Name: Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis Erişkin Farelerde Cam Omurilik Windowsu implante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Öğrenin, erişkin farelerde deneysel otoimmün ensefalomiyeliti (EAE) incelemek için cam omurilik penceresi implantasyonu yöntemini. İki foton mikroskobisiyle kronik optik erişim sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

C. Ricard, M-C'ye teşekkür ederiz. Yararlı tartışmalar için Amoureux, A. Jaouen ve S. Meijia-Gervacio; M. Hocine ve C. Meunier ve teknik destek için IBDML'nin hayvan ve PicSIL görüntüleme tesislerinin personeli. Bu çalışma, Centre National de la Recherche Scientifique'den kurumsal bir hibe ve Association de Recherche sur la Sclérose en Plaque (ARSEP) (G.R. ve K.K.F), Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC), Fédération de Recherche sur le Cerveau (FRC) Institut de Recherche sur la Moelle Epinière (IRME) (FD'ye) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir. K.K.F. bir ARSEP bursu tarafından desteklendi. Görüntüleme, IBDML'nin PIcSIL görüntüleme tesisinde yapıldı.

1. Pencere ve Destek Yapısı Hazırlığı
<ol>
	<li>Pencere hazırlığı - implantasyon için çeşitli boyutlarda (genişlik = 1.8-2.2 mm; uzunluk = 4.5-5.2 mm) birkaç pencere hazırlayın.
	<ol>
		<li>Kapak camını kesmek için modifiye edilmiş matkap çapağının yapılması - bol miktarda diş çimentosu kullanarak bir şafta bir matkap çapağı takın (bizim durumumuzda, eski Bulldog kelepçeleri). Daha kolay kullanım için çapağın mile göre ~45° olduğundan emin olun. 
		Not: elmas çiziciler ayrıca kapak camını kesmek için de iyi çalışır.</li>
		<li>Slayt-A yapma - standart bir mikroskop lamı kullanarak, cetveli camdan görebilmeniz için slaydın altına kısa bir parça cetvel kağıdı (~ 2 cm) bantlayın. Ardından, bir sonraki adımda kapak camı için bir fikstür görevi görmesi için cetvelin 0 mm işaretinin kenarı boyunca bir parça bant yerleştirin.</li>
		<li>Modifiye edilmiş matkap çapağı, slayt-A ve modifiye edilmemiş bir mikroskop lamı (slayt-B) kullanarak, bir parça kapak camını (no. 1.5 kalınlık) slayt-A üzerindeki 0 mm işaretine yerleştirin. Kapak camını yerinde tutmak ve amaçlanan kesim çizgisi için bir aparat olarak kullanmak için kayar B'yi kullanın. Kapak camını yaklaşık 5 x 22 mm'lik uzun bir dikdörtgen şeklinde kesin. Kesilen camı 90° döndürün ve dikdörtgeni ~2 x 5 mm'lik daha küçük dikdörtgen şeklinde kesin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zımba modifikasyonları - pencere odasını omurlara desteklemek ve sabitlemek için iki modifiye zımba implante edilecektir (bkz. bölüm 2.7-8).
	<ol>
		<li>Standart küçük bir zımba kullanarak (taç = 8 mm; bacak = 4 mm), tepenin ortasını bacakların uçları neredeyse birbirine değecek şekilde ~90° bükün.</li>
		<li>Bacakların uçlarını yarı noktada ~45° dışa doğru bükün, böylece bacakların distal yarısı paralel olur.</li>
		<li>Bacakların distal yarısını, zımba düzlemine göre ~ 30 ° yukarı doğru bükün. Modifiye edilmiş zımbaları sterilizasyon için ameliyattan önce etanole yerleştirin. 
		Not: Zımbalar ayrıca etilen oksit kullanılarak sterilize edilebilir veya otoklavlanabilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ataş modifikasyonları - haznenin bir parçası olarak implante edilmek (bkz. bölüm 2.9-10) ve ameliyat ve görüntüleme için bir tutma klipsi görevi görmek üzere modifiye edilmiş bir ataş hazırlayın.
	<ol>
		<li>Standart 25 mm'lik bir ataş kullanarak, uzun bir U şekli bırakarak küçük kıvrımı çıkarın.</li>
		<li>Pense veya iğne sürücüleri kullanarak, uçları paralel tutarken dirsek çapını ~ 2 mm'ye düşürün.</li>
		<li>Uçları dirsekten yaklaşık 8-10 mm uzakta ~90° dışa doğru bükün. Düz durması için gerekli ayarlamaları yapın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pencere İmplantasyonu
Not: Tüm cerrahi ve hayvan bakım prosedürleri Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Fransa Ulusal Hayvan Çalışmaları Komitesi (yetki no. 13.300) tarafından onaylanmıştır.
<ol>
	<li>Fareyi uyuşturun (Ket / Xyl; indüksiyon dozu: 120 mg / kg, 12 mg / kg; ek doz, 40 mg / kg, 4 mg / kg), gözlere göz merhemi sürün.</li>
	<li>Sırtını yaklaşık ~ 2 cm genişliğinde ve ~ 5 cm uzunluğunda, göğüs kamburu merkezli olarak tıraş edin ve açıkta kalan cildi iyot sabunu ve ardından iyot çözeltisi kullanarak temizleyin. Eldivenleri %90 etanol püskürterek temizleyin. </li>
	<li>Mendil makası kullanarak sırt derisini T11 ila L1 (~ 2 cm) omurları üzerinden uzunlamasına kesin. Bir neşter kullanarak, T11'den L1'e kadar olan spinöz ve enine işlemler arasında bilateral uzunlamasına kesiler yapın. Not: Eldivenler veya aletler hayvanın kürküne veya derisine temas ederse, eldivenleri veya aleti %90 etanol veya Germ-X gibi soğuk bir sterilizatör kullanarak yeniden temizleyin.</li>
	<li>Fareyi spinal çatal stereotaksik içinde askıya alın - Sağ üst spinal çatalı yerine sıkıştırarak başlayın. Adson forseps kullanarak T11'i kavrayın ve T11 enine işlemi sabit omurga çatalı üzerine yerleştirin. Omuru yerinde tutarken, kontralateral transvers işlem altında kontralateral spinal çatalı sabitleyin.</li>
	<li>Adım 2.4 ile aynı prosedürü kullanarak, L1'i omurga çatalı içinde konumlandırın.</li>
	<li>Bir neşter (no. 23) kullanarak, laminaların net bir şekilde görülebilmesi için T11'den L1'e kadar olan spinöz ve enine süreçler arasındaki kasları nazikçe kazıyın. T11'in pediküllerinin daha iyi bir görünümü için, enine işlemin ucundan rostral olarak çıkıntı yapan tendonu kesin.</li>
	<li>Modifiye edilmiş zımbaları PBS ile durulayın ve zımbaların uçlarını T11 ve L1'in vertebral pediküllerine lateral olarak yerleştirin ve uçlar arasındaki mesafeyi pediküllere hafifçe değecek şekilde ayarlayın. 
	Not: Ameliyat sonrası iltihabı azaltmak ve pencere netliğini artırmak için yalnızca deksametazon (% 0.1), penisilin (1.000 U / ml) ve streptomisin (1 mg / ml) içeren PBS kullanın.</li>
	<li>Zımbaları her yerleştirme noktasında küçük bir damla siyanoakrilat ile yerine yapıştırın ve fareyi omurga çatallarından çıkarın.</li>
	<li>Cildin kesik kenarlarına ve temizlenmiş omurların etrafındaki açıkta kalan kaslara ince bir tabaka siyanoakrilat uygulayın, omurları yapıştırmamaya dikkat edin. Modifiye edilmiş ataşın uçlarını, implante edilmiş zımbaların çıkıntılı bölümlerinin altına girecek ve izole edilmiş vertebral kolonun uzun eksenine paralel olarak dinlenecek ve bu pozisyonda kalacak şekilde bükün.</li>
	<li>Deri-kas arayüzünden başlayarak, açıkta kalan omurlar hariç tüm açıklığı kaplayacak şekilde birkaç kat diş çimentosu uygulayın ve ataşı diş çimentosunun içine güvenli bir şekilde yerleştirdiğinizden emin olun.</li>
	<li>Diş çimentosu sertleştikten sonra (5-15 dakika), fareyi implante edilen ataşın açıkta kalan kısmından 'klips tutucuya' takın. Forseps kullanarak, açıkta kalan omurların spinöz süreçleri ve laminaları arasındaki kas ve diğer yumuşak dokuyu çıkarın. 
	Not: Klip/hazneye baskı yapmadan ataşın açıkta kalan kısmını güvenli bir şekilde kavrayabilen ve ameliyat boyunca fareyi yeniden yönlendirmek için manevra yapabilen herhangi bir cihaz 'klips tutucu' olarak kullanılabilir.</li>
	<li>Kemik çıkarma matkabını kullanarak, T12 ve T13'ün laminalarını iki taraflı olarak inceltin. Sırt kemiğini çıkarmak için, omurga sürecini künt forseps ile kavrayın ve omuriliğe doğru aşağı doğru kuvvet uygulamamaya dikkat ederek kaldırın. Kemik kolayca çıkmazsa, spinöz süreç kolayca çıkarılana kadar laminaları inceltmeye devam edin.</li>
	<li>Kemik çıkarma matkabını kullanarak, pencere için bir destek yapısı oluşturmak üzere omurların yan kenarlarını şekillendirmeye devam edin. Künt forseps kullanarak dura mater'e dokunan tüm küçük kemik parçalarını nazikçe çıkarın. PBS kullanarak dura mater'in nemini koruduğunuzdan emin olun.</li>
	<li>Laminektomi açıklığından biraz daha geniş olan hazırlanmış pencerelerden birini seçin ve açıkta kalan kemiğe ne kadar iyi dayandığını test edin. İdeal olarak, pencere her iki omur üzerinde iki taraflı olarak duracaktır, böylece pencerenin ortası dura mater'e temas edecektir (Şekil 1a). Bununla birlikte, pencere, pencereyi omuriliğe doğru iterken bile omuriliği sıkıştırmamalıdır. Pencere dengesizse veya duranın üzerinde duruyorsa, adım 2.13'ü tekrarlayın.</li>
	<li>Laminektomiden memnun kaldığınızda, duranın kurumasını önlemek için PBS'ye batırılmış küçük bir parça otoklavlanmış doku kağıdını omuriliğe yerleştirin ve fareyi bir kenara koyun.</li>
	<li>Pencerenin temizlenmesi - pencereyi birkaç saniye boyunca bir pencere temizleyici solüsyonuna yerleştirin. Bir parça mikroskop merceği mendili kullanarak pencereyi kurulayın. Cerrahi mikroskop ile pencerenin temiz olduğunu doğrulayın ve temiz değilse temizleme işlemini tekrarlayın. Adım 2.19'da pencerenin hızlı bir şekilde alınması ve yerleştirilmesi için pencereyi kolay erişime sahip temiz bir alana yerleştirin.</li>
	<li>Fareyi alın ve kağıt mendili çıkarın. Künt forseps kullanarak duradaki kalıntıları nazikçe temizleyin ve duranın hafifçe yapışkan olana kadar kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Silikon (Kwik-sil) karıştırıcı borusunu hızla doldurun ve uçtan kabarcık çıkmayana kadar silikonu temiz bir slayt üzerine sıkın. Açıkta kalan omuriliğin orta hattı boyunca hemen küçük bir silikon boncuk uygulayın.</li>
	<li>Kör forseps kullanarak temizlenmiş pencereleri alın ve hemen silikonun üzerine yerleştirin. Künt forsepsleri kullanarak, silikonu pencerenin kenarlarına yaymak için pencereye az miktarda basınç uygulayın ve ~ 1 dk. 
	Not: Karıştırmadan önce, silikon 27 ° C'nin altında saklanmalıdır, aksi takdirde kürlenme süresi önemli ölçüde artabilir ve pencereye veya malzemeye yapışmaz ve bu da optik netliğin azalmasına neden olur.</li>
	<li>Penceredeki basıncı yavaşça boşaltın. Pencere hareket etmezse, hemen adım 2.21'e geçin. Bununla birlikte, basınç serbest bırakıldığında pencere yükselirse (yani omurlar hareket ederse), yerinde tutmak için pencere üzerindeki basıncı korurken adım 2.21'e geçin.</li>
	<li>Pencerenin siyanoakrilat rostral ve kaudalini uygulayın. Siyanoakrilat pencerenin rostral ve kaudal kenarlarını kaplamıyorsa, sıvı siyanoakrilatın bir kısmını bu kenarlardan geçirmek için bir kürdan kullanın. Ardından, yapıştırıcıyı çevredeki tüm kasları kaplayacak şekilde pencerenin yan kenarları boyunca yönlendirin (Şekil 1a). Not: Siyanoakrilat, pencerenin dış kenarlarının yüzeyini kaplamalıdır. Çok fazla siyanoakrilat optik netliği tehlikeye atabilir, yeterli siyanoakrilat olmaması silikon ile pencere arasında hava kabarcıklarına neden olur.</li>
	<li>Siyanoakrilatı korumak ve odanın yapısal bütünlüğünü artırmak için, siyanoakrilat ile kaplı tüm bölgelere diş çimentosu uygulayın (Şekil 1a). Siyanoakrilatta olduğu gibi, rostral ve kaudal kenarlardan başlayın ve diş çimentosunu pencerenin kenarları boyunca yönlendirmek için küçük bir tahta çubuk kullanın.</li>
</ol>
3. Ameliyat Sonrası Bakım, EAE İndüksiyonu ve Pencere Bakımı
<ol>
	<li>Deksametazon (0.2 mg / kg) ve Rimadyl (5 mg / kg) s.q. pelvik bölgeler üzerinde. Fareyi iç içe geçme malzemesiyle birlikte sıcak bir kafese (~26 °C) aktarın. Fareler tamamen hareketli olmalı, kafeslerini keşfetmeli ve anestezinin etkileri tamamen azaldıktan sonra (genellikle 2-3 saat) tımar etmelidir. Hayvanları tek tek barındırın ve ilk 1-2 gün boyunca yiyecek ve suya kolayca erişebildiklerinden emin olun. Fare anesteziden iyileşmeye başladığında, buprenorfin (0.05 mg / kg) s.q enjekte edin. Anesteziden tamamen iyileştikten sonra, fare hiçbir ağrı belirtisi göstermemelidir. Not: Anesteziden tamamen kurtulduktan sonra, herhangi bir ağrı veya anormal motor aktivite belirtisi, pencerenin doğru şekilde implante edilmediğini gösterir.</li>
	<li>Ameliyattan sonraki ilk 10 gün boyunca her 2 günde bir Deksametazon (0.2 mg / kg) ve Rimadyl (5 mg / kg) enjekte edin (Şekil 1a). Farelere pencereli enjekte etmek için, hayvanı bir indüksiyon odasında izofluran ile hafifçe sakinleştirin (1-2 dakika boyunca havada ~% 1.75 izofluran). Fareyi odadan çıkarın ve hemen ilaçları enjekte edin. Fare <1 dakika içinde tamamen uyanık olmalıdır 
	Not: İmplante edilmiş pencerelere sahip fareleri tırmalamayın çünkü bu, cildin implanttan ayrılmasına neden olabilir. Farelere i.p. sedasyon olmadan, ön ayaklarıyla bir kafes kapağı tutmalarına ve arka ayaklarını nazikçe kaldırmalarına izin vererek enjekte etmek mümkündür. Bununla birlikte, bu pozisyonda fare bazen geri çekilerek implante edilen pencerede strese neden olur. Bu, pencere ile omurilik arasında kanamaya neden olabilir ve böylece optik netliği tehlikeye atabilir.</li>
	<li>EAE, anti-enflamatuar tedavinin kesilmesinden 2-3 hafta sonra (ameliyattan ~ 3-4 hafta sonra) indüklenebilir. Fareyi adım 3.2'de açıklandığı gibi hafifçe sakinleştirin. Fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve burun üzerine yerleştirilen bir izofluran maskesi ile sedasyonu koruyun.</li>
	<li>MOG35-55 peptidi (800 μg mycobacterium tuberculosis içeren Freund adjuvanında 75 μg) 3 farklı s.q. konumuna (femur üzerinde bilateral olarak ve kuyruğun tabanında) ve boğmaca toksini (400 ng) i.p.14,15 
	Not: EAE'li fareler, yalnızca pencereli farelere kıyasla ek bakım gerektirir. EAE farelerini her gün tartın ve her zaman yiyecek ve suya kolayca erişebildiklerinden emin olun. Hayvan hidrasyonunu ve ağırlığını korumak için %3 agaroz jöle ile takviye edin. Ek kaloriler için jöleye glikoz (% 1-3) da eklenebilir.</li>
	<li>EAE indüksiyonundan iki gün sonra, adım 3.2'de belirtilen sedasyon protokolünü tekrarlayın ve ikinci bir boğmaca toksini (400 ng) ip enjekte edin.</li>
	<li>Omuriliği görüntülemek için, önce hayvanı adım 3.2'de tarif edildiği gibi sakinleştirin ve ketamin / ksilazin (100 mg / kg; 10 mg / kg) ip ile hafifçe uyuşturun. Bu, ~ 1 saatlik görüntüleme sağlayacaktır.</li>
	<li><2 saat süren görüntüleme seansları için, her 45-60 dakikada bir ek ketamin / ksilazin (50 mg / kg; 5 mg / kg) enjeksiyonları ile hafif anestezi sağlanabilir. Alternatif olarak, daha uzun görüntüleme seansları için, fareler sürekli olarak izofluran (nemlendirilmiş havada% 0.75-1.25 izofluran) ile sedasyon altına alınabilir. 
	Not: Pencereler, bir mendilin köşesi veya pamuk uçlu bir bezle kalıntıları nazikçe silerek cerrahi mikroskop altında temizlenebilir. Pencereyi temizlemek için alkol kullanmayın çünkü bazı diş çimentosu türlerini bozabilir ve omuriliği soğutabilir.</li>
	<li>Hafifçe uyuşturulduktan sonra, fare, implante edilen ataşın açıkta kalan kısmı ile bir klips tutucusuna sıkıca tutturulur (Şekil 1b).</li>
	<li>Omurilik, klipsin tutucu içindeki konumunu ayarlayarak, tutucunun konumunu ayarlayarak ve sahnenin konumunu ayarlayarak objektif merceğe dik olarak hizalanır. Omuriliğin dorsal yüzeyi hızlı bir şekilde görüntülenir ve dorsal vaskülatür omuriliğin yönünü belirlemek için kullanılır.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, J. V., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+response+to+focal+necrotic+injury+inside+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate response to focal necrotic injury inside the blood-brain barrier.</a> J. Immunol. 177 (8), 5269-5277 (2006).</li>
<li>Xu, H. -T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat. Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
<li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+by+in+vivo+imaging+of+the+dynamics+of+vascular+and+axonal+networks+in+injured+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (23), 9459-9464 (2009).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKerschensteiner%2C+M+%22In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal%22">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal</a>. 11 (5), 572-577 (2005).</li>
<li>Ylera, B., Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronically+CNS-injured+adult+sensory+neurons+gain+regenerative+competence+upon+a+lesion+of+their+peripheral+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon.</a> Curr. Biol. 19 (11), 930-936 (2009).</li>
<li>Dibaj, P., Nadrigny, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NO+mediates+microglial+response+to+acute+spinal+cord+injury+under+ATP+control+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo.</a> Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).</li>
<li>Dibaj, P., Steffens, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+imaging+reveals+distinct+inflammatory+activity+of+CNS+microglia+versus+PNS+macrophages+in+a+mouse+model+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS.</a> PloS One. 6 (3), (2011).</li>
<li>Johannssen, H. C., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Ca2%2B+imaging+of+dorsal+horn+neuronal+populations+in+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo Ca2+ imaging of dorsal horn neuronal populations in mouse spinal cord.</a> J. Physiol. 588 (18), 3397-3402 (2010).</li>
<li>Nikić, I., Merkler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis).</a> Nat. Med. 17 (4), 495-499 (2011).</li>
<li>Di Maio, A., Skuba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+dorsal+root+regeneration%3A+rapid+immobilization+and+presynaptic+differentiation+at+the+CNS%2FPNS+border%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of dorsal root regeneration: rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border.</a> J. Neurosci. 31 (12), 4569-4582 (2011).</li>
<li>Laffray, S., Pagès, S., Dufour, H., De Koninck, P., De Koninck, Y., Côté, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+movement+compensation+for+in+vivo+imaging+of+fast+cellular+dynamics+within+a+moving+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Adaptive movement compensation for in vivo imaging of fast cellular dynamics within a moving tissue.</a> PloS One. 6 (5), (2011).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> J. Physiol. 590 (16), 3665-3675 (2012).</li>
<li>Kuerten, S., Angelov, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+CNS+morphology+and+immunobiology+of+different+EAE+models+in+C57BL%2F6+mice+-+a+step+towards+understanding+the+complexity+of+multiple+sclerosis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Anat%22%5BJournal%5D)">Comparing the CNS morphology and immunobiology of different EAE models in C57BL/6 mice - a step towards understanding the complexity of multiple sclerosis).</a> Ann. Anat. 190 (1), 1-15 (2008).</li>
<li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice%3A+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> Eur. J. Immunol. 25 (7), 1951-1959 (1995).</li>
<li>Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted.</a> Nat. Methods. , (2012).</li>
<li>Moreno, B., Jukes, J. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+inflammation+induces+axon+injury+during+brain+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Systemic inflammation induces axon injury during brain inflammation.</a> Ann. Neurol. 70 (6), 932-942 (2011).</li>
<li>Lassmann, H., van Horssen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+neurodegeneration+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of neurodegeneration in multiple sclerosis.</a> FEBS Lett. 585 (23), 3715-3723 (2011).</li>
<li>Yenari, M. A., Han, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+mechanisms+of+hypothermia+in+brain+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective mechanisms of hypothermia in brain ischaemia.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 267-278 (2012).</li>
<li>Kalmbach, A. S., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+surface+temperature+under+a+craniotomy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Brain surface temperature under a craniotomy.</a> J. Neurophysiol. 108 (11), 3138-3146 (2012).</li>
<li>Pérez-Nievas, B. G., García-Bueno, B., Madrigal, J. L. M., Leza, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+immobilisation+stress+ameliorates+clinical+score+and+neuroinflammation+in+a+MOG-induced+EAE+in+Dark+Agouti+rats%3A+mechanisms+implicated%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Chronic immobilisation stress ameliorates clinical score and neuroinflammation in a MOG-induced EAE in Dark Agouti rats: mechanisms implicated.</a> J. Neuroinflammation. 7, 60 (2010).</li>
<li>Bjartmar, C., Kidd, G., Mörk, S., Rudick, R., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurological+disability+correlates+with+spinal+cord+axonal+loss+and+reduced+N-acetyl+aspartate+in+chronic+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neurological disability correlates with spinal cord axonal loss and reduced N-acetyl aspartate in chronic multiple sclerosis patients.</a> Ann. Neurol. 48 (6), 893-901 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

EAE'nin zaman içindeki dinamik ilerlemesini incelemek için yetişkin farelerin açıkta kalan omuriliklerine cam pencereler yerleştirmek ve bakımını yapmak için bir yöntem tanımladık. Omurilik yaralanması modellerini13 incelemek için benzer bir cam pencere implantasyon yaklaşımı kullanılmıştır ve ayrıca glioblastomlar, menenjit veya normal omuriliğin hücresel fizyolojisi gibi diğer omurilik patolojilerini incelemek için de yararlı olabilir. Yöntemimiz için, cam pencere bu dış iskelete sabitlenirken, sıkıca sabitl...

Multipl skleroz, ilerleyici miyelin ve akson hasarına neden olan bir CNS oto-immün hastalığıdır. CNS otoimmün demiyelinizan hastalıklar için standart araştırma modeli, yetişkin kemirgenlerde EAE'dir. Bununla birlikte, EAE ilerlemesinin altında yatan dinamik hücresel olaylar büyük ölçüde keşfedilmemiştir. Bir yaklaşım, EAE'li yetişkin farelerin omuriliklerinde uzun süreler boyunca floresan belirteçlerle hücresel popülasyonları görselleştirmek için intravital iki foton mikroskobu kullanmaktır.
İntravital iki foton mikroskobu, hücre altı çözünürlük1 ile canlı hayvanlarda hücresel fizyolojiyi, hücresel etkileşimleri ve hastalığın dinamik ilerlemesini incelemenin güçlü bir yoludur. Bununla birlikte, yaklaşımın önündeki en büyük engel, ilgilenilen bölgeye optik erişim gerektirmesidir. Örneğin, kraniyal cam pencereler, beyindeki aynı mikro yapıları birkaç hafta boyunca tekrar tekrar görüntülemek için iyi bilinen bir metodolojidir2,3. Bununla birlikte, bu metodolojinin omurilik görüntülemesine uyarlanması kolay değildir ve eklemli omurlar içindeki dorsal omurga dokusunu hareketsiz hale getirmek için çeşitli teknik modifikasyonlar gerektirir.
Önceden, omuriliğe optik erişim, her görüntüleme seansının başında omuriliğin cerrahi olarak yeniden açığa çıkarılmasını ve her seansın sonunda cildin kapatılmasını gerektiriyordu4-12. Bu tekrarlanan ameliyatlar hayvan için travmatiktir, görüntüleme seanslarının sayısını ve uzunluğunu sınırlar ve mekanik pertürbasyon yoluyla omurilikte iltihaplanma ve hasar gibi ameliyatla ilgili artefaktların olasılığını artırır. Bu eksikliklerin üstesinden gelmek için, yakın zamanda, tekrarlanan ameliyatlar olmadan uzun süreli in vivo iki foton mikroskobu deneyleri için travmatik omurilik yaralanmaları olan yetişkin floresan transgenik farelerin açıkta kalan omuriliklerine cam pencereler yerleştirmek için bir protokol geliştirdik13. Burada, yetişkin farelerde EAE'nin ilerlemesinin altında yatan dinamik hücresel olayları incelemek için implantasyon protokolünün uygulaması bağlamında ayrıntılı bir uyarlamasını sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>Kemik çıkarma matkabı</td><td>World Precision Instruments</td><td>İDEAL MİKRO-MATKAP</td><td>Harvard Apparatus tarafından da satılmaktadır. Herhangi bir yüksek kaliteli cerrahi kemik matkabı yeterli olacaktır.</td></tr><tr><td>Matkap çapağı (#1/4 veya 1/2 Karbür Yuvarlak Çapak)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501860 (#1/4) 501860 (#1/2)</td><td>Harvard Apparatus tarafından da satılır</td></tr><tr><td>Staples</td><td>Lyreco</td><td>5.002.567</td><td>Taç = 8 mm Ayak = 4 mm</td></tr><tr><td>Ataş</td><td></td><td></td><td>Herhangi bir standart 25 mm ataş</td></tr><tr><td>İğne sürücüleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>12003-15</td><td></td></tr><tr><td>Kağıt mendil makası</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Adson forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11027-12</td><td>1 x 2 diş</td></tr><tr><td>Künt forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11293-00</td><td></td></tr><tr><td>Omurga çatalları</td><td>Harvard Aparatı</td><td>724813</td><td></td></tr><tr><td>Diş çimentosu</td><td>GACD</td><td>12-565 & 12-568</td><td></td></tr><tr><td>Silikon elastomer</td><td>Dünya Hassas Aletleri</td><td>KWIK-SIL</td><td>Ayrıca Tutarlı Bilimsel ve Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Siyanoakrilat</td><td>Eleco-EFD</td><td>Cyanolit 201</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>7MP</td> ile de kullanılabilir <td>Mikroskobumuz dik bir konfigürasyondadır ve 5 NDD dedektörü ile donatılmıştır.</td></tr><tr><td>Objektif lens</td><td>Zeiss</td><td>W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC M27 75mm</td><td>Çalışma mesafesi = 1.8 mm</td></tr></tbody></table>

deneysel otoimmün encephalomyelitis erişkin farelerde cam omurilik windows&#39;u implante

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Yetişkin kemirgenlerde deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), multipl skleroz gibi otonomik demiyelinizan hastalıkları incelemek için standart deneysel modeldir. Burada, EAE'li canlı yetişkin farelerde intravital mikroskopi ve subselüler çözünürlüklü spinal kord sitomimarisinin dinamiklerini incelemek için uygun, düşük maliyetli ve tekrarlanabilir bir cam pencere implantasyon protokolü sunuyoruz. Kısaca, T12-L2 omurlarını cerrahi olarak açığa çıkarıyoruz ve siyanoakrilat ve diş çimentosu kombinasyonu kullanarak açıkta kalan omurların etrafında bir oda oluşturuyoruz. T13'ten L1'e kadar bir laminektomi yapılır ve açıkta kalan omuriliğin sırt yüzeyine ince bir şeffaf silikon elastomer tabakası uygulanır. Camın omuriliğe doğrudan temas etmemesine dikkat edilerek, açıkta kalan omuriliğin üzerine modifiye edilmiş bir cam örtü astarı implante edilir. Pencere ile omurilik arasındaki inflamatuar hücrelerin infiltrasyonunu azaltmak için, implantasyon sonrası ilk 10 gün boyunca her 2 günde bir (etik kurul tarafından önerildiği şekilde) anti-inflamatuar tedavi uygulanır. EAE, anti-enflamatuar tedavinin kesilmesinden sadece 2-3 hafta sonra indüklenir.
Bu yaklaşımı kullanarak, implante edilmiş pencereleri olan hayvanların% 87'sinde EAE'yi başarılı bir şekilde indükledik ve Thy1-CFP-23 farelerini (dorsal omurilikteki mavi aksonlar) kullanarak, EAE ilerlemesi boyunca aksonal kaybı ölçtük. Birlikte ele alındığında, bu protokol, çeşitli hücre popülasyonlarının işe alımını ve bunların etkileşim dinamiklerini, hücre altı çözünürlükle ve uzun süreler boyunca incelemek için yararlı olabilir. Bu intravital görüntüleme yöntemi, EAE gibi otoimmün demiyelinizan hastalıkları tedavi etmek için terapötik stratejiler geliştirmek için değerli bir araçtır.

Kronik olarak implante edilmiş cam pencerelerin, intravital iki foton mikroskopisi ve EAE modelleri ile birlikte kullanılması, otoimmün demiyelizan hastalık patolojisinin temelindeki hücresel mekanizmaları anlamak için yararlı bir araç olabilir. İmplantasyon yöntemimizi kullanarak, pencerelerin çoğunun EAE indüksiyonu sırasında berrak olduğunu ve EAE ilerlemesi boyunca berrak kaldığını gördük (Şekil 1c). Bu yaklaşımı kullanarak, pencerelerin tüm implantasyon sonrası dönem boyunca berrak kaldığını (ortala...

Deneysel otoimmün ensefalomiyeliti incelemek için yetişkin farelerin açıkta kalan omurilikleri üzerine cam pencerelerin implante edilmesi ve bakımı için bir yöntem açıklıyoruz. Bu pencereler, iki foton mikroskobu kullanarak canlı hayvanlarda hücre altı düzeyde hücre dinamiklerini izlemek için omuriliğe kronik optik erişim sağlar.

Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis Erişkin Farelerde Cam Omurilik Windows&#39;u implante

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Bu prosedürün genel amacı, uzunlamasına intravital iki foton mikroskobu ile deneysel otoimmün ensefalomiyeliti incelemek için omuriliklerin ve yetişkin farelerin bir pencere görünümünü oluşturmaktır. Bu, önce ameliyat ve görüntüleme için omurları desteklemek için bir spinal kelepçe implante edilerek gerçekleştirilir. Sonraki adımlar, omuriliği açığa çıkarmak ve cam pencereyi desteklemek için omurların yan kenarlarını hazırlamaktır.Bunu, pencere ile dura arasına ince bir silikon elastomer tabakası ile pencerenin implante edilmesi takip eder. İmplantasyondan birkaç hafta sonraki son adım, implante edilen farelerde EAE'yi indüklemektir. Sonuç olarak, sonuçlar, iki foton mikroskobu kullanarak EAE farelerinin omuriliklerindeki hücre dağılımlarındaki ve hücresel etkileşimlerdeki uzay-zamansal değişiklikleri gösterebilir.Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Yöntemin öğrenilmesi zor olabilir çünkü zamana duyarlıdır ve yüksek derecede hassasiyet gerektirir. Ameliyat başına yetişkin fareyi uyuşturarak ve göz merhemi tıraşı uygulayarak başlayın.Sırtı yaklaşık iki santimetre genişliğinde ve beş santimetre uzunluğunda, göğüs kamburu üzerinde ortalanmış ve açıkta kalan cildi iyot sabunu v

implanting-glass-spinal-cord-windows-adult-mice-with-experimental

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Video, miyelin oligodendrosit glikoproteinleri ve inaktive edilmiş Mycobacterium tuberculosis'in bir kombinasyonunu enjekte ederek bir fare modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyelit indüksiyonunu göstermektedir. Model, araştırmacıların hastalık mekanizmalarını incelemelerine ve terapötik müdahaleleri test etmelerine olanak tanır.

Bir Fare Modelinde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit İndüksiyonu

Bu video, transgenik farelerde optik bir pencereden beynin nöral aktivite kaydını göstermektedir. Fareler, sinirsel aktivitelerin tespit edilmesini sağlayan bir floresan proteini eksprese eder. Kafatasının küçük bir kısmı, optik bir pencere takmak için dikkatlice çıkarılır ve daha sonra görüntülemeden önce ışığı engellemek için kafatası siyah çimento ile kaplanır.

Görüntü Sinirsel Aktivitelerine Transgenik Farelerin Beynine Optik Pencerelerin Yerleştirilmesi

Bu video, beyne göç eden otoreaktif T hücrelerini aktive etmek için miyelin türevi peptitleri bir adjuvan ile enjekte ederek deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indükleme yöntemini göstermektedir. Boğmaca toksini, kan-beyin bariyeri geçirgenliğini artırmak için uygulanır ve bu T hücrelerinin ve diğer bağışıklık hücrelerinin beyne girmesine izin verir. Bu bağışıklık hücreleri demiyelinizasyona neden olarak sinir iletiminin bozulmasına ve EAE gelişimine yol açar.

Bir Fare Modelinde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Oluşumu

Bu videoda, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) kullanılarak multipl sklerozun bir fare modeli oluşturulmuştur. Fareye, otoreaktif T hücrelerini aktive eden bir bağışıklık tepkisini tetikleyen bir nöronal peptit ve bir adjuvan içeren bir emülsiyon enjekte edilir. Bunu, otoreaktif T hücrelerinin beyne sızmasına izin vererek kan-beyin bariyeri geçirgenliğini artırmak için bir boğmaca toksini (PTX) enjeksiyonu takip eder. Bu infiltrasyon, multipl sklerozun demiyelinizan durumunu taklit ederek...

Kaynak: Pietruczyk, E. A., et al. Farede laminektomi ve omurilik penceresi implantasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, in vivo görüntüleme için anestezi uygulanmış bir fareye bir omurilik penceresinin implantasyonunu göstermektedir. Protokol, bir borosilikat kapak camı ve 3D baskılı bir arka plaka kullanarak açıkta kalan omuriliği stabilize eder. Bu yöntem, kan-beyin bariyeri dinamiklerini ve nörovasküler etkileşimleri incelemek için yüksek çözünürlüklü iki foton mikroskobunu mümkün kılar.

In Vivo Görüntüleme için Bir Farede Omurilik Penceresi İmplantasyonu

Nöral kök / progenitör hücreler (NPC) nakli rejeneratif nöroloji büyük vaatlerde tutar. NPC sistemik teslimi, beyin ve merkezi sinir sistemi hasarı deney kronik enflamatuar etkilenen kemirgen ve insan olmayan primatların omurilikteki kök hücrelerini sunmak için etkili invazif düşük, ve terapötik açıdan etkili, çok protokol dönüşmüştür.

Kronik EAE ile Fare nöral kök / progenitör hücrelerinin sistemik enjeksiyonundan

Bu videoda, bir canlı fare dorsal spinal kord üzerinde kronik optik görüntüleme odasını yerleştirmeye yönelik bir prosedür açıklanmaktadır. odası, cerrahi işlem ve kronik görüntüleme gözden ve gösterilmiştir.

Boyuna için bir Spinal Odası implantasyon için bir Prosedürü İn Vivo Fare Omurilik Görüntüleme

Bu makale, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) modelinin indüksiyon ve skorlama yöntemlerini, çeşitli hastalık evrelerinde sırasıyla akış sitometrisi ve kantitatif PCR kullanılarak lenf düğümleri, dalak, kan ve omurilikteki immün hücre dağılımı ve mRNA sitokin seviyelerinin değerlendirilmesi ile birlikte açıklamaktadır.

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

Bu protokol, intravital mikroskopi ile görselleştirmeyi kolaylaştırmak için bir farenin omuriliğine cam pencere nin yerleştirilmesini açıklar.

Farede Laminektomi ve Omurilik Penceresi İmplantasyonu

Burada, nörovasküler birim bozulma deneysel otoimmun ensefalomiyelit içinde vivo sırasında araştırmak için protokolleri mevcut. Biz özellikle kan - beyin bariyerini geçirgenliği ve gelatinase etkinlik lökosit göç dahil glia limitans belirlemek nasıl adres.

Nörovasküler biriminin endotel ve gliyal engelleri bozulma Vivo deneysel otoimmun ensefalomiyelit sırasında görüntülenmesi

Bugüne kadar, tüm ana merkezi sinir sisteminde yerleşik hücre tiplerinin aynı fareden eşzamanlı izolasyonu için protokoller karşılanmamış bir taleptir. Protokol, nöroinflamasyon sırasında karmaşık hücresel ağları araştırmak ve aynı anda gerekli fare sayılarını azaltmak için naif ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerinde uygulanabilir bir prosedürü göstermektedir.

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Öğrenin, erişkin farelerde deneysel otoimmün ensefalomiyeliti (EAE) incelemek için cam omurilik penceresi implantasyonu yöntemini. İki foton mikroskobisiyle kronik optik erişim sağlar.

Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis Erişkin Farelerde Cam Omurilik Windows'u implante

Daha fazla video keşfet