ve 400 nanometre DCLP dikroik ayna ışığı dokuya yansıtır.

Yayılan ışık 510 nanometrelik bir emisyon filtresinden geçer ve kamera tarafından yakalanır. Sonucu analiz etmek için, ilk görüntüden bir ilgi alanı ve göreceli floresan yoğunluk birimlerine dönüştürülecek bir arka plan bölgesi seçin. İlgilenilen bölge verileri, deney sırasında gerçek zamanlı olarak görülür.

Arka plan daha sonra sonraki veri analizinde kullanılır. İşte SCN ve optik kiazma içeren bir koronal hipotalamus diliminin parlak bir alan görüntüsü. BISRA iki içeren iç çözelti ile doldurulmuş bir cam mikro elektrot, tek bir nöron üzerine mühürlenir.

Burada, voltajla kenetlenmiş bir SCN nöronundan kaydedilen bir dizi 50 voltaj adımına kalsiyum yanıtları gösterilmektedir. Voltaj kapılı sodyum akımları 0.5 mikromolar TTX ile inhibe edildi ve bu, kalsiyum yanıtlarına karşılık gelen somatik ve dendritik bölgelerin bir ekran görüntüsü görüntüsüdür. Bunlar, değişken sayıda voltaj adımına kalsiyum tepkilerinin örnekleridir.

Bu şekil, zar voltajının ve hücre içi kalsiyumun aynı anda kaydedilmesini göstermektedir. Bir SCN nöronunda, akım klempi deneyi 50 mikromolar ritoksin varlığında gerçekleştirildi. Membran potansiyelinin küçük bir depolarizasyonu, birkaç etki nöbetini, karşılık gelen bir yükselme ve ardından hücre içi kalsiyumun düşmesi ile potansiyel ateşlemeyi tetikledi.

Bu videoyu izledikten sonra, sağlıklı supra kozmetik çekirdek beyin dilimlerinin nasıl hazırlanacağını ve eş zamanlı elektrofizyolojik ve görüntüleme deneylerinin nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız. Ultraviyole ışıkla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun göz koruması takmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.