Toplayıcılık Davranış için Tek-sinek Deneyi Drosophila

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin sinek Salala Melanogaster'de gıda yoksunluğunun tetiklediği davranış değişikliklerini ölçmektir. Bu, 18 ila 24 saat boyunca açlıktan ölen ilk sinekler tarafından gerçekleştirilir. İkinci adım, her biri merkezinde çekici bir koku kaynağı içeren davranış odalarına tek tek sinekleri yüklemektir.

Daha sonra, dijital kameralı bir bilgisayar sistemi, her bir sineğin zaman içindeki konumunu izler ve kaydeder. Daha sonra veri analizi için koordinatları. Son adım, özel yazılım kullanarak koku kaynağına ulaşmak için her sineğin gecikme süresini belirlemektir.

Sonuç olarak, bu yüksek verimli gıda arama davranışı testi, nöral devre işlevi ve davranışsal tepkiler arasındaki ilişkiyi incelemek için kullanılabilir. Bu testin takım arkadaşları gibi mevcut yönteme göre en büyük avantajı, tek sineklerde kemotaktik davranışı ölçmesidir. Bu yöntem, nörobiyolojide hangi nöro devrelerin kemotaktik davranış için önemli olduğu ve bu nöro devrelerin hayvanın iç fizyolojik durumu tarafından nasıl yönetildiği gibi soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Bu yöntemin amacı, kısa sürede büyük davranış veri setleri elde etmektir. Bu yöntem bize yiyecek arama davranışı hakkında fikir vermiş olsa da, lokalizasyon yapmak gibi diğer davranışları incelemek için de kullanılabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.

Sineklerin uygun şekilde ele alınması ve bilgisayar yazılımının yürütülmesi, bu deneyin başarısı için çok önemlidir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bir kişi, başlangıçta biraz mücadele edebilir, çünkü sineklerin nazikçe nasıl ele alınacağını öğrenmek biraz zaman ve sabır gerektirir, bu da prosedürün iğne olacağını gösterir. Laboratuvarım için bir teknisyene ulaşın Uçmadan önce toplama.

Deney sineklerini 12 saatlik aydınlık karanlık döngüde kontrollü sıcaklık ve nem koşulları altında geri çekin. EEC patlamasının olduğu gün, sinekleri mikroskop altında cinsiyetlendirmeden önce karbondioksit altında uyuşturun. Erkekler ve kadınlar arasında ayrım yapmak için birkaç temel kriter kullanılabilir.

Erkeklerin dört bacağında, dişilerin sahip olmadığı seks tarağı adı verilen bir siyah kıl yaması vardır. Ayrıca, erkek karnının ucu koyu bir kütikül ile kaplıdır ve dişilerde görülmeyen genital organlar görüntülenir, dişi sinekleri toplayın ve onları dört ila beş beyaz gözlü erkekle birlikte flakon yaşı başına en fazla 30 sinek olacak şekilde yeni yiyecek dosyalarına yerleştirin. İki ila beş gün boyunca sinekler, önce tek bir dokuyu boş bir plastik şişenin dibine iterek odaları sinek açlığına hazırlar, dokuyu tamamen damıtılmış suyla ıslatılır.

Ardından dokuyu aşağı doğru itmek için bir nesne kullanın ve fazla suyu nazikçe sıkın. Fazla suyu atmak için şişeyi ters çevirin. Sinekleri nemli tutmak için yeterli su olmalı ve açlık odasını nemli tutmalı, ancak sinekleri boğmak için yeterli olmamalıdır.

Deney başlamadan yaklaşık 18 ila 24 saat önce, sinekleri gıda şişesinden bir açlık odasına aktarın ve şişeyi tıkayın. Şişeleri deney başlayana kadar gece boyunca kontrollü sıcaklık ve nem koşullarında saklayın. 10 mililitre damıtılmış suya 100 miligram düşük erime sıcaklığı aros ekleyerek% 1'lik bir tarımsal çözelti hazırlayın.

Bir cam şişede. Agro çözeltiyi kaynamaya başlayana kadar bir mikrodalgada ısıtın, ancak kaynamadan önce mikrodalgayı durdurun ve şişeyi bir kez döndürün. Aros tamamen eriyene kadar bu adımı iki kez daha tekrarlayın.

Şişeyi sıcak bir plaka üzerinde sıcak tutarak Aros çözeltisini sıvı halde tutun. 50 santigrat dereceye ayarlayın, 1,5 mililitrelik bir DF tüpüne 990 mikrolitre% 1 aro çözeltisi ve 10 mikrolitre elma sirkesi ekleyin. % 1'lik bir elma sirkesi çözeltisi yapmak için, 50 santigrat dereceye ayarlanmış kuru bir banyo inkübatörüne yerleştirmeden önce çözeltiyi karışana kadar girdaplayın, test odasını sıcaklık ve nem gibi istenen koşullara ayarlayın.

660 nanometre LED panelini açın. Elekleri ve test plakalarını sıcak suyla durulayın ve tüm nem buharlaşana kadar bir kurutma fırınında ısıtın. Serin. Elekler ve plakalar test odası sıcaklığına kadar iner.

Deneylere başlamadan önce, difüzör plakasının üzerine sığ bir tabak yerleştirin ve yerel nemi artırmak ve aros damlacıkındaki suyu maskelemek için suyla doldurun. Son olarak, elekleri su kabının üzerine yerleştirin. Test plakası şeffaf akrilikten yapılmıştır ve altı test alanından oluşur.

Bir kaydırıcı, sinek yüklemesine, geçici olarak muhafaza edilmesine ve altı sineğin aynı anda kendi odalarına bırakılmasına izin veren tutma odaları içerir. Deneyin başlangıcında, plakadaki her arenanın ortasına kazınmış artı işaretleri, koku maddelerinin pipetlenmesi gerektiğini gösterir. Kaydırıcıları akrilik test plakasına yerleştirin.

Aspiratörü yavaşça flakonun içine kaydırın, pamuk tapasını geçin ve yaklaşık altı sineğin aspiratöre girmesine izin verin. Onları kullanırken mümkün olduğunca nazik olmak çok önemlidir. Fotoğraf taktiğinden, sinekleri teşvik etmek için sinek davranışından, flakon açıklığını loş bir ışık kaynağına doğru işaret ederek aspiratöre doğru yürümekten yararlanılabilir.

Gerekirse, yaklaşık altı dişi sineği aspire etmek için hafif emme uygulanabilir. Beyaz gözlü erkek sinekleri seçmekten kaçının. Aspiratörün ucunu test plakasının ilk deliğine yerleştirin.

Tek bir sineğin tutma hücresine geçmesine izin verin ve bir sonraki deliğe başka bir sinek yüklemek için kaydırıcıyı yavaşça ileri doğru ilerletin. Sinekler kadar devam edin. Plakanın altı tutma hücresini de işgal edin.

Ardından% 1'lik bir elma sirkesi agarro çözeltisinden beş mikrolitreyi doğrudan test plakasının iç yüzündeki artı işaretlerinin ortasına pipetleyin. Test plakasını ortalamak için Konumlandırma aracı vi adlı dosyayı açın. Ekranın sol üst köşesindeki beyaz oka tıklayarak dosyayı çalıştırın.

Test plakasını, arena açıklığı SIV zemine bakacak ve koku hedefi plakanın tavanında olacak şekilde sibin üzerine yerleştirin. Hizalama tamamlandığında, test plakasının artı işaretlerini monitör ekranındaki çapraz hava koşullarıyla hizalayın. Sineğin koordinatlarını izlemek ve kaydetmek için monitörün sol üst köşesine yakın bir yerde bulunan kırmızı noktaya tıklayarak yürütmeyi durdurun.

Her yiyecek arama denemesi sırasında, edinme yazılım dosyasını açın. Fly izleme altı vi. Monitörün sol üst köşesindeki beyaz oka tıklayarak dosyayı çalıştırın.

Dosyaya bir ad atayın ve Tamam'ı tıklatın. Sinekleri test alanlarına salmak için test odalarındaki kaydırıcıları ilerletin. Koordinatların yanlış kaydedilmesine yol açacağından test odalarını hareket ettirmemeye dikkat edin.

Başlat'a tıklayın ve test odasındaki tek ışık kaynağının LED panel olduğundan emin olun. Deneme bittiğinde süzgeci ve davranış haznesini çıkarın. Test plakasını elekten kaldırın ve plakayı buza batırarak sinekleri çıkarın.

Plakayı sıcak suyla nazikçe temizleyin ve tarım kalıntılarını temizleyin. Nemi gidermek için test plakalarını bir kurutma fırınına yerleştirin. Küçük bir fanı yaklaşık iki dakika boyunca açarak test alanını havalandırın.

Fanı kapatın ve bir sonraki sinek grubunu bir sonraki test plakasına yükleyin. Metin protokolünde açıklandığı gibi özel yazılım kullanarak veri analizi yapmaya devam edin. Veri analiz yazılımı ve düzeni, her bir sineğin 10 dakikalık deneme süresi boyunca performansını bir dizi analiz kriterine göre değerlendirmek için kullanılır.

Bu kriterler, her bir sinekten elde edilen verilerin veri analizi için kullanılıp kullanılmayacağını belirlemek için kullanılır ve yaralanma, hastalık, stres veya motivasyon eksikliği nedeniyle yiyecek arama görevini yerine getiremeyen sinekleri ortadan kaldırmak için tasarlanmıştır, 300 saniyeden fazla hareketsiz kalan sinekler inaktif olarak kabul edilir ve gıda kaynağını veya sergisini bulmayı başaramadıkları sürece veri setinden reddedilir. Yalnızca aktif kokunun erken aşamalarında sağlıklı hızlar sergileyen sinekleri seçmek için aktif olmayan dönemi takip eden en az 100 saniye boyunca saniyede 10 milimetreden daha yüksek bir ortalama hız. Arama Yalnızca denemenin ilk 50 saniyesi boyunca belirli bir hız aralığında hareket eden sinekler, arenadaki dört kadranın tamamından geçmeyen ve deneme başladıktan sonra doğrudan besin kaynağına yönelen sinekler veri analizi için kabul edilir.

En az 50 saniye boyunca 10 milimetrelik bir yarıçap içinde besin kaynağına doğru ve ondan uzaklaşan sineklerin besin kaynağını başarıyla bulduğu kabul edilir. Sineğin zaman içinde koku kaynağından uzaklığını gösteren çizim, bu nadir vakayı, sinek pozisyonunda görünür eserlerle değerlendirmek için kullanılabilir. İzleme de reddedilir.

Eserler, veri toplama yazılımının sinek dışında bir nesne algıladığı herhangi bir olay tarafından oluşturulabilir. Genellikle arena boyunca uzanan veya merkezinden yayılan uzun düz çizgiler olarak görünürler. 18 ila 24 saat aç kalan yetişkin sinekler, gıda ile ilgili kokulara karşı beslenen muadillerine göre daha yüksek koku alma hassasiyeti sergiler.

Bir yiyecek kokusu kaynağını başarılı bir şekilde bulan sineklerin kümülatif yüzdesinin grafiksel bir grafiği, aç bırakılan tüm sineklerin %30'unun 10 dakikalık bir süre içinde başarılı olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, beslenen tüm sineklerin sadece% 7'si bunu yapar. Aç sinekler, sirkeye tek başına bir agros aracından çok daha fazla ilgi göstermelidir ve bu gözlem, test koşullarını gidermek için kullanılabilir.

Örneğin, 32 santigrat derecede% 35'lik bir çevresel nem ile yabani tip sinekler kullanılarak gerçekleştirilen bu gıda arama deneyi, sirkeye sinek çekimi ile aros kontrolü arasında önemli bir fark tespit edilmedi, bu muhtemelen daha sıcak test sıcaklıkları altında agros damlacıkında bulunan suya artan bir çekimden kaynaklanmaktadır. Test nemini %50 ila %60 arasına çıkararak bu davranış değişikliği düzeltildi ve sirke ile agros aracına olan ilgi arasındaki önemli fark eski haline getirildi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse 10 dakikalık deneysel deneme de dahil olmak üzere 12'de gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü denerken, onları yaralamaktan veya rahatsız etmekten kaçınmak için sinekleri çok nazikçe tutmayı unutmamak önemlidir. Lütfen test plakalarının ve eleklerin kurutma fırınındayken aşırı sıcak olabileceğini ve bu nedenle geliştirildikten sonra fırın eldiveni giyilirken çıkarılmaları gerektiğini unutmayın. Bu teknik, nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların kemotaktik davranışları keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu teknik, sineğin diğer koku nesnelerini bulma yeteneğini incelemek için de uyarlanabilir. Örneğin, erkek sineklerde eş lokalizasyon davranışının incelenmesine uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, deneye nasıl hazırlanacağınız, deney koşullarını nasıl ayarlayacağınız, deneyi nasıl çalıştıracağınız ve her bir sineğin performansını nasıl analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız, bu da sonuçta size koku kaynağını başarıyla bulan sineklerin yüzdesini gösteren kümülatif bir çizim sağlayacaktır.