Eksplantasyon Kültüründe Diş mikropların Geliştirme takiben için Dilim Kültür Yöntemi

Bir sonraki deneyin genel amacı, birkaç gün boyunca diş gelişimini takip etmektir. İn vitro explan kültür, bu, ikinci bir adım olarak gelişmekte olan diş mikroplarını ortaya çıkarmak için fetal farelerin gelişmekte olan mandibulasının canlı dilimler halinde diseke edilmesiyle elde edilir. Dilimler seçilir, bir kültür ortamı üzerinde filtrelere yerleştirilir ve gelişime izin vermek için inkübe edilir.

Daha sonraki dilimler, kültür periyodu boyunca hücresel hareketi izlemek için bir soy izleyici ile etiketlenir, diş dokularının eksplan kültür sırasında geliştikçe dinamik doğasını gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin konvansiyonel eksplant kültürüne göre en büyük avantajı, diş taşları gibi içsel olarak gelişen organların, çevredeki doku bağlamında gelişimleri boyunca gözlemlenebilmesidir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü makinenin kurulumu veya dokunun oryantasyonu yanlış olduğunda doğrama ve seçim adımları zor olabilir.

İlk olarak, 500 mililitre ileri ECCO'lar modifiye kartal ortamı F 12'ye %1 glutamat ve %1 penisilin streptomisin ekleyerek embriyonik organlar için diseksiyon ve kültür ortamını hazırlayın. Daha sonra, Takahashi Sumi'nin video makalesinde anlatıldığı gibi, farelerin E 11.5 ve E 15.5 gelişim aşamaları arasındaki embriyolarını inceleyin ve bunları taze ortam içeren bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, yeni bilenmiş steril bir tungsten iğnesi kullanarak embriyoların başını ayırın ve kafaları buz üzerinde önceden soğutulmuş orta dereceli taze bir tabağa aktarın.

Daha sonra ağız boşluğuna bir iğne yerleştirerek ve geçici olarak başın arkasına doğru keserek mandibulaları kafalardan izole edin. İzole edilmiş mandibulaları, bölümlere ayrılmadan önce önceden soğutulmuş ortamda buz üzerinde saklayın. Mandibula dokusunu dilimlemeden önce, doku doğrayıcının montaj diskini ve bıçağını %70 etanol ile temizleyin ve bıçağın montaj diski ile aynı hizada olduğundan emin olun.

Düştüğünde, yaklaşık 200 mandibula dilimlendikten sonra bıçağın değiştirilmesi, numunenin yaşına göre kesme mesafesinin 200 ila 400 mikrometre arasında ayarlanması ve diş germinin izolasyonunun gerekli olduğu bir E 14.5 embriyosu için tüm diş germinin gerekli olup olmadığına bağlı olarak 250 mikrometrelik bir kesme mesafesi kullanılır. Daha sonra, bir mandibulayı plastik montaj diskine aktarın ve gelişmekte olan dil önden enine yönde olacak şekilde düzenleyin. Kesici dişleri izole etmek için azı dişlerini incelerken, mandibuladan sagital dilimler alın.

Doğru yönlendirildikten sonra, fazla ortamı dokunun etrafından çıkarın. Filtre kağıdı kullanarak, bu, montaj diski üzerindeki yerine sabitleyen bir mandibulayı hafifçe hareket ettirecektir. Filtre kağıdı ile kuruduktan hemen sonra, diski doğrayıcının dairesel paslanmaz çelik tablasına yerleştirin.

Ardından bıçak kuvvetini maksimuma ayarlayın, makineyi açın ve başlat düğmesine basın. Tabla otomatik olarak soldan sağa hareket ederken, aynı zamanda bıçağı taşıyan doğrama kolu dakikada 200 vuruşa kadar kaldırılıp düşürülür. Mendil tamamen dilimlendikten sonra makineyi kapatın.

Bıçak kolunun yükseltilmiş konumda olduğundan emin olun ve ardından diski çıkarın. Parmaklarınızı bıçak kolunun altına koymadığınızdan veya makineyi gözetimsiz bırakmadığınızdan emin olun. Mendil doğrarken, aşırı kurumayı önlemek için montaj diskini alın ve hemen disk üzerindeki dilimlere orta ekleyin.

Daha sonra bir tungsten iğnesi veya pipet kullanarak dilim dokusunu diskin altından dikkatlice çıkarın ve bunları orta büyüklükte küçük bir Petri kabına pipetleyin. Daha sonra, bir iğne kullanarak tek tek dilimleri ayırın ve ardından stereo mikroskop altında ilgilenilen alanı içeren doku dilimlerini seçin. Seçilen dilimleri taze, orta boy kültür kaplarına yerleştirin, paslanmaz çelik düz dokuma levhalardan dört santimetreye 1,5 santimetre ölçülerinde şeritler keserek kültür sistemi için metal ızgaralar hazırlayın.

Ardından, standart bir sabit delgeç kullanarak merkezde bir delik açın ve kenarları, ızgara merkezi kuyu boyunca düz bir şekilde oturacak ve tabağın dibine paralel olacak şekilde bükün. Izgaralar doğru bir şekilde şekillendirildikten sonra, kullanmadan önce bir otoklavda sterilize edin. Daha sonra, dehidrasyonu önlemek için dış kuyuya iki mililitre otoklav suyu ekleyerek merkezi kuyu organ kültürü kaplarını kültür için hazırlayın.

Ardından tabağın ortasına steril bir metal ızgara yerleştirin. Izgaradaki deliği kapatacak kadar büyük olacak şekilde gözenek boyutu 0,4 mikrometre olan bir parça şeffaf polietilen tereftalat membranı kesin. Ardından, soy takibi isteniyorsa, kesilen zarı seçilen bir mandibula dilimi ile tabağa yerleştirin.

İlk olarak, camı bir iğne çektirmesi ile çizerek bir cam kılcal iğne hazırlayın. Daha sonra iğnenin ucunu kırın ve ucunu dai eye veya dai o gibi lipofilik bir boya çözeltisine yerleştirin ve kılcal hareketle boya çözeltisinin bir kısmını çekin. Birkaç dakika sonra, doldurulmuş iğneyi bir tutucuya yerleştirin ve bir ağız Aspiratörüne takın.

İğnenin ucunu, burada gösterilen diş folikülü gibi etiketlenecek alana değecek şekilde kültür ortamına yerleştirin. Daha sonra doku üzerine az miktarda boya sürün. Ardından, dilimi bir floresan mikroskop aşamasına aktarın ve dilimin başarıyla etiketlendiğini kontrol edin.

Başarılı bir şekilde etiketlendikten sonra, dilimi zarın üzerine dikkatlice kaldırın ve ardından zarı, ortası düzleştirilmiş olarak ortamdan dışarı aktarın. Daha sonra filtreyi, ızgaranın ortasındaki dairesel deliğin üzerine, ortam seviyesi zar seviyesine gelene kadar kuyuya yaklaşık bir mililitre kültür ortamında yerleştirin. Bu noktada, ortama herhangi bir protein veya küçük molekül inhibitörü ekleyin.

Ayrıca, en iyi fotoğrafçılık için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak sıfırıncı günde morfolojinin bir kaydı için dilimi görüntüleyin, dilimleri alttan bir ışık kaynağı ile görüntüleyin. Bulaşıkları 37 santigrat derecede %5 karbondioksit içeren nemli bir atmosferde tutun ve ortamı düzenli aralıklarla iki ila üç günde bir değiştirin. İlerlemeyi izlemek için kültürleri görüntülemeye devam edin.

Burada, boya göz floresan boyası ile etiketlenmiş ilk azı dişi diş folikülünün gelişimini belgeleyen bir dizi görüntü gösterilmektedir. Dilim, bir farenin mandibulasından E 14.5'te kesilen 250 mikron kalınlığında bir ön dilimdir. Siyah noktalarla çizilen diş, sıfırıncı günde kapak aşamasında başlar.

Dördüncü günde, diş tohumu çan aşamasına ulaşmıştır ve diş folikülü hücrelerinin, gelişmekte olan dış minenin etrafında bir yay şeklinde yayıldığı görülür. Epitel Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik embriyodan son kültüre kadar üç saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kültürdeki organların gelişimini nasıl başarılı bir şekilde görselleştireceğinizi iyi anlamalısınız.