Testis Germ Hücrelerinin Üç Boyutlu Kromatin Mimarisini Korumak için Slayt Hazırlama Yöntemi

Bu üç boyutlu slayt hazırlama yöntemi, farelerin testis germ hücrelerinde gösterildiği gibi hücrelerin 3D kromatin düzenlemesini korur. İlk olarak, sitoplazmik materyalleri uzaklaştırmak ve antikorlar ve balık probları gibi boyama reaktiflerinin erişilebilirliğini artırmak için feröz tübüllere nüfuz edin. Nükleer malzemeleri sabitledikten sonra, germ hücrelerini forseps ile mekanik olarak ayırın ve numuneleri slaytlar üzerine sitozin.

Ardından, stratejik olarak uygulandığında 3B slayt hazırlıklarından elde edilen sonuçları 3B olarak bir çekirdeği kaplamak için birden fazla Z kesitli veriler elde edin. COT kullanarak, bir RNA balığı, çekirdekteki transkripsiyonel olarak aktif bölgeleri tespit etmek için nükleer yeni oluşan RNA'ları gösterebilir. Bu yöntemi Massachusetts General Hospital'da gen laboratuvarındayken geliştirdim.

O zamanlar, nacent'i tespit etmek için balık olarak da adlandırılan pamuk RNA floresan içgörüsünü hibridizasyona dönüştürmek için slayt hazırlama yöntemini optimize ettim. RNA. Pamuk probları, intron ve tls'deki tekrarlayan dizileri hibritleyebilir ve aktif transkripsiyon bölgesini görselleştirebilir. Pamuk RA balıkları, nükleer RNA dağılımının korunmasını gerektirir.

Bu doğru hazırlık yönteminin kilit noktası, izasyon adımlarının fiksasyon adımından ilerlemesi gerektiğidir. Cy Plazmik arka planı çıkarmak için, PBS'de yırtılmış bir testisten OUS tübüllerini buz üzerinde çözün, beş ila 10 milimetre uzunluğunda birkaç parça tübülü %0,5 tritton X 100 ile 500 mikrolitre CSK tamponuna aktarın ve buz üzerinde altı dakika inkübe edin. Şimdi tüm tübülleri% 4 P-F-A-P-B-S çözeltisine aktarın, dört kuyulu bir tabağın bir kuyucuğunda oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Daha sonra, tüm tübülleri PBS'de oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Kuluçka dönemleri sırasında bir cam sürgünün arka tarafındaki cyto spin ve cyto spin odalarını kurun, tüm tübülleri 30 mikrolitre PBS'ye aktarın. Ardından, tübülleri parçalara ayırmak için iki forsepsin uçlarını kullanın.

Tübülleri iki forsepsin uçları arasına klipsleyerek ve forsepsleri yatay olarak çekerek tübülleri yatay yönde doğrayın. 30 mikrolitre PBS ekledikten sonra, süspansiyonu pipetleme ile karıştırın, ardından bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve PBS'yi toplam 1.3 mililitre hacme ekleyin. Şimdi cyto spin odalarının her birine 100 mikrolitre süspansiyon uygulayın. Sito.

Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2000 RPM'de döndürün. Slaytları bir laboratuvar tezgahında PBS içeren bir coplan kavanozu kullanarak oda sıcaklığında birkaç dakika kurutun. Slaytları oda sıcaklığında beş dakika yıkayın.

Ardından slaytları en az iki dakika boyunca% 70 etanole aktarın. 20 mikrolitrelik bir reaksiyonda 100 nanogram yakalanmış, 1D NA probu, 20 milimolar ribonükleotid vanadil kompleksi ve hibridizasyon tamponu ekleyin. Bir PCR makinesi kullanarak, 80 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin, ardından prea yapın.

Kullanıma hazır olana kadar 42 santigrat derecede diz çökme adımı. Şimdi slaytları iki dakika boyunca %80 etanol içinde art arda kurutun, ardından iki dakika boyunca %100 etanol ile kurutun. Slaytları oda sıcaklığında laboratuvar tezgahında tamamen kurutun.

Şimdi slaydı 42 santigrat derecede bir uç kutusu haznesine yerleştirin. Ardından, ön ihtiyaç problarını kısaca santrifüjleyin ve bunları doğrudan susuz slaytlara pipetleyin. 42 santigrat derecede en az altı saatlik hibridizasyon adımı için sürgünün üzerine yavaşça bir örtü kayması

Yıkama solüsyonlarını coplan kavanozlarda 42 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir tıraş bıçağı kullanarak bir su banyosunda önceden ısıtın, numuneleri çizmeden lamın kenarından kapak fişini çıkarın, slaytları kademeli olarak her biri beş dakika boyunca yıkama solüsyonuna daldırın. İki XSSC ve %50 form amid içeren ilk koplan kavanozu ile başlayarak, ardından iki XSSC ve %50 form amid içeren ikinci koplan kavanozu ile devam edin. Ve sonra iki XSSC içeren son iki kavanoz.

Ardından numunelere 20 mikrolitre DPI montaj ortamı ekleyin ve bir kapak fişi yerleştirin. Kapak camına hafifçe bastırın ve ekstra montaj ortamını bir temizleme mendiliyle kurulayın. Bu deneyde, XY cisimciği immünohistokimyasına lokalize olan proteinlerin yeni ortaya çıkan transkripsiyonunu ve immün boyamayı aynı anda tespit etmek için bir RNA balığı yakalandı.

Bu PACU'da spermatosit, heterokromatin proteini CCB X one'ı ve ayrıca XY gövdesi üzerinde histon varyantı H iki A X'in fosforile edilmiş bir formunu tespit etti. Elde edilen balık, hipotonik çözelti ile muamele edilmiş yüzey yayılımlarında e kromatik bölgelerde biriken bir sinyal yakaladı. Üç boyutlu kromatin yapısı bozulur ve tüm miyotik kromozom eksenleri tek bir Z düzlemi içinde yakalanabilir.

Bununla birlikte, 3D slayt hazırlama, bu prosedürü takiben bozulmamış kromatin yapısını korur. Bu doğru hazırlama yöntemi, immünofloresan DNA ve RNA balıkları ve bu tespit yöntemlerinin kombinasyonu için geçerlidir.