Name: Testis Germ Hücrelerinin Üç Boyutlu Kromatin Mimarisini Korumak için Slayt Hazırlama Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Öğrenin, fare testis germ hücrelerinde 3D kromatin yapısını koruyan slayt hazırlama yöntemini. Bu teknik, immunofluoresans ve FISH ile alt nükleer yapıların görüntülenmesini kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jeannie T. Lee'ye lee laboratuvarındayken bu projenin denetimi için teşekkür ederim ve Tyler Broering de taslağı düzenlediği için. Bu çalışma, Dimes Vakfı'nın Yürüyüşü'nden Basil O'Connor Starter Scholar Ödülü ve NIH Grant GM098605 tarafından desteklendi.

1.3D Slayt Hazırlama
<ol><li>Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın:<ol>
<li>CSK tamponu: 100 mM NaCl, 300 mM sakkaroz, 10 mM PIPES, 3 mM MgCl2. 1 M NaOH ile pH'ı 6,8'e ayarlayın. CSK tamponu 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>%0,5 Triton X-100 ile CSK tamponu: 200 μl Triton X-100 ila 40 ml CSK tampon ekleyin. Triton X-100 tamamen çözünene kadar çözeltiyi manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırın. CSK tamponu %0,5 Triton X-100 ile 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>%4 Paraformaldehit (PFA)–PBS, pH 7.4: 4 g PFA'yı yaklaşık 70-80 ml suda çözün. Çözünme işlemini hızlandırmak için yaklaşık 20 μl 4 N NaOH ekleyin ve çözeltiyi PFA tamamen çözünene ve çözelti şeffaf olana kadar 60 °C'de bir su banyosunda tutun. Bu işlem yaklaşık 1 saat sürer. PFA tamamen çözüldükten sonra, 10 ml 10x PBS ekleyin. Son ses seviyesini su ile 100 ml'ye ayarlayın ve çözeltiyi oda sıcaklığına (25 °C) soğutun. Her yeni deney için yeni hazırlanmış bir çözüm kullanın. Not: Tüm hayvan işleri için kurumsal izin alın ve ilgili hayvan bakım yönergelerine uyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erkek farelere ötenazi. Tokslar ve makas kullanarak testisleri fareden açın. Testisleri PBS'ye (veya RPMI 1640)'a yerleştirin. Testislerin çıkarılmasından sonra, RNA'nın bozulmasını önlemek için aşağıdaki 1.3-1.4 adımlarını hızla uygulayın.</li>
	<li>Testisleri küçük bir Petri kabında yırtın ve tunica albuginea 'yıçıkarın. PBS'deki seminifer tübülleri, todükler kullanarak buz üzerinde çözün.</li>
	<li>Forseps kullanarak, birkaç tübül (yaklaşık 5-10 mm uzunluğunda birkaç tübül parçası) 500 ml CSK tampon + % 0,5 Triton X-100 içeren 4 kuyulu bir kabın bir kuyusuna aktarın ve 6 dakika kuluçkaya yatırın. CSK arabelleğine aşırı maruz kalmak hücrelerin bozulmasına neden olabilir.</li>
	<li>Forseps kullanarak, tüm tübülleri% 4 PFA-PBS çözeltisi içeren 4 kuyulu bir kabın bir kuyusuna aktarın. Bu adım stereomikroskop olmadan önceden biçimlendirilebilir, ancak isteğe bağlı olarak kullanılabilir. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatır. Aynı zamanda kuluçka dönemlerinde 12 sitospin odası hazırlamaya başlayın.</li>
	<li>Tokmakları kullanarak, tüm tübülleri PBS içeren 4 kuyulu bir kabın bir kuyusuna aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Cam bir slaydın arka tarafında, tüm tübülleri 30 μl PBS'ye aktarın (katyonik yük nedeniyle slaydın üst kısmı önlenmelidir). İki yaban arısının uçlarını kullanarak tübülleri parçalara ayırın. Tübülleri iki yaban arısının uçları arasında kırparak ve tokmakları yatay olarak çekerek yatay yönde doğrayın. Bu adıma yaklaşık 10-20 saniye devam edin.</li>
	<li>Süspansiyonu P20 pipet kullanarak pipetle karıştırın.</li>
	<li>Süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, PBS ile yaklaşık 1,3 ml'ye seyreltin. 12 sitospin odasının her birine (toplam 1,2 ml) 100 μl süspansiyon uygulayın. Bu adımda, hücrelerin konsantrasyonunun belirlenmesi gerekmez.</li>
	<li>Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.000 rpm'de cytospin. Sitospinnlemeden sonra, laboratuvar tezgahında oda sıcaklığında birkaç dakika boyunca kuru kaydıraklar. Slaytların birkaç dakika boyunca tamamen kurumasına izin verildikten sonra, bir sonraki adıma geçin.</li>
	<li>PBS içeren bir Coplin kavanozu kullanarak, slaytları oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Slaytları% 70 etanol içeren bir Coplin kavanozuna aktarın ve RNA FISH'in başlatılmasından önce en az 2 dakika bekleyin. Slaytlar 4 °C'de% 70 etanolde birkaç hafta stabildir. Uzun süreli depolama için, Coplin kavanozlarında her biri 2 dakika boyunca% 80 ve% 100 etanol ile seri işlem kullanarak susuz slaytları susuz bırakın ve hava kurusu slaytları tamamen susuz bırakın. -80 °C'de bir slayt kutusunda saklayın.</li>
</ol>2. Rastgele Astarlama ile Cot-1 DNA Prob Hazırlama
<ol><li>Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın:<ol>
<li>Hibridizasyon tamponu: 900 ml hibridizasyon tampon stoğu hazırlamak için işlem bileşenlerini karıştırın; bu çözüm probları stoklamak için kullanılacaktır. Bu hibridizasyon tampon stoğu, hibridizasyondan önce% 10 hacimli RNase inhibitör çözeltisinin (Ribonucleoside Vanadyl Kompleksi) eklenmesini sağlar.<table><tbody>
<tr>
<td>parça</td>
					<td>Miktar (μl)</td>
					<td>Son konsantrasyon</td>
				</tr>
<tr>
<td>Formamid</td>
					<td>500</td>
					<td>%50 (v/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>%50 Dektran</td>
					<td>200</td>
					<td>%10 (w/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>20x SSC</td>
					<td>100</td>
					<td>2x</td>
				</tr>
<tr>
<td>%1 BSA</td>
					<td>100</td>
					<td>0.1%</td>
				</tr>
</tbody></table>Hibridizasyondan önce, son konsantrasyona uyacak şekilde hibridizasyon tampon stoğuna 200 mM Ribonucleoside Vanadyl Kompleksi'nin 1/10 vol'unu veya suyu ekleyin. -20 °C'de, bu karışım bir yıldan fazla bir süre stabildir.</li>
		<li>20x SSC: Yaklaşık 800 ml suda 88,2 g sodyum sitrat ve 175,3 g NaCl çözün. Birkaç damla 1 M HCl kullanarak pH'ı 7,0'a ayarlayın. Hazırlık sonrası oda sıcaklığında 20x SSC saklanabilir.</li>
		<li>% 50 (w/v) Dektran: Suyu karıştırın ve yavaşça 50 g dektran sülfat ekleyin. Oda sıcaklığında gece boyunca karıştırmaya devam edin. Son ses seviyesini 100 ml'ye ayarlamak için su ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağıda listelenen aşağıdaki bileşenleri bir PCR tüpüne ekleyin. Bir PCR makinesi kullanarak, çözeltiyi 95 °C'de 5 dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırın.<table><tbody>
<tr>
<td>parça</td>
				<td align="center">Reaksiyon başına miktar (μl)</td>
				<td align="center">son</td>
			</tr>
<tr>
<td>Karyola-1 DNA:1 mg/ml</td>
				<td align="center">1</td>
				<td align="center">1 μg</td>
			</tr>
<tr>
<td>Rastgele 9mer astar (kitten)</td>
				<td align="center">10</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>Su</td>
				<td align="center">27</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Santrifüj kısa bir süre ve buza yerleştirin.</li>
	<li>Aşağıdaki bileşenleri ekleyin. Pcr makinesi kullanarak 37 °C'de 30 dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırın. (Kullanılan kitin ayrıntıları için reaktifler ve ekipman tablosuna bakın).<table><tbody>
<tr>
<td>parça</td>
				<td align="center">Reaksiyon başına miktar (μl)</td>
				<td align="center">Son konsantrasyon</td>
			</tr>
<tr>
<td>Adım 2.2'den hazırlanan karışım</td>
				<td align="center">38</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>5x nükleotid tampon (kitten)</td>
				<td align="center">9.2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>Cy3-dUTP (1 mM)</td>
				<td align="center">0.8</td>
				<td align="center">16 μM</td>
			</tr>
<tr>
<td>Klenow (kitten)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Reaksiyonu durdurmak için 2 μl durdurma tamponu (kitten) ekleyin.</li>
	<li>Mikrospin sütunlarını kullanarak durdurulan reaksiyonun saflaştırılması.</li>
	<li>Saflaştırılmış fraksiyona 50 μg (5 μl) fırlayan sperm DNA'sı (50 kat şablon Cot-1 DNA fazlalığı) ekleyin.</li>
	<li>Pipet kullanarak toplam hacmi ölçün. 4 °C'de bir mikrosantrifüj kullanarak maksimum hızda (17.000 x g) 0,7x hacim % 100 etanol ve 0,1x hacim 3 M sodyum asetat (pH 5,2) ekleyin, iyice karıştırın ve santrifüj ekleyin.</li>
	<li>Sıvıyı çıkarın ve % 70 etanol 200 μl ekleyin, iyice karıştırın ve 4 ° C'de maksimum hızda 5 dakika santrifüj.</li>
	<li>Fazla sıvıyı çıkarın. Çökelticiyi oda sıcaklığında 10-30 dakika kurutun.</li>
	<li>Peletin 20 μl hibridizasyon tampon stoğunda çözün. Peletin çözülmesi genellikle zor olduğundan, pipet tekrar tekrar. Alternatif bir seçenek olarak, peleti verimli bir şekilde çözmek için bir girdap karıştırıcısı da kullanılabilir. Problar kullanıma kadar -20 °C'de tutulabilir.</li>
</ol>3. Karyola-1 RNA BALIK
<ol><li>Aşağıda listelenen bileşenleri bir PCR tüpüne ekleyin. Bir PCR makinesi kullanarak, 80 ° C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın, ardından 42 ° C'de yaklaşık 10-30 dakikalık bir preannealing adımı. Melezleme işlemine kadar 42 °C'de tutun. Ribonucleoside Vanadyl Kompleksi isteğe bağlıdır; su ile değiştirilebilir.<table><tbody>
<tr>
<td>parça</td>
				<td align="center">Reaksiyon başına miktar (μl)</td>
				<td align="center">son</td>
			</tr>
<tr>
<td>Karyola-1 DNA probu (50 ng/μl)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">100 ng</td>
			</tr>
<tr>
<td>Ribonucleoside Vanadyl Kompleksi (200 mM)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">20 mM</td>
			</tr>
<tr>
<td>Karmalaştırma arabelleği</td>
				<td align="center">20'ye eklendi</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>2 dakika boyunca% 80 etanol içeren bir Coplin kavanozunda dehidrat kayar, ardından 2 dakika boyunca% 100 etanol içeren bir Coplin kavanozu. Oda sıcaklığında tamamen laboratuvar tezgahında kuru kaydıraklar.</li>
	<li>Bir uç kutu haznesi (2-3 cm su ile doldurulmuş) önceden 42 °C inkübatörde ısıtın. Slaydı uç kutusu haznesine yerleştirin. Önceden tasarlanmış probları ve pipeti doğrudan susuz slaytlara kısaca santrifüjleyin. Kabarcık yapmaktan kaçının. Slaydı bir kapak kayması ile hafifçe örtün.</li>
	<li>42 °C'de 6 saat ila bir gecede (14-15 saat) melezlen.</li>
	<li>Coplin kavanozlarında yıkama çözeltileri hazırlayın (hem 2x SSC hem de% 50 formamid içeren iki kavanoz ve 2x SSC'li iki kavanoz). 42 °C'de bir su banyosunda 30 dakika önceden ısıtın.</li>
	<li>Kapak fişini slaydın kenarından çıkarmak için jilet kullanın. Örnekleri çizmekten kaçının. Slaytları 2x SSC ve% 50 formamid içeren bir Coplin kavanozunda 45 ° C'de 5 dakika boyunca yıkayın. Bu adımı bir kez yineleyin.</li>
	<li>Slaytları 2x SSC içeren bir Coplin kavanozunda 45 °C'de 5 dakika boyunca yıkayın. Bu adımı bir kez yineleyin.</li>
	<li>Slaytlara 20 μl DAPI montaj ortamı ekleyin ve kapak kayması ile örtün. Ekstra montaj medyasını çıkarmak için kapak camına hafifçe basın. Temizleme dokusu ile ekstra montaj ortamı leke. Slaytlar mikroskopi değerlendirmesi için hazır.</li>
</ol>

<ol><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li>
<li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+nascent+RNA%2C+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li>
<li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li>
<li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li>
<li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li>
<li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li>
<li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+imprinted+X+inactivation%3A+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li>
<li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li>
<li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li>
</ol>

Yazarın açıklayacak bir şeyi yok.

3D slayt hazırlamada, permeabilizasyon adımı sabitleme adımından önce gelir. Bu adımlar doğrudan seminifer tübüller üzerinde gerçekleştirilir, böylece üç boyutlu kromatin yapısı korunur. RNA/DNA FISH için kromatin yapısını korumak için alternatif bir seçenek, permeabilizasyon adımını ve fiksasyon adımını aynı anda gerçekleştirmektir. Bu alternatif teknik keseli mikrop hücrelerinde ve fare preimplantasyon embriyolarında7,8. Ancak, sabitleme adımı permeabilizasyon adımından önce gelirse, yüksek sitoplazmik arka ...

Testislerde, mikrop hücreleri diploid spermatogonia'dan meiosis yoluyla olgun, haploid spermatozoaya farklılaşır. Bu işlem sırasında mikrop hücrelerinin nükleer kromatin yapısı sürekli ve dinamik olarak yeniden şekillendirilir. Yüzey yayılımları genellikle bireysel spermatojenik hücrelerin sitolojik incelemesi için kullanılır. Yaygın bir yüzey yayılım yöntemi, bireysel spermatojenik hücrelerin yayıldığı ve düzleştirildiği hipotonik tedaviyi kullanmaktadır1. Bu koşullar meiotik kromozomların ayrıntılı analizi için en uygun olanıdır. Sinaptik durum ve rekombinasyon odakları gibi kromozomal özellikler bu yöntem kullanılarak kolayca gözlenir. Bununla birlikte, hipotonik tedavi subnükleer kromatin mimarisini bozar, bu nedenle bu teknik çekirdeklerin yapısal analizi için uygun değildir. Sonuç olarak, testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin yapısını korumak için geliştirilmiş bir yöntem tasarlanmıştır. Bu yöntem üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak adlanmıştır (Şekil 1). 3D slayt yöntemi, başlangıçta RNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH)2,3ile testis germ hücre farklılaşması sırasında gen ekspresyasyonu ve kromatin durumlarını incelemek için optimize edildiği için çekirdeklerde nascent RNA lokalizasyonunun tespit edilmesini sağlamıştır. Bu 3D yöntem immünofluoresans, DNA ve RNA FISH kombinasyonu için de geçerlidir. Ek olarak, bu yöntem postmeiotik spermatidlerde bulunan cinsiyet kromozomlarının sessiz bir bölmesi olan postmeiotik cinsiyet kromatinin (PMSC) keşfine yardımcı olmuştur2.
3D slayt yöntemi başlangıçta nükleer boyama için yaygın olarak kullanılan iki temel slayt hazırlama adımının kombinasyonu ile optimize edilmiştir: nükleer malzemeleri düzeltmek için tasarlanmış sabitleme adımı ve antikorlar ve FISH probları gibi boyama reaktiflerinin erişilebilirliğini artırmak için sitoplazmik malzemelerin çıkarılması amaçlanan permeabilizasyon adımı. Daha önce başka bir yayında açıklandığı gibi3, düşük sitoplazmik arka plan ile en uygun sonuçları elde etmek için permeabilizasyon adımının sabitleme adımından önce gelmesi gerektiği belirlenmiştir. Bu 3D slayt yönteminde, permeabilizasyon adımı ve sonraki sabitleme adımı doğrudan seminifer tübüller üzerinde gerçekleştirilir ve slaytlara sitospinningden önce mikrop hücrelerinin tokalarla mekanik ayrışması ile takip edilir. Spermatojenik hücrelerin RNA BALIK için alternatif bir yöntem başka bir laboratuvarda geliştirilmiştir4. Bu yöntemde, 3D yöntemiyle tutarlı olarak, RNA FISH'in en iyi sonuçlarını elde etmek için permeabilizasyon adımının sabitleme adımından önce gelmesi gerekir.
Aşağıdaki protokol 3D slayt yöntemini açıklar ve nükleer nascent RNA'ların tespiti için olası bir uygulama olan Cot-1 RNA FISH'e bir örnek sağlar. Karyola-1 DNA'sı genomdaki tekrarlayan elementlerden oluşur. Burada, bir Cot-1 DNA probu, nascent transkriptlerinin bir intron ve UTR'sine melezlenmiştir, böylece çekirdek5,6'dakitranskripsiyonal olarak aktif bölgeleri tespit eder. Kromatin mimarisi arasındaki mekansal ilişkilerin detaylı incelenmesini sağlamak için 3D slaytlar çok yönlüdür ve immünofluoresans, DNA ve RNA FISH tekniklerinin bir kombinasyonuna uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Cot-1 DNA'sı&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>Stratagene Prime-It Fluor Floresan Etiketleme Kiti</td><td>Agilent</td><td>300380</td><td></td></tr><tr><td>Ringa balığı sperm DNA Çözeltisi</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>Etanol. 200 kanıt (mutlak)</td> <td>Pharmco-aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Formamid deiyonize</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sitrat tribazik dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Lifeblood Medical</td><td>77110-100</td><td></td></tr><tr><td>Leuconostoc spp.'den dekstran sülfat sodyum tuzu.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>A10491-01</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>BORULAR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Vektör Laboratuvarları H1200</td><td></td><td></td><td></td>ile VECTASHIELD Montaj Ortamı</tr><tr><td>Ribonükleozit-vanadil kompleksi</td><td>New England Biolabs</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin G-50 Sütunlar</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 3</td><td>Shandon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin Kavanoz</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost /Plus Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>4 kuyulu çanak</td><td>Fisher</td><td>12-566-301</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camı&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Hava inkübatörü</td><td>Devrim Niteliğinde Bilim</td><td>RS-IF-203</td><td></td></tr></tbody></table>

testis germ hücrelerinin Üç boyutlu kromatin mimarisini korumak için slayt hazırlama yöntemi

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Testis germ hücre farklılaşması sırasında nükleer kromatin yapısı dinamik olarak değişir. Aşağıda, farelerde bulunan testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin düzenini korumak için tasarlanmış bir yöntem açıklanmaktadır; bu yöntem üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak ad verilmiştir. Bu yöntemde, testis tübülleri doğrudan sitoplazmik malzemeyi uzaklaştıran bir permeabilizasyon adımı ve ardından nükleer malzemeleri düzelten bir fiksasyon adımı ile muamele edilir. Tübüller daha sonra ayrışır, hücre süspansiyonu sitospundur ve hücreler slaytlara yapışır. Bu yöntem subnükleer yapıların saptanmasında hassasiyeti artırır ve immünoresans, DNA ve RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve bu tespit yöntemlerinin kombinasyonu için geçerlidir. 3D slayt yönteminin olası bir uygulamasına örnek olarak, nascent RNA'ları algılamak için bir Cot-1 RNA FISH gösterilir. 3D slayt yöntemi, testis germ hücre farklılaşması sırasında kromatin yapısı, DNA ve RNA arasındaki mekansal ilişkilerin ayrıntılı olarak incelenmesini kolaylaştıracaktır.

3D slaydın temsili bir sonucu Şekil 2'de gösterilir. Bu deneyde Cot-1 RNA FISH, anti CBX1 ve φH2AX antikorları kullanılarak immünostaining ile birlikte nascent transkripsiyonunu tespit etmek için gerçekleştirildi. RNA FISH ve immünostaining'i birleştirmek için önce immünostaining yapıldı, ardından3'teaçıklandığı gibi RNA FISH . CBX1, XY vücudu (veya seks vücudu) adı verilen meiosisteki perisantronerik heterokromatin ve sessiz cinsiyet kromozomlarına lokalize olan bir heterokromatin proteinidir...

Buradaki materyal testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin yapısını korumak için geliştirilen bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak ad verilmiştir. Bu yöntem subnükleer yapıların tespiti için hassasiyeti artırır ve immünoresans, DNA ve RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) için geçerlidir.

Testis Germ Hücrelerinin Üç Boyutlu Kromatin Mimarisini Korumak için Slayt Hazırlama Yöntemi

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Bu üç boyutlu slayt hazırlama yöntemi, farelerin testis germ hücrelerinde gösterildiği gibi hücrelerin 3D kromatin düzenlemesini korur. İlk olarak, sitoplazmik materyalleri uzaklaştırmak ve antikorlar ve balık probları gibi boyama reaktiflerinin erişilebilirliğini artırmak için feröz tübüllere nüfuz edin. Nükleer malzemeleri sabitledikten sonra, germ hücrelerini forseps ile mekanik olarak ayırın ve numuneleri slaytlar üzerine sitozin.Ardından, stratejik olarak uygulandığında 3B slayt hazırlıklarından elde edilen sonuçları 3B olarak bir çekirdeği kaplamak için birden fazla Z kesitli veriler elde edin. COT kullanarak, bir RNA balığı, çekirdekteki transkripsiyonel olarak aktif bölgeleri tespit etmek için nükleer yeni oluşan RNA'ları gösterebilir. Bu yöntemi Massachusetts General Hospital'da gen laboratuvarındayken geliştirdim.O zamanlar, nacent'i tespit etmek için balık olarak da adlandırılan pamuk RNA floresan içgörüsünü hibridizasyona dönüştürmek için slayt hazırlama yöntemini optimize ettim. RNA. Pamuk probları, intron ve tls'deki tekrarlayan dizileri hibritleyebilir ve aktif transkripsiyon bölgesini görselleştirebilir. Pamuk RA balıkları, nükleer RNA dağılımının korunmasını gerektirir.Bu doğru hazırlık yönteminin kilit noktası, izasyon adımlarının fiksasyon adımından ilerlemesi gerektiğidir. Cy Plazmik arka planı çıkarmak için, PBS'de yırtılmış bir testisten OUS tübüllerini buz üzerinde çözün, beş ila 10 milimetre uzunluğunda birkaç parça tübülü %0,5 tritton X 100 ile 500 mikrolitre CSK tamponuna aktarın ve buz üzerinde altı dakika inkübe edin. Şimdi tüm tübülleri% 4 P-F-A-P-B-S çözeltisine aktarın, dört kuyulu bir tabağın bir kuyucuğunda oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.Daha sonra, tüm tübülleri PBS'de oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Kuluçka dönemleri sırasında bir cam sürgünün arka tarafındaki cyto spin ve cyto spin odalarını kurun, tüm tübülleri 30 mikrolitre PBS'ye aktarın. Ardından, tübülleri parçalara ayırmak için iki forsepsin uçlarını kullanın.Tübülleri iki forsepsin uçları arasına klipsleyerek ve forsepsleri yatay olarak çekerek tübülleri yatay yönde doğrayın. 30 mikrolitre PBS ekledikten sonra, süspansiyonu pipetleme ile karıştırın, ardından bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve PBS'yi toplam 1.3 mililitre hacme ekleyin. Şimdi cyto spin odalarının her birine 100 mikrolitre süspansiyon uygulayın. Sito.Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2000 RPM'de döndürün. Slaytları bir laboratuvar tezgahında PBS içeren bir coplan kavanozu kullanarak oda sıcaklığında birkaç dakika kurutun. Slaytları oda sıcaklığında beş dakika yıkayın.Ardından slaytları en az iki dakika boyunca% 70 etanole aktarın. 20 mikrolitrelik bir reaksiyonda 100 nanogram yakalanmış, 1D NA probu, 20 milimolar ribonükleotid vanadil kompleksi ve hibridizasyon tamponu ekleyin. Bir PCR makinesi kullanarak, 80 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin, ardından prea yapın.Kullanıma hazır olana kadar 42 santigrat derecede diz çökme adımı. Şimdi slaytları iki dakika boyunca %80 etanol içinde art arda kurutun, ardından iki dakika boyunca %100 etanol ile kurutun. Slaytları oda sıcaklığında laboratuvar tezgahında tamamen kurutun.Şimdi slaydı 42 santigrat derecede bir uç kutusu haznesine yerleştirin. Ardından, ön ihtiyaç problarını kısaca santrifüjleyin ve bunları doğrudan susuz slaytlara pipetleyin. 42 santigrat derecede en az altı saatlik hibridizasyon adımı için sürgünün üzerine yavaşça bir örtü kayması.Yıkama solüsyonlarını coplan kavanozlarda 42 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir tıraş bıçağı kullanarak bir su banyosunda önceden ısıtın, numuneleri çizmeden lamın kenarından kapak fişini çıkarın, slaytları kademeli olarak her biri beş dakika boyunca yıkama solüsyonuna daldırın. İki XSSC ve %50 form amid içeren ilk koplan kavanozu ile başlayarak, ardından iki XSSC ve %50 form amid içeren ikinci koplan kavanozu ile devam edin. Ve sonra iki XSSC içeren son iki kavanoz.Ardından numunelere 20 mikrolitre DPI montaj ortamı ekleyin ve bir kapak fişi yerleştirin. Kapak camına hafifçe bastırın ve ekstra montaj ortamını bir temizleme mendiliyle kurulayın. Bu deneyde, XY cisimciği immünohistokimyasına lokalize olan proteinlerin yeni ortaya çıkan transkripsiyonunu ve immün boyamayı aynı anda tespit etmek için bir RNA balığı yakalandı.Bu PACU'da spermatosit, heterokromatin proteini CCB X one'ı ve ayrıca XY gövdesi üzerinde histon varyantı H iki A X'in fosforile edilmiş bir formunu tespit etti. Elde edilen balık, hipotonik çözelti ile muamele edilmiş yüzey yayılımlarında e kromatik bölgelerde biriken bir sinyal yakaladı. Üç boyutlu kromatin yapısı bozulur ve tüm miyotik kromozom eksenleri tek bir Z düzlemi içinde yakalanabilir.Bununla birlikte, 3D slayt hazırlama, bu prosedürü takiben bozulmamış kromatin yapısını korur. Bu doğru hazırlama yöntemi, immünofloresan DNA ve RNA balıkları ve bu tespit yöntemlerinin kombinasyonu için geçerlidir.

slide-preparation-method-to-preserve-three-dimensional-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kromozomlar gibi lenfositler ya da deri fibroblast gibi canlı hücrelerden izole edilir ve insan ya da fare gibi organizmalardan elde edilebilir. Bu kromozom preparatları ayrıca rutin G-bantlama ve bu in situ hibridizasyon (FISH) floresan, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH), ve spektral karyotip (SKY) gibi moleküler sitogenetik işlemler için kullanılabilir.

Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık

Izole edilmesi ve faz kontrast ve floresan mikroskobu ile görüntüleme için Drosophila testis örnekleri (canlı ve sabit) hazırlanması için yöntemler burada tarif edilmiştir.

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

Biz İmmunosteyn, floresan in situ hibridizasyon, tüm montaj Arabidopsis thaliana ovüllerindeki kantitatif, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile takip DNA boyama için burada etkin ve güvenilir bir protokol sağlar. Bu yöntem başarıyla kromatin modifikasyonları ve nükleer mimarisi kullanılarak analiz edildi.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

Mayoz hangi gamet DNA ikileşmesi bir turu ve kromozom ayrışma birbirini izleyen iki tur üzerinden kurulan gelişimsel işlemidir. Memeli mayoz segregasyonun kromozom yayılır hazırlamak için bir teknik kullanarak incelenebilir. Burada, yüzey-yayılım çekirdeği fare spermatocytes üzerinden hazırlama yöntemi göstermektedir.

Fare Spermatocytes segregasyonun kromozom hazırlanması yayılır

Oogenesis memelilerde özellikle kromozom missegregation nedeniyle hataya, olduğu bilinmektedir. Bu el yazması için fare profaz, yaymak Kromatin hazırlama yöntemleri açıklar metafaz ı ve II sahnelenen yumurtalar. Bu temel teknikler Kromatin bağlı proteinler ve kromozom morfolojisi memeli oogenesis boyunca çalışma sağlar.

Kromatin fare oosit ilerleme profaz metafaz II analizi için hazırlıklar yaymak

Nükleer yüzey spreadleri, kekozis sırasında kromozom olaylarını incelemek için vazgeçilmez bir araçtır. Burada zebrabalığı spermatositlerinden profaz I sırasında meyotik kromozomları hazırlamak ve görselleştirmek için bir yöntem göstermek.

Zebrabalığı Spermatositlerinden Meiotik Kromozom Spreadlerinin Hazırlanması

Bu protokolün amacı, Drosophila meyozetik spermatositler kullanarak canlı ve sabit hücre mikroskobu ile bozulmamış dokudaki hücre bölünmesini analiz etmektir. Protokol, Drosophila larvaları ve erken pupalardan bütün, bozulmamış testislerin nasıl izole edilip, mikroskopi için nasıl işleyip monte edilebildiğini gösteriyor.

Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

Burada, konfokal mikroskopi için uygun ve aynı zamanda tekrarlanabilir ve güvenilir etiketlemeye izin vermek için Drosophila testislerinin tüm montaj hazırlığı ve immünostainingi için geliştirilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokolü, büyük S4-S5 spermatositleri üzerindeki kolokalizasyon deneylerinin 3D gösterimi ve niceliği ile göstermektedir.

Büyük Spermatositlerin 3D Konfokal Analizi için Tüm Kazdağları Drosophila Testlerinin İmmünostaining

Bu protokol, yapısal olarak korunmuş kromatin in situ içindeki replikasyon bölgelerinin yüksek çözünürlüklü haritalanması için, önceden gömülmüş EdU-streptavidin-Nanogold etiketleme ve ChromEMT'nin bir kombinasyonunu kullanan bir teknik sunar.

Elektron Tomografisi ile Ultrayapısal Olarak Korunmuş Kromatinde Görüntüleme Replikasyon Alanları

Bu, C. elegans gonad diseksiyonu ve ardından antikor boyama yoluyla immünofloresan için germline örnekleri üreten donma çatlağı veya DNA'yı görselleştirmek için basit DAPI boyama için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu protokol, bir araştırma laboratuvarında ve ders tabanlı bir lisans araştırma deneyiminde lisans öğrencileri için başarılı olmuştur.

C. elegans · İmmünofloresan ve DAPI Boyama için Gonad Diseksiyonu ve Dondurucu Çatlak

Sinapslardaki mayotik hatalar ve rekombinasyon, memeli oositlerinde yaygındır. Bu süreçlerde yer alan proteinlerin titiz analizi, oogenezin nasıl ve neden sıklıkla yanlış gittiğini anlamak için çok önemlidir. Burada sunulan teknikler, farelerde oosit kalitesini değerlendirmek için rekombinasyon ve sinapsların kapsamlı bir şekilde izlenmesine izin verir.

Sinapsis ve Rekombinasyonun Değerlendirilmesi için Fare Oositlerinden Mayotik Kromozom Yayılımlarının Hazırlanması

Öğrenin, fare testis germ hücrelerinde 3D kromatin yapısını koruyan slayt hazırlama yöntemini. Bu teknik, immunofluoresans ve FISH ile alt nükleer yapıların görüntülenmesini kolaylaştırır.

Testis Germ Hücrelerinin Üç Boyutlu Kromatin Mimarisini Korumak için Slayt Hazırlama Yöntemi

Daha fazla video keşfet