Bluetongue Virüs karşı Roman Antiviraller belirlenmesi için Tahliller

Bu prosedürün genel amacı, CPE bazlı hücre canlılığı testini kullanarak mavi dil virüsüne veya BTV'ye karşı küçük moleküllü antiviralleri tanımlamak ve karakterize etmektir. Bu, ilk olarak hücre titresi kızdırma reaktifi ile Sitopatik etki veya CPE bazlı test kullanılarak bir antiviral bileşik kütüphanesinin taranmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, antiviral etkinlik doğrulanır ve seçilen antivirallerin sitotoksisitesi, doz yanıt testi kullanılarak değerlendirilir.

Son olarak, olası etki mekanizmalarına yol açan seçilmiş antivirallerin olası viral yaşam döngüsü aşamasını belirlemek için ekleme zamanı testi gerçekleştirilir. Sonuç olarak, doz yanıt testine ve ekleme testinin zamanına bağlı olarak güçlü antiviral CIE ve düşük sitotoksisiteye sahip yeni antiviralleri gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu nedenle, bu tekniğin bir plak tahlilinde TCI D 50 testi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu tekniğin, enfekte hücre hücrelerinde ölçülebilir CP'yi indükleyen glüten virüsü de dahil olmak üzere belirli bir virüse karşı antivirüsü taramak ve kategorize etmek için ölçülebilir yöntemde hassas, sağlam ve yüksek oranda üreme sağlamasıdır. Kuyu başına 5.000 hücrede 20 mikrolitre hücreyi 384'e tohumlayın.

Mikroplaka, plakaya tam olarak yapışmalarını sağlamak için hücreleri iki ila üç saat inkübe eder, daha sonra her bir oyuğa 10 mikromolar nihai konsantrasyonda antiviral bileşikler ekleyin ve tamamen karıştırın. Plak saflaştırılmış ve çoğaltılmış BTV'yi istenen titreye seyreltmek için tahlil ortamı kullanın ve kontrol için her bir oyuğa belirtilen MOI ile beş mikrolitre BTV ekleyin. Beş mikrolitre tahlil ortamı ekleyin, tahlil plakasını içeren ıslak bir kutuyu inkübatöre koyun ve enfekte olmuş hücreleri 72 saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ve% 80 ila 95 nem ile inkübe edin.

Daha sonra tahlil plakasını inkübatörden çıkarın, daha sonra çözün ve CTG tamponunu ve Liyofilize CTG substratını oda sıcaklığına dengeleyin. Daha sonra, liyofilize enzim substratını ve tampon reaktifini üreticinin talimatlarına göre karıştırarak homojen CTG reaktif çözeltisini sulandırın. Tahlil plakalarını 15 dakika boyunca oda sıcaklığına dengeledikten sonra, her bir kuyucuğa 25 mikrolitre CTG reaktifi eklemek için bir dağıtıcı kullanın, karanlıkta 15 dakika inkübe edin, ardından 0.1 saniyelik bir entegrasyon süresine sahip çok modlu bir okuyucu kullanmadan önce ışıldayan sinyalleri ölçmek için tohum 5.000 BSR hücresi Antiviral etkinlik testi için 20 mikrolitre ve 25 mikrolitre kullanarak doz yanıtı testi için 384 kuyulu mikroplakada kuyu başına 5.000 BSR hücresi tohum sitotoksisite testi.

İki ila üç saatlik bir inkübasyondan sonra, burada gösterildiği gibi tahlil başına her bir bileşik konsantrasyonu için sekiz kopya tahsis edin. İlk sütunu bileşik veya virüs eklemeden pozitif kontrol olarak atayın ve son sütunu sadece antiviral etkinlik testi için virüs ekleyerek negatif kontrol olarak atayın, bileşikleri test ortamında 50 mikromolar olacak şekilde seyreltin ve ikinci sütuna 20 mikrolitre ekleyin. Sekiz kanallı yarı otomatik pipet kullanarak.

Bileşiği beş kez 25 mikromolar konsantrasyona kadar karıştırın. Daha sonra, ikinci kolondaki karışımın 20 mikrolitresini üçüncü kolona aktarın ve 12.5 mikromolar konsantrasyonla sonuçlanacak şekilde iyice karıştırın. Bunu iki kez tekrarlayın.

0.04 mikromolar nihai konsantrasyona sahip olacak olan 11. sütuna kadar seri seyreltme. Daha sonra, yalnızca hücre pozitif kontrolü olarak birinci sütuna beş mikrolitre ortam ve yalnızca bir BTV enfeksiyonu olarak sütun 12'ye BTV'nin oyuğu başına beş mikrolitre ekleyin. Negatif kontrol, sitotoksisite testi için ikinci sütundan sütun 11'e kadar BTV oyuğu başına beş mikrolitre ekleyin, bileşiği 200 mikromolar başlangıç konsantrasyonuna seyreltin.

İkinci sütuna bileşik kuyusu başına 25 mikrolitre ekleyin ve konsantrasyonu 100 mikromolar seviyeye getirmek için beş kez karıştırın. 25 mikrolitreyi ikinci kolondan komşu kolon üçe aktararak iki katlı seri seyreltmeyi gerçekleştirin ve kolon 12'den devam edin. Sütun 12'yi karıştırdıktan sonra, karışımın 25 mikrolitresini aspire edin ve atın.

Birinci sütun, hem antiviral hem de sitotoksisite tahlilleri için sadece hücre kontrolüdür. Tahlil plakasını içeren ıslak bir kutuyu 72 saat boyunca inkübatöre koyun ve daha sonra plakayı çıkarın. Ardından hücre canlılığını ölçmek için CT G kitini kullanın.

Her bir bileşik konsantrasyonu için ortalama değeri, standart sapma katsayısını, varyasyonları ve hücre canlılığının yüzdesini hesaplamak için bir biyoistatistik ve grafik yazılımı kullanın ve her bir bileşiğin EC 50 ve CC 50'sini belirlemek için doğrusal olmayan regresyon analizi yapın. 384'ün birinci ila 24'ündeki sütunda 15 mikrolitrede kuyucuk başına 5.000 hücreyi tohumlayarak ekleme veya TOA tahlili zamanına hazırlanın. Her bileşik için iyi mikroplaka.

Her zaman noktası için sekiz kopya ile 24 sütunun tümünü kullanın. Tahlil ortamının kuyusu başına 10 mikrolitre ekleyerek, sütun 24'ü yalnızca BTV enfeksiyonu olarak işaretleyerek birinci sütunu yalnızca hücre kontrolü olarak atayın. 0.01'lik bir MOI'de test ortamı kuyusu başına beş mikrolitre ve virüs oyuğu başına beş mikrolitre ekleyerek negatif kontrol.

Kuyucuk başına 25 mikrolitrelik bir son hacimde, enfeksiyondan sonra farklı saatlerde antiviral etkinlik değerlendirme sütunları olarak iki sütundan 22'ye kadar çift sayılı sütunları seçin veya bu sütunlarda HPI, farklı HPI'de 0.01'lik bir MOI'de BTV kuyusu başına beş mikrolitre ile hücreleri enfekte edin, ayrıca belirtilen eksi iki için oyuk başına 25 mikrolitrelik bir nihai hacimde seyreltilmiş bileşik kuyusu başına beş mikrolitre ekleyin ve eksi bir HPI. Sıfır HPI için BTV enfeksiyonundan önce bileşiği BSR hücrelerine ekleyin, bileşiği ve BTV'yi aynı anda kültüre ekleyin. Paralel olarak, üçten 23'e kadar olan tek sayılı sütunları, bu sütunlardaki farklı zaman noktalarına karşılık gelen yalnızca bileşik denetimler olarak belirleyin.

Kuyucuk başına 25 mikrolitrelik bir nihai hacimde, tahlil ortamı kuyusu başına beş mikrolitre ve seyreltilmiş bileşik oyuğu başına beş mikrolitre ekleyin. Hücreleri inkübatörde 72 HPI'ye inkübe ettikten sonra, tahlil plakasını çıkarın ve hücre canlılığını belirlemek için hücre titresi kızdırma kitini kullanın. Son olarak, ortalama değeri belirlemek için çok modlu okuyucu aracılığıyla elde edilen ışıldayan sinyalleri işleyen bir yazılım kullanın.

Canlı hücrelerde hücresel A TP'yi ölçmek için CPE testini kullanan her tedavi için S-T-D-E-V CV ve koruma hücresi canlılığının yüzdesi, daha önce güçlü antiviral etkinlik, düşük toksisite ve yüksek yüksek seçiciliğe sahip birkaç umut verici kurşun bileşiği tanımladık. Örneğin, 0 5 2 bileşiğinin, her ikisi de tipik regresif eğriler gösteren 0.27 artı veya eksi 0.12 mikromolar EC 50'ye ve 82.69 mikromolar CC 50'ye sahip olduğu belirlenmiştir. Doğrusal olmayan regresyon analizi kapsamında, C 0 5 2'nin SI 50'sinin, EC 50 ve CC 50 değerlerine dayanarak 306'nın nano molar ölçekli antiviral etkinliği, düşük toksisitesi ve sonuç olarak yüksek SI 50'nin, C 0 5 2'nin burada görüldüğü gibi BTV'ye karşı güçlü ve seçici bir antiviral olabileceğini gösterdiği belirlendi. hücreler 10 farklı C 0 5 2 konsantrasyonu varlığında 0.01 MOI'de BTV ile enfekte edildi ve hücre canlılığı 72 HPI'de belirlendi.

CTG kitini kullanarak, her veri noktası beş kopyadan gelen araçları ve SD'yi temsil eder. TOA testi, bileşikler tarafından hedeflenen viral yaşam döngüsünün olası aşamalarını belirlemek için kullanıldı. BTV enfeksiyonundan bir veya iki saat önce C 0 5 2 eklendiğinde, antiviral etkinlik bu şekilde görüldüğü gibi nano molar ölçekte kalmıştır.

Ek olarak, 32 ve 48 HPI'de C 0 5 2 eklendiğinde hücre canlılığı daha da azaldı, bu da C 0 5 2'nin virüs girişi gibi viral yaşam döngüsünün erken aşamasının ötesinde hareket edebileceğini gösteriyor. BTV viral replikasyonunun ilk döngüsü genellikle 24 HPI içindeki enfekte hücrelerde tamamlandığından, sonuçlarımız C 0 5 2'nin virüs replikasyonu, paketleme, olgunlaşma ve çıkış gibi BTV viral yaşam döngüsünün geç aşamalarında hareket edebileceğini düşündürdü. Bu arada, C 0 5 2'nin viral yaşam döngüsünün sonraki aşamalarında işlev gören konakçı hücresel makine üzerinde etkili olması da mümkündür.

Bu videoyu izledikten sonra, enfeksiyon sonrası ölçülebilir CPE'ye neden olan virüslere karşı potansiyel antivirüsü tanımlamak ve kategorize etmek için CPE en iyi makalesini nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.