Name: Maya lüminometrik ve Xenopus Yumurta Elektrofizyolojik Sınavları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-31T13:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Öğrenin TRPV4 iyon kanalının mekanosensitivitesini maya lüminometri ve Xenopus oosit elektrofizyolojisi ile incelemeyi. Bu yöntemler kanal fonksiyonunu nicel olarak değerlendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz mükemmel teknik yardım için Andrea Kremsreiter teşekkür etmek istiyorum. Madison - Laboratuvarımızda çalışma NIH GM096088 ve Wisconsin Üniversitesi Vilas Trust tarafından desteklenmektedir.

1.. Maya luminometri Yöntemleri Saccharomyces cerevisiae suşu BYYT kullanın. Bu BY4741 (mata, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4) bir yvc1-tok1-türevidir. Batiza et al. 26 ve Loukin et al. 24 de tarif edildiği gibi, leu-seçilebilir aequorin-sentezleyen plasmid pEVP1/Aeq ve ura-seçilebilir rat-TRPV4 ifade eden plazmid ile p416GPDV4 hücrelerini dönüştürmek plasmid yapımı ve dönüşüm 27 kullanılması için standart yöntemler . Maya suşu ve plazmalar istek üzerine mevcuttur. <ol><li> Gece boyunca 1 M sorbitol ile takviye leu-ura-&quot;DCD&quot; Bırakma ortamı 28 (CMD-leu-ura ortamı 29 bir sülfat tükenmiş varyant), bir 30 ° C karıştırıcısı içinde post-logaritmik faza maya hücrelerinin kültürü 2 mi . Luciferi 2 uM ile desteklenmiş taze ortam içinde 1.8 ml, bu kültürlerin 200 ul inokülen coelenterazine. Çalkalamadan 24 saat daha oda sıcaklığında karanlıkta büyütün. </li><li> Kültürün ozmolarite (aşağıda) (tipik olarak en mOsM&#39;den 1400) ve diğer çözümleri bir buhar basıncı osmometresi kullanılarak ölçülür. </li><li> Tümbölen 20 tek tüp lüminometre için bir 12 mm Lüminometre tüpüne taze kültür ul. </li><li> Hipotonik şok için, arzu edilen şok derecesine bağlı olarak, 25 mM NaEGTA (pH 7.2) ya da NaMES (pH 7.2) 500-100 mM NaCl, (1,200-400 mOsm toplam ozmolaritesi) ihtiva eden bir çözelti 200 ul ekleyin. Sürekli önce lüminesans izlemek ve en az 120 saniye ozmotik downshock sonra, sadece kısa seyreltme işlemi tarafından kesildi. Göreli ışık birimi (RUL) gibi bir masaüstü bilgisayarda Lüminometre çıktı kaydettirin. </li></ol> Transgenik olmayan TRPV4 çalışma için de, biz maya suşu çok sayıda cevapları incelemek için otomatik bir sistem içinde yukarıdaki protokol bir varyantını kullandık. Çalışma of hipo-30 ya da bir mikro-luminometre kullanılarak maya deletome (4906 maya tek gen deletants of toplama) hiperosmotik 31 uyaranlara ve karşılık gelen yazılım programı ile analiz tepkiler başarılı olmuştur. 2. ve 3. Oosit Elektrofizyoloji Yöntemleri Elektrofizyoloji temel yöntemlerini 32. kullanır. PCR, vahşi tip veya mutant TRPV4 yüksek kalitede PfuUtra polimeraz kullanılarak ve pGH19 33 entegre olan açık okuma çerçevesi yükseltmek. Bu, Xenopus β-globin geni ve bir T7 RNA polimeraz promoterinin alt bölgesinin 5 &#39;ve 3&#39; UTRs arasındaki ORF kesin bir ekleme gerektirir. 3 &#39;UTR bölgesinin alt baş ve bir in vitro T7 RNA polimeraz reaksiyonunda şablonlar olarak kullanılan yapı linearize. Standart moleküler biyolojik teknikleri kullanarak 34. X&#39;den Evre V-VI oosit kullanın laevis. Hayvancılık, kısmi ovariectobenim, defolliculation ve vitellin zarf kaldırma standart işlemlerinizi 32,33,35 izleyin. Bir Drummond Nanoinject II otomatik mikropüskürtücüden kullanarak oosit başına cRAN çözümün 2-40 ng enjekte edilir. ~ Her bir deney grubu için 30 oosit enjekte edilir. TRPV4-cRNA enjeksiyonundan sonra, gentamisin (100 ug / ml) ile ND96 ortam içinde inkübe oosit ve 1 uM rutenyum 14, kırmızı. 2. İki elektrotlu voltaj-kıskaç <ol><li> Ayrı bir pipet çektirmesi ile hassas atılan 100 ul mikropipetler gelen borosilikat cam kayıt pipetler çekin. </li><li> Gerilim-ölçme ve akım enjekte pipet iki elektrodu çekin ~ 1 mikron çaplı bir ucu diyafram var çekilir. </li><li> 2 M KCI ile Dolgu elektrot 0.1-0.2 MQ direnç ile sonuçlanır. Birlikte VG-2Ax100 sanal-topraklı banyo kelepçe ile, bir Digidata 1440 sayısallaştırıcıdan aracılığıyla Geneclamp 500 amplifikatör arayüzüne bağlı HS2A headstages, onları monte edin. Kazanmak<html> pClamp10 yazılımı kullanarak veri. </li><li> 20X büyütme ile mikroskop aşamasında üzerine monte edilen bir fabrikasyon plastik odası içinde bir 1 ml&#39;lik bir banyo içinde, test edilecek oosit yerleştirin. Banyo çözümü sanal-topraklı bir 3 M KCl ağar köprü ve yakın oosit yerleştirilen ve VG-2A sanal toprak aşamaya bağlanan bir klorlu gümüş tel gereğidir. </li><li> Çözelti, giriş ve çıkış olarak plastik boru donanımları ile sürekli perfüzyon için bölmeyi oluşturmak. Giriş boru altı 50 ml şırınga gövdesi, farklı bir çözeltisi ile doldurulmuş, her bir manifold bir fabrikasyon perfüzyon sistemine bağlanır bağlayın. Herhangi bir çözeltinin ağırlık besleme hızları kontrol için -2-3 boru donanımları ile ilgili &quot;Keck&quot; rampa kenetlerle ml / min. </li><li> Mikromanipülatörler kendi headstages hem elektrotlar monte edin. Mikromanipülasyon ile oosit elektrot penetrasynların gerçekleştirin. </li></ol> 3. Doğrudan Mechanosensitivity Patch Kelepçe incelenmesi &quot;&gt; Pipet hazırlanması GΩ yapışma oluşumu ve on-hücre ya da kesilmiş modlarının oluşumu da dahil olmak üzere, yamalı kenetleme ve temel yöntem Hamill&#39;e olanlar et al. 36 ve Conn 32 bulunmaktadır. <ol><li> 98 mM KCI, 1 mM MgCI2 ve 10 mM K +-HEPES, pH 7.2 ile ucunda bir ~ 1 mikron çaplı bir delik (kabarcık sayısı 5-6) borosilikat cam pipetler doldurun. </li><li> Ayrıca, bir manometre, bir 5 ml şırıngaya bir plastik boru boyunca ve bir T-bağlantı ile yama kelepçe pipet takın. Elektrot ve manometre çıkışları hem işlemek için bir bilgisayar kullanın. 10 kHz veri Edinme ve daha sonra analiz için 1 kHz sekiz kutuplu Bessel filtre aracılığıyla oynatmak. </li><li> Farklı yamalar tekrar tekrar aynı oosit kesilebilir. Bu uygulama TRPV4 moleküler aktivitesinin incelenmesi daha verimli ve güvenilir kılar. </li></ol>

<ol><li>Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+TRP+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">An introduction to TRP channels.</a> Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).</li>
<li>Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transient+receptor+potential+family+of+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The transient receptor potential family of ion channels.</a> Genome Biol. 12, 218 (2011).</li>
<li>Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vallinoid+transient+receptor+potential+channel+Trpv4%3A+From+structure+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Biophys.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).</li>
<li>Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+puzzle+of+TRPV4+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep.%22%5BJournal%5D)">The puzzle of TRPV4 channelopathies.</a> EMBO Rep.. , (2013).</li>
<li>Liedtke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanilloid+receptor-related+osmotically+activated+channel+%28VR-OAC%29%2C+a+candidate+vertebrate+osmoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor.</a> Cell. 103, 525-535 (2000).</li>
<li>Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OTRPC4%2C+a+nonselective+cation+channel+that+confers+sensitivity+to+extracellular+osmolarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity.</a> Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).</li>
<li>Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trp12%2C+a+novel+Trp+related+protein+from+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Trp12, a novel Trp related protein from kidney.</a> FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).</li>
<li>Delany, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+human+vanilloid+receptor-like+protein%2C+VRL-2%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2.</a> Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).</li>
<li>Rock, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+mutations+in+TRPV4+cause+autosomal+dominant+brachyolmia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia.</a> Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).</li>
<li>Krakow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+gene+encoding+the+calcium-permeable+ion+channel+TRPV4+produce+spondylometaphyseal+dysplasia%2C+Kozlowski+type+and+metatropic+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia.</a> Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).</li>
<li>Camacho, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+TRPV4+mutations+in+nonlethal+and+lethal+metatropic+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet.+A%22%5BJournal%5D)">Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia.</a> Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).</li>
<li>Voets, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+permeation+through+the+cation+channel+TRPV4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4.</a> J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).</li>
<li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+TRPV4+gating+by+intra-+and+extracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2.</a> Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).</li>
<li>Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+and+brachyolmia-causing+mutant+TRPV4+channels+respond+directly+to+stretch+force%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force.</a> J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).</li>
<li>Gao, X., Wu, L., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-modulated+diversity+of+TRPV4+channel+gating%3A+activation+by+physical+stresses+and+phorbol+ester+derivatives+through+protein+kinase+C-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways.</a> J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).</li>
<li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anandamide+and+arachidonic+acid+use+epoxyeicosatrienoic+acids+to+activate+TRPV4+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels.</a> Nature. 424, 434-438 (2003).</li>
<li>Vriens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+swelling%2C+heat%2C+and+chemical+agonists+use+distinct+pathways+for+the+activation+of+the+cation+channel+TRPV4%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).</li>
<li>Vincent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+novel+TRPV4+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of novel TRPV4 modulators.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).</li>
<li>Willette, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+activation+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid+subtype+4+channel+causes+endothelial+failure+and+circulatory+collapse%3A+Part+2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).</li>
<li>Thorneloe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orally+active+TRPV4+channel+blocker+prevents+and+resolves+pulmonary+edema+induced+by+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+dysplasia+caused+by+a+constitutive+activated+transient+receptor+potential+vanilloid+4+%28TRPV4%29+cation+channel+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation.</a> Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).</li>
<li>Lamande, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+TRPV4+cause+an+inherited+arthropathy+of+hands+and+feet%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet.</a> Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).</li>
<li>Loukin, S., Su, Z., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Basal+Activity+Is+a+Key+Determinant+in+the+Severity+of+Human+Skeletal+Dysplasia+Caused+by+TRPV4+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypotonic+shocks+activate+rat+TRPV4+in+yeast+in+the+absence+of+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids.</a> FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).</li>
<li>Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+analysis+reveals+multiple+gating+mechanisms+of+TRPV4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4.</a> J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).</li>
<li>Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+respond+to+hypotonic+shock+with+a+calcium+pulse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse.</a> J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%22">Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).</li>
<li>Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+survey+suggests+an+osmoprotective+role+for+vacuolar+Ca2%2B+release+in+cell+wall-compromised+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast.</a> FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).</li>
<li>Denis, V., Cyert, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+Ca%282%2B%29+release+in+yeast+is+triggered+by+hypertonic+shock+and+mediated+by+a+TRP+channel+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue.</a> J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).</li>
<li>Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+perturbations+sensitize+osmotic+down-shock+activated+Ca2%2B+influx%2C+a+yeast+%26%2334%3Bdeletome%26%2334%3B+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast &#34;deletome&#34; analysis.</a> FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).</li>
<li>Loukin, S. H., Zhou, X. -L., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+survey+suggests+an+osmo-protective+role+for+vacuolar+Ca2%2B+release+in+cell-wall-compromized+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast.</a> FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).</li>
<li>Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConn%2C+PM+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 294, Academic Press. (1999).</li>
<li>Iverson Rudy, L. E. Methods in Enzymology. 207, Harcourt Brace Jovanovich. 279-298 (1992).</li>
<li>Loukin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+mutagenesis+reveals+a+region+important+for+gating+of+the+yeast+K%2B+channel+Ykc1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1.</a> EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recording+of+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC1+forms+the+stretch-activated+cation+channel+in+vertebrate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells.</a> Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Giriş bölümünde belirtildiği gibi, yaygın TRPV4 fonksiyonlarını incelemek için kullanılan yöntemler bazen tutarsızlıklara ve tartışmalar sonuçlandı. Burada açıklanan yöntemlerin iki set bazı avantajlar sunmaktadır ve mevcut yöntem tamamlayabilir. Biz TRPV4 sadece çalışmaları tarif ederken, bu buluşun metodları ve başka iyon kanalları incelemek için uzatılabilir. 1.. Maya luminometri Yöntemleri Tomurcuklanan maya lipid bileşimin 30 etkileyen mutasyonlar i...

TRPS (geçici reseptör potansiyeller) duyusal fonksiyonları 1,2 hizmet katyon kanallarının yedi alt familyaya oluşmaktadır. Memeliler, TRPV olarak, TRPS en vanilloid alt ailesi, altı çeşidi vardır. TRPV4 (tip 4) ısı 3,4 cevap verir, bazı kimyasallar, ozmotik şişme, ya da kayma gerilmesi. TRPV4 gen tekrar tekrar aday geni ve / veya 5-8 ifade klonlama ile izole edilmiştir. Bu ikinci yöntem, hipo-ozmolarite gen ürün tepkisini takip etti. TRPV4 çok farklı hücre tipleri 3,4 gelişimi, fizyoloji, herhangi bir patolojinin hemen hemen tüm organ ve işlevler cinsinden ifade edilir. Çarpıcı periferal nöropatiler ve / veya iskelet displazileri (iskelet gelişiminde anormallikler) 9-11 neden&gt; 50 insan otozomal dominant TRPV4 mutasyonlar. Iskelet displazisi aralığında hafif brachyomia tip 3 (tip-3 cücelik), spondylometaphyseal displazi Kozlowski tipi, seve dandisplaziler yeniden, bazı neonatal veya embriyonik ölüme neden olur. Mekanizmaların tüm görgü olası görünüyor olsa da, hiçbiri çeşitlilik, karmaşıklık, değişkenliği ve bu hastalıkların 4 zaman zaman çakışmalar açıklıyor. Diğer TRP kanalları 1 gibi, TRPV4 bir tetramerdir. Sıçan ya da insan TRPV4 olarak, her bir alt birim 871 artıkları oluşmaktadır. Bu temel öğesi altı transmembran olası voltaj kapılı K + kanallarının benzer bir şekilde düzenlenmiş olan bir heliks (S1-S6) &#39;dir. Orada, S4 S1 çevresel bir etki oluşturur ve S5 ve S6 geçirgenlik, gözenek alanı oluşturur. S5 ve TRPV4 ve S6 arasında muhtemelen katyon filtre oluşturmak için yakınsama dört hangi dizisi LDLFKLTIGMGDL, ardından kısa bir gözenek sarmal olduğunu. 470 artıklı N-terminal segmenti sitoplazmik proteinler ya da küçük ligandların bağlandığı bilinen 6 ankirin tekrarı içerir. C-terminal 152-bakiye sitoplazmik kademeli ot bağlanan diğer olası siteler arasında bir kalmodulin-bağlayıcı sekansı içerirOnun elemanları 3. TRPV4 esasen 1 anyonları hariç bir katyondur kanalıdır. Fizyolojik fonksiyonu Ca 2 + akınına uyaranlara transdüksiyonu için olsa da, bir P Ca iki değerli lehine, aynı zamanda bir Eisenman IV geçirgenlik sekansı ile diğer katyonlar geçirgen: P Na ~ 7 12. Tek kanallı iletkenliği ~ 90 pS dışa ve ~ 40 PS içe 6,13,14 de düzeltilir. Heterolojik ifade (aşağıda) akım hipo-ozmotik şişme, kayma gerilmesi, ya da sıcaklık 15 ile aktive edilebilir. Ayrıca, çoklu doymamış yağ asitleri 16,17 ve sentetik phorbal ester 18 4αPDD tarafından aktive edilir. Şu anda, her ikisi de, yüksek verim, küçük moleküllü ekran tarafından keşfedilen 10 -9 -8 10 M 20 etkili, en güçlü agonist GSK1016790A 19 ve antagonist olan GSK2193874. TRPV4 araştırma iki anahtar alanlar kafa kalır: (1) TRPV4 büyük ölçüde mechanosensitivity için çalışılmıştır bile, moleküler temeli tartışmalıdır. Bir model, hipo-osmolarite herhangi bir şekilde epoksijenaz ile asit (EET) epoxyeicosatrienoic dönüştürülür çoklu doymamış yağ asidi (PUFA), arakidonik asit (AA), üretilmesi için fosfolipaz A2 (PLA2) harekete geçirir ve EET bağlanmasını TRPV4 16 aktive tarif 17. Yine de, TRPV4 kendisi doğrudan basit bir açıklama sağlamaktadır, membran streç 14 (aşağıda) yanıt gösterilmiştir. (2) TRPV4 mutant patolojileri şaşırtıcı vardır. Temel olarak, bir hastalık kaybı, azaltılması ya da kanalı faaliyetlerinin artış nedeniyle olup olmadığını bilmek gerekir. Burada bile, edebiyat çok net değil. Birden iskelet-displazi alellerin daha yüksek bir aktiviteye sahip olduğu rapor edilirken, (kazanç fonksiyon-, GOF) 4,21, çeşitli etkinlikler (kayıp-fonksiyon, LOF) 10,22 azalma olduğu bildirildi. 14 alellerin sistematik bir çalışma için onları bulduTüm GOF edilecek mutasyonlar (aşağıda) 23. TRPV4 fonksiyon tam kaybına rağmen sadece küçük kusurları ile canlı veya bereketli nakavt fare, - bazı Lofs olan iddia trpV4-/ fenotip çelişiyor gibi görünüyor. Bu tartışmalara bir kısmı metodolojik kaynağı vardır. Laboratories farklı yöntemler, ya da bir yöntem varyantlarını kullanımı ve farklı bakarsak standartları kullanır. En sık olarak, TRPV4 geçici (HEK, CHO, HeLa) ve agonist veya hipotonik stimülasyonu üzerine iç [Ca2 +] yükselişi Ca 2 + duyarlı fluoresan boya, Fura-2 ile kayıtlıdır kültürlenmiş memeli hücrelerinde ifade edilir. Bu flüorometrik tahlil üzerinde aşırı güven 1 eleştirilmiştir. Farklı popülasyonlarda ekspresyon seviyesi, bunun içinde dağılım, hem de etkili bir boya konsantrasyonu, kontrol ve belgelenmiş gerekir. Daha güvenilir doğrudan elektrofizyolojik muayenesi olmaktır. Hatta bu gibi commonly uygulanan, sorunsuz da değildir. Kültürlenen hücrelerde ekspresyon seviyeleri kontrol edilmesi zor olduğu için, bütün hücre akımları büyük farklılıklar vardır. Akımlar küçük çünkü Ayrıca, güvenilir istatistikler genellikle pratik değil büyük çaplı, güvenmek zorunda kalacak. Patch-kelepçe muayeneler nadiren yapılmıştır. Bu tür bazı kayıtlar 16,17 istatistiksel değerlendirme zorlu hale aktivite patlamaları kümeleri göstermektedir. Daha iyi moleküler mechanosensitivity anlamak için, biz TRPV4 incelemek için iki ek sistemleri geliştirdiler. (1) uzakta olağan memeli ortaklarından TRPV4 izole etmek için, biz maya 24 tomurcuklanma sıçan TRPV4 dile getirdiler. Bu evrimsel uzak bağlamda TRPV4 Fonksiyonel ifadesi hala olağan ortaklar olmadan ozmotik kuvvet cevap verebilecek gösterdi. Maya gibi AA veya EET hiçbir PUFAların yapar, ve genom, bu Expre hiçbir PLA2&#39;nin veya epoksijenaz genleri Çünküsalgılanması da TRPV4 kuvveti duyacak için, gerekli olmadığını göstermektedir. Moleküler biyolojik en müsait ökariyotlarda TRPV4 olması da etkili ileri veya geri-genetik manipülasyonlar 25 verir. (2) TRPV4 derinlemesine biyofiziksel analizler için, Xenopus oositlerde TRPV4 ifade edilmiştir. NA (10 -10 10 -9 A) akımları alt-nA verim kültür hücreleri, aksine, bir oosit uA adlı (10 -6 -4 10 A) akımları ifade eder. Gürültü üzerine çok daha büyük sinyali daha iyi ölçümlerini ve daha güvenli karşılaştırılmasını sağlar. TRPV4, bu ifade, aynı zamanda bir kumanda kelepçesi kullanılarak tek tek moleküller olarak incelenebilir. Tek bir oosit tekrar ölçümü daha güvenilir hale tekrarlanan yama örnekleme sağlar. Bu tür çalışmalar TRPV4 kanal kendisi doğrudan membran germe kuvveti 14 ile aktive edilebilir olduğunu gösterdi. Analizler aynı zamanda 14 temsilci iskelet-displazi alellerin tüm kazanç fonksiyon-mutasyonlar olduğunu gösterdi. Bundan başka, degrBu yapısal Ca 2 + kaçağı ee iskelet hastalıkları 23 şiddetini paraleldir. Çünkü onların yenilik ve kullanışlılığı, bu iki yöntemin detaylı prosedürler TRPV4 veya benzeri kanallar gelecekteki araştırmalarda çoğaltmaları izin burada toplanıyor.

<table><tbody><tr><td>Buhar Basıncı Ozmometresi</td><td>Wescor</td><td>Wescor 5500</td><td>Logan, UT, ABD</td></tr><tr><td>Sirius Tek Tüplü Luminometre&nbsp;</td><td>Titertek-Berhold</td><td>Sirius</td><td>Huntsville, LA, ABD</td></tr><tr><td>Mikroplaka luminometresi</td><td>Titertek-Berthold</td><td>Mithras LB940</td><td>Huntsville, LA, ABD</td></tr><tr><td>Luminometri yazılımı</td><td>Titertek-Berthold</td><td>MikroWin2000</td><td>Huntsville, LA, ABD</td></tr><tr><td>Yama kelepçesi ve yazılımı</td><td>Axon Instrument</td><td>HS2A headstage, VG-2Ax100 sanal topraklı banyo kelepçesi, GeneClamp 500 amplifikatör, digidata 1440 sayısallaştırıcı, pClamp10 yazılımı</td><td>Union City, CA, ABD</td></tr><tr><td>Manometre</td><td>Bio-Tec</td><td></td><td>Winooski, VT, ABD</td></tr><tr><td>Pipet çektirme Sutter</td><td>Instrument Co</td><td>Modeli P-97</td><td>Novata, CA, ABD</td></tr><tr><td></td><td>Mikroenjektör Drummond Scientific</td><td>Nanoinject II</td><td>Broomall, PA, ABD</td></tr><tr><td>Luciferin coelenterazine</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Carlsbad, CA, ABD</td></tr><tr><td>T7 RNA polimeraz reaksiyon</td><td>Ambion</td><td>mMessage mMachine</td><td>Austin, TX, ABD</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rutenyum kırmızısı&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikropipetler&nbsp;</td><td>Drummond</td><td>100 mikrolitre mikropipetler</td><td>Broomall, PA, ABD</td></tr><tr><td>Yüksek kaliteli PfuUtra polimeraz&nbsp;</td><td>Stratagene</td><td></td><td>La Jolla, CA, Amerika Birleşik Devletleri</td></tr></tbody></table>

maya lüminometrik ve xenopus yumurta elektrofizyolojik sınavları

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

TRPV4 (geçici reseptör Potansiyelleri, vanilloid etti, tip 4) omurgalı dokularda yaygın olarak ifade edilir ve mekanik kuvvetlerin de dahil olmak üzere çeşitli uyaranlar tarafından aktif hale gelir. Bazı insan mutasyon TRPV4 karmaşık kalıtsal kemik veya nöronal patolojiler neden olur. Vahşi tip ya da mutant TRPV4 transgenler yaygın olarak kültürlenmiş memeli hücrelerinde ifade edilir ve Fura-2 fluorometri ile ve elektrotlar ile incelenir. Mechanosensitivity ve hastalıkların moleküler bazların mekanizması açısından, mevcut literatür kafa karıştırıcı ve tartışmalıdır. Varolan yöntemler tamamlamak için, biz TRPV4 moleküler özelliklerini incelemek için iki ek yöntemleri açıklanmaktadır. (1) Rat TRPV4 ve aequorin transgen tomurcuklanma maya içine transforme edilir. Transformant nüfusunun hipo-Osmotik şok TRPV4 kanalı üzerinden serbest nedeniyle, Ca 2 + ile aequorin kombinasyonuna lüminometrik bir sinyal verir. İşte TRPV4 her zamanki memeli ortak proteinlerin izole edilirve kendi mechanosensitivity ortaya koymaktadır. (2) TRPV4 of cRNA Xenopus oositlerine enjekte edilir. Uygun bir inkübasyon süresinden sonra, makroskopik TRPV4 mevcut bir iki elektrodlu voltaj kelepçe ile incelenir. Oosit banyosundan atıl ozmotikum uzaklaştırılması üzerine akım yükselme mechanosensitivity göstergesidir. Oositlerden mikroamper (10 A -4 -6 ila 10) akımları net quantifications ve daha emin değerlendirmeler, sonuçta kültürlenmiş hücrelerden nanoAmpere subnano-to (10 -10 A -9 10) akımları çok daha büyüktür. Tek kanal proteinlerin faaliyetlerini yansıtan mikroskobik akımlar da doğrudan doğruya-hücre ya da eksize modunda, bir yama kelepçe altında kayıtlı olabilir. Aynı oosit daha iyi veri replikasyonu sağlayan, birden fazla yama örnekleri sağlar. Yamalar uygulanan emmelerde doğrudan mechanosensitivity değerlendirmek TRPV4 etkinleştirebilirsiniz. Bu yöntemler aynı zamanda TRP kanallarının diğer tip çalışmaya faydalı olmalıdır.

Tipik luminometri kullanılarak bir deneyde, 400-1,200 mOsM&#39;den aşağı hipotonik şok, bir dizi 1400 mOsm&#39;de kültür 20 ul farklı düşük ozmotik basıncı şok çözümler 200 ul eklenmesi ile elde edilir. Maya hücreleri boş p416GPDV4 plazmid veya iyon filtre bir mutasyon (Şekil 1) 24 ile TRPV4 geni içeren bir transforme: Deneysel RLU iki negatif kontroller ile karşılaştırıldığında zaman TRPV4 aktivitesi belirgindir. Tipik iki elektrotlu voltaj-kelepçe deney...

TRPV4 en incelemek için yaygın olarak kullanılan yöntemler tamamlamak için, iki yöntem tarif edilmiştir: Onun mechanosensitivity hipo-ozmotik tehdidi üzerine transgenik maya Ca 2 +-akorinden luminometri ele alınabilir. Ayrıca TRPV4-RNA incelenebilir on-hücre ya da kesilmiş modunda kelepçe bütün hücre iki elektrotlu voltaj kelepçe veya yama ile Xenopus oosit enjekte edilir.

Maya lüminometrik ve Xenopus Yumurta Elektrofizyolojik Sınavları

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, trip V dört iyon kanalının mekanik duyarlılığını incelemektir. Bu, maya hücrelerini trip V dört geni ile dönüştürerek ve bir luminometre kullanarak transgenik bir yabancı yoluyla varsayımsal olarak indüklenen kalsiyum girişini inceleyerek elde edilebilir. Bu aynı zamanda elektrofizyolojik yaklaşımla da incelenebilir.Trip V dört CRNA ilk olarak üretilir ve inkübasyondan sonra xenopus sitlerine enjekte edilir. Sitler, hipotonik zorluk üzerine iki elektrot voltaj kelepçesi ile incelenir. Mekano hassasiyetini tek kanal seviyesinde incelemek için, sitlerden çıkarılan membran yamalarına emme uygulanır.Ben Profesör Jin Kung. Daha önce, TRIP B dört iyon kanalının aktiviteleri, burada geliştirilen floresan efsanesine URA tarafından büyük ölçüde gösterilmişti, trip B four'un mekanik hassasiyetini incelemek için güçlü ve nicel alternatifler sağlıyordu. Lum lum kullanımını benimsediğimiz ilk yöntem, tomurcuklanan mayada Trip V four'un mekanik hassasiyetini incelemek için transgenik aqua'dır.Elektrofizyolojik yaklaşımla yapılan ikinci yöntemde, XUS Sitlerinde tribute V dört CRNA'nın uygun ekspresyonu ile Trip V dört'ün özellikleri incelenmiştir. Vilin zarının çıkarılması ve gig kendi contasının oluşturulması gibi sit elektrofizyolojisinin temel yöntemi, 2008 yılında bu dergide Brown ve meslektaşının bir çalışmasında zaten gösterilmiştir, burada Triv dört'ün mekanik hassasiyetini incelemek için gereken ek adımları gösterecektir. Bu benim iş arkadaşım, Dr.Jin Fcon.T lum geometrisinin kullanımının yanı sıra enjeksiyon pipetlerinin üretimini, pipetlerin CRNA çözeltisi ile doldurulmasını ve çözeltinin eski bölgelere enjekte edilmesini gösterecek. Buna ek olarak, hücrede ve eksize edilmiş içten dışa modunda yama istiridye kaydını gösterecek. Ayrıca, O bölge zarına özgü mekanoya duyarlı kanalın aktivasyonunu ve heterolog aktivasyonundan elde edilen sonuçları da gösterecektir.Lay eksprese edilmiş TV dört Bu prosedüre, 30 santigrat derecelik bir çalkalayıcıda bir molar sorbitol ile desteklenmiş DCD Lu Yura bırakma ortamında logaritmik faz sonrası için gece boyunca iki mililitre maya hücresi kültürleyerek başlayın. Ertesi gün, 200 mikrolitre kültürü, iki mikromolar Lucifer ile desteklenmiş 1.800 mikrolitre taze ortama aşılayın. Risin daha sonra karanlıkta, seyreltmeden hemen önce çalkalanmadan 24 saat daha oda sıcaklığında büyür.Bir molar sorbitol ile zenginleştirilmiş kültürün ve sodyum klorürün ozmolaritesini bir buhar basıncı OSM ter kullanarak ölçün. Daha sonra, tek tüplü bir luminometre için 12 milimetrelik bir luminometre tüpüne 20 mikrolitre taze kültür ekleyin. Hipotonik şok için, pH 7.2'de 25 milimolar sodyum EGTA veya pH 7.2'de sodyum MES ve 1.400 Milli Osmo'da 20 mikrolitre kültüre 500 ila 100 milimolar sodyum klorür içeren 200 mikrolitre çözelti ekleyin, 1.400 Milli Osmo'da lüminesansı sürekli olarak izleyin, ozmotik aşağı şoktan önce, sırasında ve en az 120 saniye sonra, yalnızca kısa seyreltme işlemiyle kesintiye uğrar, luminometre çıkışını bilgisayara bağıl lüminesans birimleri olarak kaydedin.Bu prosedürde, pipet çektirme ile bir mikro pipet çekin. Mikro pipet, diseksiyon mikroskobu altında uzun bir şafta sahip olmalıdır. Bir açıklık oluşturmak için çekilen mikro pipetin sapını uygun noktada dikkatlice sıkıştırın.CRNA çözeltisinin doldurulmasını ve çıkarılmasını kolaylaştırmak için mikro pipet açıklığının çapı yaklaşık 30 mikrometre olmalıdır. İşte mikro enjektör ve pipet tutucu. Bu, alma ve çıkarma fonksiyonlarının açıkça işaretlendiği kontroldür.Pipeti tutucuya monte edilmiş mineral yağ ile tekrar doldurduktan sonra, bir damla CRNA çözeltisine indirin. Daha sonra pipeti diseksiyon mikroskobu altında otomatik olarak mikro enjektör ile doldurun, bir oosit seçin. Daha sonra doldurulmuş mikro pipeti oosite nüfuz edecek şekilde indirin.Mikro pipet içine yerleştirildikten sonra CRNA enjeksiyonunu başlatın. Yaklaşık 30 sit enjekte edildikten sonra, bunları rutenyum kırmızısı ve Gentamisin içeren ND 96 ortamına aktarın. Daha sonra, bunları ayrı ayrı, sonunda ND 96 ortamını içeren 96 oyuklu bir plakaya aktarın.Trip V dört kanalının ifadesine izin vermek için bunları birkaç gün boyunca inkübatöre yerleştirin. Trip V four'un mekanizma duyarlılığını incelemek için iki elektrofizyolojik yöntem kullanılır. İlk yöntem, iki elektrot voltaj kelepçesidir ve bu, bu adımdaki kurulumdur.Gerilim ölçümü ve akım enjeksiyonu için kayıt pipetlerini pipet çekme ile 100 mikrolitrelik bolik bardaktan çekin. Pipet elektrotları, yaklaşık bir mikron çapında bir uç açıklığına sahip olmalıdır. Daha sonra, elektrotları iki molar potasyum klorür ile doldurun, bu da 0.1 ila 0.2 mega dirençle sonuçlanacaktır.Bunları HS iki kafa aşamasına monte edin. Bu ikisi, voltaj kontrol elektrodunu ve akım enjeksiyon elektrodunu tutan mikro manipülatörlerdir, bunlar bir VG iki x 100 sanal topraklı banyo kelepçesi ile birlikte, bir rakam 1440 sayısallaştırıcı aracılığıyla bir gen kelepçesi 500 amplifikatör arayüzüne bağlanır. Ve veriler P clamp 10 yazılımı kullanılarak elde edilir.Ters çevrilmiş mikroskobun sahnesinde oturan, bir kayıt yapmak için kayıt odasıdır, odaya bir ksenopus sitiği yerleştirilir ve iki elektrot mikro manipülasyon yoluyla içine yerleştirilir. Siti kayıt odasında yıkayan çözelti, yerçekimi boyunca sürekli bir akış halindedir. Girişi hazneye besleyin, boru vasıtasıyla bir şırınga kabuğu bankası ile imal edilmiş bir manifolda bağlanır.Her kabuk farklı bir çözelti ile doldurulur. Banyonun içeriği, boru üzerindeki farklı kelepçelerin kapatılması veya açılmasıyla değiştirilir. Banyoyu yüksek ozmolariteden düşük ozmolariteye değiştirmek, bir tür mekanik stimülasyon sağlar.Şimdi, çekilen cam pipetleri dahili solüsyonla doldurun. Yama kelepçesi kurulumu, elektrotun kafa aşamasına monte edildiği ve daha sonra mikro manipülatöre sabitlendiği voltaj kelepçesi için olana benzer. Yama kelepçesi pipetini beş mililitrelik bir şırıngaya ve bir manometreye takın.Yama kelepçe elektrodu, oositin yüzeyine manipüle edilir. Vitale membranının çıkarılmasından sonra, yamayı pipet ucuna yapıştırmak için sürekli emme uygulayın, bu da test akımı darbesine karşı elektrik direncini artıracaktır. Direnç, bir giga contanın başarılı bir şekilde oluştuğunu gösterecek kadar büyük olduğunda, yamalı elektrot daha sonra eksize edilen ters yüz kayıt modunu oluşturmak için oositten çekilir.Ardından, eksize edilen yamaya emme darbeleri uygulayın. Xenopus oositine özgü 40 pico Siemens mekanik duyarlı bir kanal vardır. Bu şekil, zarda bir emme darbesi uygulandığında bu kanalların aktivasyonunu, oositlerden çıkarılan yamaların V. geziyi başarılı bir şekilde ifade ettiğini göstermektedir.Trip V four'un 90 pico Siemens üniter iletkenliğinin aktivasyonu da benzer şekilde gözlemlenebilir. Burada gösterilen, hipotonik şoka yanıt veren mayada ifade edilen sıçan gezisi V dördüdür. 750 miliozmol hipotonik şok, açma V dört T performansında büyük bir lüminesans artışını tetikler, ancak iyon filtresinde bir mutasyon ile açma V dört taşıyan boş bir plazmitin veya plazmitin T performansında tetiklemez.Ve burada hipotonik şok ile pik yanıt arasındaki doz yanıtı ilişkisi var. Hipotonik uyaranlara tüm oosit makroskopik akım yanıtları iki elektrotlu voltaj klempi ile incelendi. 250 mili Osmo banyo çözeltisinden 100 milimolar sorbitolün çıkarılmasına ve üç mikromolar rutenyum kırmızısının eklenmesine yanıt olarak 100 milisaniye voltaj adımlarında dördü üzerine çok yüksek seviyelerde vahşi tip trip V ifade eden bir oositten gelen tepe akımları.Tekrarlanan tepe akımı hipotonik uyaranlarla artar ve izotonik çözeltiye dönüldüğünde veya kanal blokerinin eklenmesiyle azalır. Bu şekil, pozitif 50 voltta tutulan eksize edilmiş bir ters yamaya uygulanan 60 milimetre cıva emme ile aktivasyonu gösteren oositi ifade eden bir gezi V dörtten eksize edilen bir yamadan ortalama kalitede ham izlerin bir örneği olan yama kelepçesi altında görülen membran gerilmesi ile vahşi tip açma V dört'ün doğrudan aktivasyonunu göstermektedir. En üstteki iz, kapalı ve açık seviye arasındaki üniter akım geçişini göstermek için daha hızlı bir zaman tabanında görüntülenir.Bu video kaset, triv dört kanalın mekanik hassasiyet çalışmasına maya ışığı, geometri ve O bölgesi elektrofizyolojik yöntemlerinin nasıl uygulanabileceği konusunda size daha somut bir anlayış sağlamalıdır.

yeast-luminometric-xenopus-oocyte-electrophysiological-examinations

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kesik açık vazelin boşluk yaklaşım hızlı kanal kinetiği yüksek çözünürlüklü Xenopus oositlerde eksprese edilen voltaj-bağımlı iyon kanallarının iyonik ve yolluk akımlarının düşük ses kayıtları elde etmek için kullanılır. Küçük değişiklikler ile, voltaj kıskaç fluorometri kesme açık oosit protokolüne akuple edilebilir.

<em&gt; Xenopus</emFluorometri ile&gt; Yumurta Kes-açık Vazelin Gap Gerilim-kelepçe Tekniği

Genetik olarak kodlanmış voltaj göstergeleri kullanılarak zar potansiyelindeki değişiklikleri görüntülemek için bir yöntem açıklanmıştır.

Genetik Kodlanmış Floresan Gerilim Sensörleri İki Türleri ile Potansiyel görüntüleme Membran

Keskin mikroelektrotlar, canlı Drosophila'da fotoreseptörün ve görsel internöron çıkışının doğru elektrofizyolojik karakterizasyonunu sağlar. Burada, tek tek hücrelerin kontrollü ışık stimülasyonuna yüksek kaliteli voltaj tepkilerini kaydetmek için bu yöntemin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Bu yöntem, böcek bileşik gözlerinde nöral bilgi işlemeyi incelemek için idealdir.

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</em&gt; Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn Vivo</em

bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Bu makale, iyon kanallarındaki yapısal yeniden düzenlenmeleri araştırmak için maleimid boyaları yerine Floresan Doğal olmayan Amino Asitlerin (fUAA) kullanıldığı klasik Voltaj-Kelepçe Florometrisinin (VCF) geliştirilmesini anlatıyor. Prosedür, Xenopus oosit DNA enjeksiyonu, RNA / fUAA koinjeksiyon ve eşzamanlı akım ve flüoresans ölçümlerini içerir.

Voltaj kelepçesi florometrisi<em&gt; Xenopus</emFloresan Doğal Olmayan Amino Asitler Kullanan Oositler

Drosophila melanogaster fotoreptörlerinden alınan bütün hücreli kayıtlar, çeşitli koşullar altında kendiliğinden oluşan karanlık yumruları, kuantum darbeleri, ışığa karşı makroskopik tepkileri ve akım-voltaj ilişkilerini ölçebilir. D. melanogaster genetik manipülasyon araçları ile birlikte bu yöntem, her yerde bulunan inositol-lipid sinyal yolunu ve TRP kanalının hedefini incelemeyi mümkün kılar.

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</emPhotoreceptors

Bu makalede biyokimyasal miktarda deterjan çözündürüldükten TRPV1 spektroskopik analiz için elde için belirli yöntemleri açıklar. Kombine protokoller memeli iyon kanalları membran kontrollü bir ortamda yapısal ve fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmak için uyarlanmış Biyokimya ve biyofizik araçları sağlar.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Burada, yüksek hızlı modüler fotometri sistemi kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre türetilmiş kardiyomiyositlerden kaynaklanan eylem potansiyellerinin optik edinimi ve karakterizasyonu açıklanmaktadır.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Elektrofizyoloji, iyon kanalı aktivitesini araştırmak için altın standarttır. Bununla birlikte, optik yöntemler de dahil olmak üzere birçok alternatif yaklaşım vardır. Burada, alt birimler arası Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı bir yöntem kullanarak 8 kanal (LRRC8) ile oluşturulmuş anyon kanalı içeren lösin açısından zengin tekrarın aktivitesini izlemek için bir yöntem açıklıyoruz.

Hassaslaştırılmış Emisyonlu Förster Rezonans Enerji Transferi (SE-FRET) Kullanılarak 8 Kanal (LRRC8/VRAC) Aktivitesi İçeren Lösin Açısından Zengin Tekrarın İzlenmesi

Uyarılabilir hücrelerin tepkilerini in vitro olarak incelemek için protokol, genetik olarak tasarlanmış tet-on spiking HEK hücrelerinin basit bir uyarılabilir hücre modelinde elektroporasyona bağlı aksiyon potansiyeli üretimindeki değişikliklerin yanı sıra ilgili parametrelerin otomatik olarak çıkarılması ile transmembran voltajındaki değişikliklerin optik olarak izlenmesini açıklar.

Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi

Öğrenin TRPV4 iyon kanalının mekanosensitivitesini maya lüminometri ve Xenopus oosit elektrofizyolojisi ile incelemeyi. Bu yöntemler kanal fonksiyonunu nicel olarak değerlendirmeyi sağlar.

Maya lüminometrik ve Xenopus Yumurta Elektrofizyolojik Sınavları

Daha fazla video keşfet