Name: Membran-OMURGA: Membran Proteinleri protein-protein etkileşimleri belirlemek için bir Biyokimyasal Aracı In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Öğrenin membran proteinlerinin in vivo protein-protein etkileşimlerini belirlemek için çapraz bağlama, afinite saflaştırma ve kütle spektrometrisi yöntemlerini. Bu teknik düşük afiniteli geçici etkileşimleri tespit eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma SH Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 ve SFB940 hibeler ile desteklenmiştir

Not: protokolde belirtilen tamponlar ile ilgili detaylı bilgiler Tablo 1&#39;de kullanılabilir. 1.. Formaldehit Yaşayan hücreler içinde Çapraz bağlama ile protein-protein etkileşimleri Fixation <ol><li> Büyüme ortamı, stok çözümleri ve tampon P1 hazırlamak başlamak için <ol><li> 500 ml ortam hazırlayın: orta yem zar proteini ve av proteinleri arasındaki etkileşimi destek koşulları sağlamalıdır. Buna ek olarak, bir deney bir etkileşim (çapraz bağlanması olmayan, örneğin) beklenen koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Not: stresli olan ve olmayan stresli bakterilerde protein-protein etkileşimleri karşılaştırın. Bu nedenle, bir 2 L Erlenmeyer şişesi içinde stres yaratıcı bir madde (örneğin, 0.5 M NaCI) ile tamamlamak 500 ml Luria Bertani (LB) ortamı (Tablo 1) hazırlanması. Kontrolü için, 0.17 M NaCl (pH 7.0) normal LB ortamını kullanın. </li><li> Tris-tamponu hazırlayın (20 mM Tris-HCl, pH 8.0) ve 0.1 M etilendiamin tetraasetik asit (EDTA), pH 8.0 stok çözeltisi (Tablo 1). </li><li> Tampon P1 hazırlayın. Tris-tampon maddesi içinde 0.5 M bir son konsantrasyona kadar sakroz çözülür. Süzme ile sterilize tampon P1 ve 4 ° C&#39;de saklayın </li></ol></li><li> Bir vektör bir C-terminal Strep-eklentisi füzyonu ile yem zar proteini sentezleyen hücrelerin büyümesine. Yeterli bir süre için yem zar proteinlerinin ifadesini teşvik eder. Not: Bu 500 ml ortam için 250 ul 1 M izopropil-β-D-tiogalaktopiranosid (IPTG) eklenmesi ile erken-log fazında (A 600 = 0.3) de (nihai konsantrasyon: 0.5 mM), bakteriyel yem zar proteinlerinin sentezlenmesini uyaran . Yeterli ifadesine olanak tanımak için, geç log fazında (A 600 = 1.2) kadar bakteri inkübe edin. </li><li> 300 ml&#39;lik bir minimum hacimde her iki kültür santrifüj bardak hazırla ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> Formaldehit çapraz bağlanmasını gerçekleştirmek. CAUDOĞRULANAMADI: Formaldehit son derece toksik Biz güvenlik davlumbaz altında çalışmanızı öneririz.. <ol><li> Bir güvenlik davlumbaz altında kültür damarı aktarın. (- X) ve çapraz bağlama formaldehid (+ X) da dahil olmak üzere bir iki numune, çapraz-bağlama atlama içine her bir örnek ayrıldı. % 0.6 &#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere 250 ml kültüre 4 ml% 37 formaldehit çözeltisi ekleyin. </li></ol></li><li> Geri kültür damarları transferi ve daha önce olduğu gibi 20 dakika daha hücreler büyür. </li><li> Bir güvenlik davlumbaz altında santrifüj tüplerine içine kültürleri doldurun. 30 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplayın. </li><li> Dikkatli bir güvenlik davlumbaz altında yukarı pipetleme süpernatant atın. Toksik formaldehit içeren süpernatant toplayın ve uygun şekilde atın. </li><li> Membran proteini hazırlanması sırasında en iyi verimi ulaşmak için, ilk olarak spheroplastlar hazırlar. Burada, Gram-negatif bakterilerin sferoplast oluşumu için bir protokol sağlar: <ol><li> Prepare tampon P2 (Tablo 1) liyofilize toz. Yavaşça, 1.5 ml bir tüp içinde, 0.1 M EDTA, pH 8 içinde 2 mg lizozim çözülür. Her deney günü için taze tampon P2 hazırlar. </li><li> Proteaz inhibitörü (tampon P3) ile Tris-tamponu hazırlayın. Tris-tampon maddesi içinde 10 ml&#39;lik, 10 mM&#39;lik bir son konsantrasyona değin 0.1 ml 1 M fenilmetilsülfonilflüorür (PMSF) (Tablo 1) ekleyin. Proteaz inhibitörü olarak PMSF düzgün çalışmasını sağlamak için, hemen tampon kullanın. </li><li> Proteaz inhibitörü ve bir 15 ml konik tüp transfer çözeltisi ile 10 ml Tris-tampon maddesi içinde yeniden süspanse hücre topakları. </li><li> 1 ml tampon P2 ilave edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> 30 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile spheroplastlar toplayın ve dikkatli bir şekilde supernatant atın. </li></ol></li><li> -20 ° C de bir gece inkübe sferoplast granül </li></ol> 2. Strep-eklentisi Membran protein saflaştırılması (yem) <ol><li> Buz üzerinde sferoplast pelet yerleştirin. &lt;/ Li&gt; <li> Sferoplast pelet, buz üzerinde çözülme süre boyunca, her bir sferoplast hazırlanması için, 10 ml tampon P3 hazırlar. Yavaşça 10 ml Tris-tampon maddesi içinde 1 mg DNaseI çözülür. Kullanımdan hemen önce 0.1 ml 1 M PMSF ekleyin. </li><li> 6 ml taze hazırlanmış P3 pelet tekrar. Spheroplastlar engellemek amacıyla, her bir patlama ile 1 dakika duraklama ile buz üzerinde sürekli olarak 1 dakika boyunca bir numune dört kez sonikasyon. </li><li> Hasat hücre artıkları için 10 dakika 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin örnek. Ultrasantrifüj işlemi, tüp, bir pipet kullanılarak süpernatan aktarın. </li><li> 30 dakika boyunca 100,000 x g&#39;de membran fraksiyonu Pelet. Çözündürülerek olmadan Tris-tampon maddesi içinde dikkatli bir şekilde pelet yıkayın. Bir ince kağıt (örneğin, Kleenex) ile tüp kurutun. Herhangi bir zamanda pelet rahatsız kaçının. </li><li> 1 ml Tris-tampon maddesi içinde dikkatli bir pelet (= zar) yeniden süspanse edin. Örneğin, BCA analizi ile protein konsantrasyonunu belirlemek için, 20 ul bir kısım kullanın. Bu adımda, membranlar şok li dondurulabilirsterlin azot ve -80 ° C&#39;de saklandı </li></ol> 3. Strep-eklentisi Membran yem Protein ve SDS-PAGE ile saflaştırılması <ol><li> Tris-tamponu ile 5 mg / ml membran fraksiyonunun konsantrasyonu protein normalize. Ultrasantrifüj işlemi bir tüp içinde 2.5 ml membran fraksiyonu (5 mg / ml) alın ve zar proteinleri çözündürülmesi amacıyla,% 2&#39;lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için% 20 Triton X-100 ve 0.25 ml ekleyin. Bir mikro-manyetik çubuk ilave edilir ve 1 saat boyunca buz üzerinde karıştırılmıştır. Not: genel olarak, deterjan olarak Triton X-100 kullanılarak iyi sonuçlar vermesine rağmen, bu optimizasyonu için deterjan değiştirmek için yararlı olabilir. Bu bağlamda, ilgili yem zar proteininin fonksiyonel saflaştırılması için kullanılan deterjan ile en iyi sonuçları vardır. </li><li> Adım 3.1 yerine getirirken, 50 ml (Tablo 1) W ve 5 ml tampon E tampon hazırlar. 10 ml 5x tampon W konsantre ml 50 kadar doldurun ve 150 ul% 20 Triton X-100 ekleyin. <ol><li> 1 ml 5x Buffe doldurunr E 10 ml&#39;ye konsantre ve 30 ul% 20 Triton X-100 ilave edin. 8 ml tampon W ile bir 1 ml Strep-taktin superflow yerçekimi akışlı sütuna Denge Not: Bu saflaştırma işlemi sırasında herhangi bir tampon maddesi içinde kritik misel konsantrasyonunun (cmc) üstünde bir konsantrasyonu, 10-kat içinde çözündürme için kullanılan deterjan eklemek için gereklidir. </li></ol></li><li> Çözünmeyen membran fraksiyonu pelet haline getirmek üzere, 30 dakika boyunca 100,000 x g&#39;de çözündürme örnek ve ultrasantrifuju gelen mikro-manyetik çubuk çıkarın. Daha fazla saflaştırma için bir pipet kullanılarak süpernatantı. </li><li> Kolona süpernatant yerleştirin. Sadece yerçekimi akışı ile sütun çalıştırın. Bu yıkama adımı 5x tekrar 5 ml tampon W. ile sütun yıkayın. </li><li> Bu yıkama adımı 4x tekrarlayın 1 ml tampon E. ile membran yem proteinleri Zehir. </li><li> Bir santrifüj filtre birimi ile elüsyon fraksiyonları 2, 3, ve 4-300 ul konsantre edin. </li><li> 50 ul 5x SDS-PAG ile her bir numunenin 200 ul karıştırınE yükleme boyası. 125 ul hacimde her hazırlık ayrıldı. Formaldehit çapraz bağlantıları tersine çevirmek için, 95 ° C&#39;de 20 dakika boyunca her bir preparasyonun bir kısım kaynatın. Numuneler tezgah üstünde en az 10 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li><li> Immunoblotting için uygun olan bir poliakrilamid jel tek bir şerit için yük Her bir numune, 30 ul. Iyi yönlendirme için bir Prestained molekül ağırlığı bir kalem kullanın ve SDS-PAGE 10 çalıştırın. </li></ol> 4. İmmünoblot Analizi Etkileşim Ortaklar Onayla <ol><li> Bir kez, örneğin 3,8 ile yan-kuru bir nitroselüloz zara transfer proteinleri aşama tamamlanır. </li><li> Spesifik etiketleme önlemek için membran engelleyin. % 0.05 Tween-20 (TBS-T) son bir konsantrasyon ile takviye edilmiş Tris-tamponlu tuzlu su içinde hacim başına% 3 ağırlık elde etmek sığır serum albümini (BSA) tartı ile blokaj tamponu hazırlayın. Membran karşılamak için blokaj tamponu yeterli bir hacmi kullanın. Oda sıcaklığında 1 saat için bloke membran. </li><li> Seyreltiknd zamanki gibi av proteini spesifik bir ilk antikor kuluçkaya yatmaktadır. İkinci antikor olarak bir HRP-bağlı antikor kullanarak. </li><li> Yüksek hassasiyet ile bir kemilüminesan algılama kiti kullanılarak immüno geliştirin. Klasik bir film işleme yordamı veya dijital görüntüleme ekipmanı kullanarak sinyalini izleyin. </li></ol> 5. Etkileşim Ortaklar tanımak NanoLC-ESI-MS/MS Yüksek Çözünürlük Deneyleri <ol><li> Belirlenmelidir özel bir antikor, av proteini ya da bilinmeyen bir etkileşim ortakları için kullanılabilir durumda, tanımlama için kütle spektrometresi (MS) kullanılır. Keratin kirlenmesini önlemek amacıyla, protein ayrılması için precasted jelleri kullanın. </li><li> Gümüş, üreticinin protokolüne göre, bir MS-uyumlu bir boyama kiti kullanılarak SDS-PAGE leke. Cam tanklarda tüm boyama ve yıkama adımları gerçekleştirin. </li><li> Tüketim ilgili bantları ve yüksek çözünürlüklü LC / MS 9 bu analiz. </li></ol>

<ol><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model%3A+application+to+complete+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).</li>
<li>Bakheet, T. M., Doig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+identification+of+human+protein+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Properties and identification of human protein drug targets.</a> Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).</li>
<li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-target+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Drug-target network.</a> Nat. Biotechnol. 25, (2007).</li>
<li>Daley, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly+of+membrane+proteins+into+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly of membrane proteins into complexes.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).</li>
<li>Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histidine+kinases+and+response+regulators+in+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Histidine kinases and response regulators in networks.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).</li>
<li>Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-SPINE%3A+An+improved+method+to+identify+protein-protein+interaction+partners+of+membrane+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo.</a> Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).</li>
<li>Herzberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPINE%3A+A+method+for+the+rapid+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo.</a> Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).</li>
<li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).</li>
<li>Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+protein+identification+by+tandem+mass+spectrometry%3A+Issues+and+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies.</a> Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+by+the+Cpx-envelope+stress+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Signal integration by the Cpx-envelope stress system.</a> FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).</li>
<li>Weber, R. F., Silverman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cpx+proteins+of+Escherichia+coli+K12+%3A+Structure+of+the+CpxA+polypeptide+as+an+inner+membrane+component%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component.</a> J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Membran OMURGA analiz onaylamak ve membran proteinlerinin bu noktada bilinmeyen bir etkileşim ortakları tanımlamak için birini sağlayan biyokimyasal bir yaklaşımdır. Membran OMURGA bir Strep-etiketli yem zar proteini saflaştırılması ile formaldehid ile çapraz bağlanması vivo olarak bir araya getirmektedir. Immüno-lekeleme ile kombinasyon tahmin etkileşim ortaklarının onay (Şekil 2) kolaylaştırır. Buna ek olarak, MS analizi ile kombine bilinmeyen etkileşim ortaklarının kimlik (Şekil 3)</...

Bir proteinin işlevini anlamak için onun etkileşim ortaklarını bilmek önemlidir. Çeşitli klasik teknikler çözünür proteinlerin etkileşimi ortaklarının tespiti için kullanılabilir. Ancak, bu teknikler, hidrofobik doğası 4 dolayı zar proteinleri kolaylıkla transfer edilemez. Bu sınırlamayı aşmak için, Membran Strep-protein etkileşim deneyi (Membran-OMURGA) 6 geliştirdik. Bu çözünür proteinler 7 için uygundur olan OMURGA yöntemine dayanmaktadır. Çapraz bağlama maddesi, iki formaldehid avantajlarından zara OMUR faydaları: ilk olarak, formaldehit kolayca nüfuz membranlar ve bu nedenle, bir canlı hücrenin 8&#39;in interactome kesin bir görüntüsünü oluşturur olabilir. İkincisi, formaldehit çapraz bağlantılar 9 kaynatılarak ters olabilir. Burada, bu iki avantajı zar prote sürekli değil, aynı zamanda geçici bir PPI, sadece tanımlamak için kullanılırins 6. Kısaca, Strep-eklentisi, integral zar yem proteinin C-ucuna kaynaştırılır. Membran yem proteini eksprese eden hücreler, çapraz bağlantıları membran proteinine yem proteinleri av formaldehid (Şekil 1) ile birlikte inkübe edilir. Av proteinleri modifikasyonları gerekli değildir. Daha sonra, membran fraksiyonu hazırlanır. Bu nedenle, membran proteinleri proteinleri afinite arıtma kullanarak av proteinleri ile birlikte saf hale deterjan tedavisi ve yem ile eritilir. Daha sonra, çapraz-link kaynatma ile tersine çevrilir ve yem ve eş-elüt av proteinler SDS-PAGE ile ayrılmıştır. Son olarak, av proteinleri bağışıklık beneklenme analizi veya kütle spektroskopisi ile tespit edilebilir.

<table><tbody><tr><td>% 37 Formaldehit</td><td>Roth</td><td>4979.1</td><td>Bir yıldan eski olmamalıdır</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein test kiti</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanyetik çubuk</td><td>Roth</td><td>0955.2</td><td>5 mm uzunluğunda, 2 mm çapında</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td>çözündürme</td></tr> <tr><td>için standart deterjann-Dodesil-&beta;-maltoside</td><td>Glycon</td><td>D97002-C</td><td>, CpxA'yı çözündürmek için en iyi deterjan</td></tr><tr><td>1 ml Strep-Tactin süper akışlı yerçekimi akış sütunu</td><td>IBA</td><td>2-1207-050</td><td></td></tr><tr><td>Strep-tag protein saflaştırma tampon seti</td><td>IBA</td><td>2-1002-001</td><td>Tampon W ve tampon E içerir</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 santrifüj filtre</td><td>Millipore UFC803024</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Kemilüminesan substrat</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>SilverQuest Silverstaining kiti</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>FireSilver Boyama</td><td>Kiti Proteom Fabrikası</td><td>PS-2001</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

membran-omurga: membran proteinleri protein-protein etkileşimleri belirlemek için bir biyokimyasal aracı in vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Zar proteinleri, hücre canlılığı için gerekli olan ve bu nedenle önemli bir terapötik hedef 1-3 bulunmaktadır. Bu kompleksler 4 işlev için, bunların etkileşimleri belirlemek ve karakterize etmek için yöntemler 5 gereklidir. Bu amaçla, biz Membran-OMURGA 6 denilen Membran Strep-protein etkileşim deney geliştirdi. Bu teknik, Strep-işaretli zar yem proteinin afinite saflaştırma ile geri dönüşümlü çapraz bağlayıcı formaldehit kullanılarak çapraz bağlama, in vivo olarak bir araya getirmektedir. İşlem sırasında, çapraz bağlanmış av proteinleri membran yem protein ile birlikte saf hale getirilir ve daha sonra kaynatılarak ayrılır. Membran omurga kullanılarak zar proteinlerinin protein-protein etkileşimleri (PPI) analiz Bu yüzden, iki ana görevleri icra edilebilir: ilk olarak, immün, tarafından önerilen bir etkileşim ortağının ikinci onay, kütle spektrometrisi analizi ile yeni etkileşim ortaklarının tespiti . Dahası, lafinite ow, geçici PPIs Bu teknik ile tespit edilebilir. Son olarak, Membran-OMURGA membran proteinlerinin PPI tanımlamak için güçlü bir tarama aracı olarak geçerli hale, hemen hemen herhangi bir hücre tipine uyarlanabilir.

Membran OMURGA analiz zar proteinlerinin ortak arıtma ve geçici olarak etkileşimli protein ortakları sağlar. Co-saflaştırma çapraz bağlama ajanı formaldehit kullanılarak elde edilir. Formaldehit konsantrasyonu ve çapraz bağlama süresi: İki parametre spesifik olmayan çapraz bağlantı engellemek için kritik öneme sahiptir. Formaldehid aşırı yeterli ama kullanımı kolay immunoblotting ile kontrol edilebilir. Formaldehit çapraz bağlanmış protein kompleksleri, SDS işlenerek kaynama değil ile ayrılabilir. Bu nedenle, bir unboil...

Bir yaklaşım, biyokimyasal zar proteinlerinin in vivo protein-protein etkileşimleri (PPI) tanımlamak için tarif edilmektedir. Yöntem, protein çapraz-bağlama, afinite arıtma ve kütle spektrometrisi birleştirir, ve hemen hemen herhangi bir hücre tipi ya da organizma için uyarlanabilir. Bu yaklaşımla, geçici PPI bile tespiti mümkün olur.

Membran-OMURGA: Membran Proteinleri protein-protein etkileşimleri belirlemek için bir Biyokimyasal Aracı In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Bu prosedürün genel amacı, bir membran streptokok protein etkileşimi deneyi veya membran omurgası yoluyla in vivo protein, membran proteinlerinin protein etkileşimlerini tanımlamaktır. Bu, formaldehit için ters çevrilebilir çapraz bağlayıcı kullanılarak in vivo çapraz bağlama ile gerçekleştirilir. İkinci adım, strept etiketli zar yem proteinini çapraz bağlı av proteinleri ile birlikte saflaştırmaktır.Daha sonra, çapraz bağ kaynatılarak tersine çevrilir. Son adım, membran yem proteininin ve birlikte saflaştırılmış av proteinlerinin sodyum do desal sülfat, poli akrilamid jel elektroforezi veya SDS sayfası ile ayrılmasıdır. Sonuç olarak, av proteinlerini tanımlamak için immünoblotlama ve kütle spektrometresi analizi kullanılır ve zar protein etkileşimlerinin analizine izin verir.Ben Sabina Hunka ve bugün size membran omurga teknolojisini göstereceğiz. Bu teknolojinin co IP gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, düşük afiniteli veya geçici protein protein etkileşimlerini bile tespit etmenize izin vermesidir. Kline Shaana size prosedürü gösterecek.Bu prosedüre başlamak için Protokolü geliştiren doktora öğrencimden biri, Membran yem proteinini bir C terminali strep tag füzyonu ile eksprese eden bakteri hücreleri, yeterli ekspresyona izin vermek için 500 mililitre ortama 0.5 milimolar IPTG ekleyerek erken log fazında membran yem proteinlerinin ekspresyonunu indükler. Bakterileri geç log fazına kadar inkübe edin. Formaldehitin toksisitesi nedeniyle bir güvenlik çeker ocak altında formaldehit çapraz bağlama yapmaya hazırlanın.Kültür kabını bir güvenlik çeker ocak altına aktarın. Her numuneyi, biri çapraz bağlamayı atlayan ve diğeri formaldehit çapraz bağlamayı içeren iki numuneye bölün. % 0.6'lık bir nihai konsantrasyona ulaşmak için 250 mililitrelik bir kültüre dört mililitre% 37 formaldehit çözeltisi ekleyin, kültür kaplarını geri aktarın ve hücreleri daha önce olduğu gibi 20 dakika daha büyütün.Daha sonra kültürleri bir güvenlik çeker ocak altında santrifüj tüplerine doldurun. Hücreleri 30 dakika boyunca 3000 kez G'de santrifüjleme ile toplayın. Süpernatanı önce boşaltarak ve ikinci olarak emerek çıkarın.Çeker ocak altında bir pipet kullanarak, süpernatan içeren toksik formaldehiti uygun şekilde atarak süpernatanları atın. Membran proteini hazırlığı sırasında optimum verime ulaşmak için, önce Sphero plakalarını hazırlayın, 1.5 mililitrelik bir tüpte 0.1 molar E-D-T-A-P-H sekizde iki miligram lizozimi nazikçe çözün. Deney günü taze yapılması gereken P iki tamponunu hazırlamak için.Resus, hücre peletlerini proteaz inhibitörü ile 10 mililitre taze hazırlanmış tris sükroz tamponu içinde askıya alır ve çözeltiyi 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarır. Bir mililitre tampon P iki ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Sphero plakalarını 30 dakika boyunca 3000 kez G'de santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın.Spheroplast peletlerini buz üzerinde çalışarak gece boyunca eksi 20 santigrat derecede dikkatlice inkübe edin. Resus, Sphero Plast damağını altı mililitre taze hazırlanmış tampon içinde süspanse eder. P üç.Numuneyi bir dakika boyunca dört kez sürekli olarak buz üzerinde sonikasyon yapın ve her patlama arasında bir dakikalık bir duraklama yapın. Spheroplast'ı bozmak için, santrifüjlemeyi takiben hücre kalıntılarını toplamak için numuneyi 10, 000 kez G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipet kullanarak bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın.Membran fraksiyonunu 30 dakika boyunca 100.000 kez G'de peletleyin. Peletleri 20 milimolar tris tampon pH sekizde çözmeden dikkatlice yıkayın. Ardından, peleti herhangi bir zamanda rahatsız etmekten kaçınan bir kağıt mendil içeren bir tüp sürün.Membranları içeren peleti yeniden süspanse etmek için, bir mililitre tris ekleyin, bir mikro manyetik çubuğu tamponlayın ve peleti kısmen bir saat boyunca buz üzerinde karıştırarak bir pipetle yeniden süspanse edin, protein Konsantrasyonunu belirlemek için 20 mikrolitrelik bir alikot kullanın. Membran fraksiyonunun protein konsantrasyonunu tris tampon pipeti ile mililitre başına beş miligrama normalleştirin, membran fraksiyonunun 2,5 mililitresini bir ultrasantrifüj tüpüne pipetleyin ve membran proteinlerini çözündürmek için% 2'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için 0,25 mililitre% 20 Triton X 100 ekleyin. Sonra bir mikro manyetik çubuk ekleyin ve bir saat boyunca buz üzerinde karıştırın.Bir mililitrelik strept aktin süper akışlı yerçekimi akış sütununu sekiz mililitre tamponla dengeleyin. W. Mikro manyetik çubuğu çözündürme örneğinden çıkarın ve çözünmeyen membran fraksiyonunu pelet yapmak için 30 dakika boyunca 100.000 kez G'de ultrasantrifüj edin, çalışma tamamlandıktan sonra bir pipet kullanarak doytu çıkarın. Daha fazla saflaştırma için, süpernatanı yerçekimi akışını kullanarak kolona uygulayın.Sütunu dört mililitre tampon W ile yıkayın Bu yıkama adımını beş kez tekrarlayın. Membran yem proteinlerini bir mililitre tampon E ile elute edin. Bu elüsyonu tekrarlayın. Dört kez adım atın, ima edilen fraksiyonları konsantre edin.Santrifüj filtre ünitesi ile iki, üç ve dört ila 300 mikrolitre. Her numuneden 200 mikrolitreyi 50 mikrolitre beş x ile DS sayfa yükleme boyası olarak karıştırın. Kaynatmadan önce her bir hazırlığı 125 mikrolitrelik alikotlara bölün.Formaldehit çapraz bağlarını tersine çevirmek için 95 santigrat derecede 20 dakika boyunca her preparatın bir alikotu. Numuneleri tezgahta en az 10 dakika oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Her numuneden 30 mikrolitreyi, immünoblolama için uygun bir poli akrilamid jelin tek bir şeridine yükleyin.En iyi oryantasyon için önceden boyanmış bir moleküler ağırlık işaretleyici kullanın ve proteinlerin bir nitroselüloz membrana aktarılmasını takiben DS sayfası olarak gerçekleştirin. Spesifik olmayan etiketlemeyi önlemek için zarı bir saat boyunca bloke edin. Oda sıcaklığında, av proteinine özgü birincil antikoru seyreltin ve inkübe edin.İkincil antikor olarak HRP'ye bağlı bir antikor kullanın ve yüksek hassasiyete sahip bir kemilüminesan tespit kiti kullanarak immünoblo lekeyi geliştirin. Klasik bir film işleme prosedürü veya dijital görüntüleme ekipmanı kullanarak sinyali izleyin. Av, protein veya bilinmeyen etkileşim için spesifik bir antikor mevcut değilse, ortaklar tanımlanmalıdır.Tanımlama için kütle spektrometresi veya MS kullanın. MS uyumlu bir boyama kiti kullanarak SDS sayfasını gümüş lekeleyin. Üreticinin protokolüne göre, tüm boyama ve yıkama adımlarını cam tanklarda gerçekleştirin.Yem Proteini olarak yüksek çözünürlüklü LCMS ile analiz etmeden önce ilgili bantları kesin. VISIA coli'nin integral membran proteini CPXA'sı kullanıldı. CPXA bir sensör kinazdır ve büyük bir ekstra sitoplazmik sensör alanını ve yüksek oranda korunmuş sitoplazmik katalitik alanı entegre eden iki transmembran alanına sahip bir N terminal sensör alanından oluşur.Stimülasyondan sonra, CPXA aynı kökenli yanıt regülatörünü aktive eder, CPXR ile aktive edilmiş CPXR, membran omurgası için yanıta aracılık etmek için yayılır. Strep etiketi, CPX'in C terminaline kaynaştırıldı. Bir membran omurga analizi, CPXA streptokok'un, açıklanmamış formaldehit ile muamele edilmiş numunede bir yayma ile gösterilen diğer proteinlere veya protein komplekslerine çapraz bağlı olduğunu ortaya koymaktadır.Formaldehit tedavisi olmadan bu smear yoktur. Ayrıca, CPXA streptokok'un av proteini olarak eş kökenli yanıt düzenleyici proteini CPXR ile doğrudan bir protein proteini etkileşimi, yalnızca formaldehit varlığında tespit edilebilir. Gümüş boyama ile formaldehit çapraz bağlamanın özgüllüğünü desteklemek.Haşlanmış numune için özel bir bant belirgindir. Ok, MS tarafından analiz edilen bir bandı işaretler. Analiz ve CPXR'yi CPXA'nın etkileşim ortağı olarak doğruladı. Bu videoyu izledikten sonra, membran Proteinlerinin etkileşim ortaklarını belirlemek için kütle spektrometresinde pro ve çapraz bağlama afinite saflaştırmasının nasıl birleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.

membrane-spine-biochemical-tool-to-identify-protein-protein

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video kullanımı ile mikro-desenli yüzeyler, protein-protein etkileşimleri sonraki analizi ile deneyler gösterir. Bu yaklaşım, canlı hücreler protein etkileşimleri tespit etmek imkanı sunar ve kantitatif bilgileri ayıklamak imkanı ile yüksek verimlilik özellikleri bir araya getiriyor.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Test protein-protein etkileşim protein işlevsellik diseksiyon için vazgeçilmezdir. Burada, bir...

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) gerçek zamanlı biyomoleküler etkileşimlerini tespit etmek için bir etiket içermeyen bir yöntemdir. Burada, bir membran proteini için bir protokol: tekniğin artılarını ve eksilerini tartışırken reseptör etkileşimi deney, tarif edilmektedir.

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Burada, canlı hücrelerdeki integral zar proteinlerinin oryantasyonunu ve topolojisini belirlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu basit protokol, ilgilenilen protein ile GFP arasındaki kimeraların seçici proteaz duyarlılığına dayanır.

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

Birçok protein, zar yüzeylerine bağlandığında işlevlerini yerine getirir. Ekstrinsik proteinlerin nanodisk membranları üzerindeki bağlanması, transmisyon elektron mikroskobu ile dolaylı olarak görüntülenebilir. Negatif leke sodyum fosfotungstat tarafından indüklenen nanodisklerin karakteristik istiflenmesinin (rouleau), ekstrinsik proteinin bağlanmasıyla önlendiğini gösteriyoruz.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz.

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Burada, kütle spektrometresi için numunelerin hazırlanması için bir on-membran sindirim tekniği için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Burada, elektron mikroskopisi ile birlikte yerli hücreli membran nanopartikül sistemini kullanan membran proteinlerinin oligomerik durumunun belirlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Bu çalışma, membran proteini TWIK ile ilişkili asite duyarlı K+ kanal 2'nin (Görev 2) nanodisklere yeniden yapılandırılması prosedürünü özetlemektedir. Başarılı montaj, iyi tanımlanmış iki boyutlu sınıf ortalamaları elde eden tek parçacıklı kriyoelektron mikroskopi ile doğrulandı.

Nanodisklerde Membran Proteinlerini Stabilize Etme Tekniği

Öğrenin membran proteinlerinin in vivo protein-protein etkileşimlerini belirlemek için çapraz bağlama, afinite saflaştırma ve kütle spektrometrisi yöntemlerini. Bu teknik düşük afiniteli geçici etkileşimleri tespit eder.

Membran-OMURGA: Membran Proteinleri protein-protein etkileşimleri belirlemek için bir Biyokimyasal Aracı In Vivo

Daha fazla video keşfet