Name: Doğal İletim üzerine Tüberküloz-Sıtma Koenfeksiyonu Çalışması için Deneysel Bir Model Mycobacterium tuberculosis Ve Plasmodium berghei /i (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-17T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Keşfedin, tüberküloz ve sıtma koenfeksiyonunu fare modelinde in vivo araştırmak için aerosol inhalasyonu ve doğal bulaş yöntemlerini. Bu yöntem patojen etkileşimlerini ve immün yanıtları analiz etmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar sivrisinek üreme için Miriam Ester teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Araştırma Merkezi Borstel in-house fon tarafından desteklenen ve Leibniz Merkezi Enfeksiyon fon katıldı.

Güvenlik Önlemleri ve Etik Beyanı Bu tarifnamede sunulan çalışmalar, insan patojen Mtb ve kemirgen sıtma paraziti Plasmodium berghei (P. berghei) ile çalışma içerir. Mtb (suş H37Rv) ve P. ile Deneyler berghei Uygun biyo-güvenlik koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Biyogüvenlik düzeyi (BGS) 2 laboratuarlar, P. gibi kemirgen sıtma parazitleri için gerekli dolayısıyla berghei ve Mtb için BSL 3 ve bütün-enfeksiyon çalışmalar için burada tarif edildiği. NOT: Mtb ile enfekte edilen fareler hemen yakınında diğer farelerin (kendi gözlem) enfeksiyon yayılır yok. Deneyci Spread nedenle bırakılabilir ancak uygun koruyucu giysiler her zaman BSL 3 laboratuar içi giyilmelidir vardır. Bizim kurallara göre, deneyci dış bir zaman bir atılır hangi cerrahi fırçalama, saç ağları, tek solunum ve iki çift eldiven giymekrms kabineden çekilir. Yeni olanları tekrar kabine girmeden önce konur. İki kaplar,% 2 Buraton ile bir (NOT: MTB inaktive onaylanan diğer dezenfektanlar onaylı konsantrasyonda kullanılabilir), sıvı ve bulaşıcı atık malzeme ve yüzey dekontaminasyon için bir, deneyden önce hazırlanan ve kabine içine yerleştirilir. Buna ek olarak, plastik torba bulaşıcı olmayan bir katı atıklar için kullanılacaktır. Alman kurallarına göre, Mtb türetilen Mtb kültürlerin veya doku taşıma ve işleme ile ilgili tüm iş fareler bir BSL3 laboratuvar içinde bir sınıf 2 biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır bulaşmış. Mikobakterıler tutarken tedbirler her zaman aerosollerin oluşumunu önlemek için alınması gerekir. 6-8 hafta arası Erkek C57BL / 6 fareleri (Charles River), her-enfeksiyon deneyleri için kullanılan ve BSL özel bariyer koşullar altında 3 imkanları muhafaza edilmiştir. Hayvan bakımı ve deney pe edildiTarım, Çevre ve Schleswig-Holstein Eyaleti Kırsal Alanlar için Bakanlığı Hayvan Deneyleri Etik Kurulu tarafından onaylanan protokoller uyarınca rformed Sıtma sivrisinek aşamaları elde etmek için, NMRI fareler Charles River Laboratory, Sulzfeld, Almanya &#39;den satın alındı ​​ve Heidelberg Üniversitesi Hayvan imkan (IBF) içinde belirli bir patojen içermeyen koşullar altında tutuldu. Tüm hayvan deneyleri Avrupa yönetmeliklerine göre yapılır ve Baden-Württemberg&#39;de (Regierungspräsidium Karlsruhe) ve devlet yetkilileri tarafından kabul edildi. 1.. Bir Glas-Col Aerosol odacığı kullanılarak Mtb ile Farelerin enfeksiyonu Aerosol Mtb ile deney hayvanlarının aerosol enfeksiyonu standardize etmek için en iyi yolu, bilinen CFU titrelerle dondurulmuş stoklarından mikobakterıler kullanmaktır. Stok kültürleri hazırlamak, Middlebrook 7H9 broth kültürü Mtb OADC (oleik ile desteklenmişasit, albümin, dekstroz, Katalaz) zenginleştirme ortamı ve% 0.05 Tween 80, mikobakteriler için bir karbon kaynağı ve aynı zamanda bakteriyel kümeleşmeyi önlemek için ölçer. Kültürler hasat zamanında bir OD ≤ 1 olmalıdır. Yüksek OD olarak, bakteriyel topaklanma artar ve canlılığı azalır. -80 ° C&#39;de saklayın 1 ml&#39;lik eş payları % 0.5 gliserol, 1 g / L asparagin ile takviye 7H11 agar plakaları üzerinde üç bağımsız şişelerin 10 katlık seyreltileri, bir dizi kaplama ile dondurulmuş stok birim (CFU) oluşturan uygun bir koloni sayısı ve OADC belirlemek ve sonra 4 koloni saymak 37 ° C&#39;de inkübasyon hafta Aşağıda tarif edildiği gibi aerosol enfeksiyon yapın. <ol><li> Dikkatli bir şekilde çözülme Mtb bilinen CFU titresinin stokları ve bir 27 G iğne ile donatılmış bir 1 ml şırınga ile bakteri kümeleri dağıtmak için bir süspansiyon beş kez karıştırın. Aerosol üretimini önlemek. </li><li> İstenen enfeksiyon dozu bağlı olarak, içine mikobakteriyel stokunun istenen hacmi aktarmaksteril PBS içeren 50 ml&#39;lik bir tüp. Nihai hacmi, 6 ml &#39;dir. NOT: Bu süspansiyon içinde mikroorganizma sayısının değiştirilmesiyle, aerosol damlacıkları taşıyan bakteri oranı değişir. Biz genellikle akciğer (düşük doz enfeksiyon) başına 100 canlı basil bir alımı hedefliyoruz. Deneyimlerimize göre, bu 5,5 ml nebulize olmak üzere 6 ml&#39;lik bir toplam hacim içinde yaklaşık 1-2 x 10 6 Mtb / ml (aşağıya bakın). Bu enfeksiyon için ideal koşullar bulmak için bakterilerin farklı konsantrasyonları ile deneysel aerosol zorlukların bir dizi yapmak için tavsiye edilir. Kadar 5000 mikobakteriyel enfeksiyonlar yüksek dozda 5 bakteriler gibi birkaç başarılı bir aerosol ile fareleri enfekte etmek için kullanılabilir olarak, enfeksiyon işlemini hızlandırmak için yapılabilir ise. Enfeksiyon oranı genellikle% 100&#39;dür. </li><li> Inokulum titresini belirlemek için kaplama için (gerekli nihai hacme aşan hazırlanmıştır) yeterli hacmi çıkarın; genellikle teknik triplicates plaka 500 ul çıkarın. </li><li> Hayvanların koyunBir kompartman örgü dairesel aerosol odasının içinde sepet (sepet başına bir fare) ve aerosol odasının kapağını kapatın. NOT: Diğer modeller 20 fare ağırlayacak her biri beş ayrı bölmeleri, oluşan bir pasta şeklinde sepet ile donatılmıştır. </li><li> Üç paslanmaz çelik soket bağlantıları için Venturi-nebulizatör ünitesini takın. </li><li> Bir kör 18 G iğne ile donatılmış 10 ml&#39;lik bir şırınga ile 50 ml tüpten mikobakteriyel süspansiyon çıkarın ve kapalı bir taşıma kutusu içinde aerosol bölmeye şırınga taşır. </li><li> Nebulizer biriminin vidalı kapağı çıkarın ve dikkatle nebulizer içine mikobakterler süspansiyonu enjekte. Aerosollerin nesil kaçının. 2% Buraton içeren bir kesici kabın içine şırınga atın. Vidalı kapaklı nebulizatörü Seal. </li><li> Ana güç anahtarı ve UV lamba açın. Kontrol tuş takımı üzerindeki ekran &quot;Glas-Col Aparatı Co&quot; gösterir. </li><li> Program düğmesini açın. Ekran iradegöstermek &quot;nebulizatör hazır mı?&quot; &quot;sepet yerleştirilmiş mi?&quot; ne zaman hazır enter tuşuna basın. &quot; Enter tuşuna basın. </li><li> Ekranda &quot;Onceden Zaman 900 girin&quot; gösterir, bu 900 sn (egzoz havayı dekontamine) yakma fırını için ön ısıtma zamanı demektir. Enter tuşuna basın. </li><li> Göstergede &quot;nebulizing süresi 1.800 Enter&quot; olacaktır, bu spreyleme süresi varsayılan olarak 1.800 sn ayarlanır demektir. Nebulizing süresini uzatmak amacıyla, &quot;2400&quot; girin ve enter tuşuna basın. Not: nebulize edici döngüsü sırasında, basınç altında hava böylece mikobakteriler içeren küçük bir aerosol damlacıkları üreten, süspansiyon atomize. Ana hava akımı, bu damlacıklar (boyut olarak yaklaşık 2-5 um) aerosol odasına gerçekleştirilmektedir. </li><li> Ekranda &quot;CD saatler 1.800 Enter&quot; olacaktır, bu çürüme döngü 1.800 sn sürer demektir. &quot;2.400&quot; ve enter tuşuna basın ayarlayın. NOT: Bu döngü sırasında, bulut hangi u inşa edilmiştirnebulize edici döngüsü sırasında aerosol odası içinde p çürüme olabilir. Küçük damlacıklar, deney hayvanları tarafından teneffüs edilir. </li><li> Ekranda &quot;Aralık Saat 900 girin&quot; gösterecek, bu UV ışığı dekontaminasyon çevrimi 900 sn alacak demektir. Enter tuşuna basın. Makine ön ısıtma, nebulizing, bulut çürüme ve UV dekontaminasyon ile bisiklet başlayacaktır. DİKKAT: ve döngü başlar nebulizing zaman sıkıştırılmış hava akış metre 10 feet küp / saat (kontrol; buna göre hava kontrol valfi ayarlamak vakum debi ölçer (gerekirse vakum kontrol valfini ayarlamak ön ısıtma döngüsü başladığında kontrol) 60 ayak küp / saat belirtmelidir .) </li><li> Döngüsü tamamlandığında, tuş takımı &quot;Süreci Tamamlandı - Numune Kaldır&quot; gösterecektir. Program, UV ve ana güç anahtarını kapatın. </li><li> Mikobakteri süspansiyon tamamen nebulized ve değilse, dikkatli ile donatılmış uygun bir şırınga ile süspansiyon kaldırarak kalan hacmi rekor olup olmadığını kontrol edin18 G künt bir iğne. Geri kalan hacmi fazla 1 mi olmamalıdır. </li><li> Eklem nebulizatörü çıkarın ve 2 saat en az% 2 Buraton içeren bir tavada yerleştirin, genellikle dezenfeksiyon O / incelemeleri yapılır Daha sonra, taze bir tavaya nebulizatörü aktarmak ve su ile iyice durulayın. Kurumaya nebulizatörü bırakın. </li><li> Aerosol odasını açın ve kafeslerine hayvanların dönmek. Otoklav torbaları ve otoklavda çanta sepetler. . Güvenlik nedenlerinden dolayı, motorlu bir hava temizleyici respiratör Bu işlem sırasında giyilmelidir: 2% Buraton NOT aerosol odasının iç yüzeyleri silerek temizleyin. </li><li> 7H11 agar plakaları üzerinde bir teknik üç kez (3 x 100 ul), plaka 10-kat seyreltme (adım 1.3) mikobakteriyel süspansiyonun geri kalan 500 ul kullanılması. </li></ol> 2. Akciğerler İstenilen CFU Alımı doğrulayın Deney hayvanlarının aerosol enfeksiyondan bir gün sonra bakteriyel lo belirlerİstenen CFU alımını teyit etmek için belirlenen kontrol hayvanların akciğerlerinde ad. NOT: Biz genellikle günde 1 CFU belirlenmesi için 3-5 farelerin ekstra grubunu belirlemek. Zamanla Mtb enfeksiyonun seyrini izlemek için, mikobakteriyel doku yük CFU belirlenmesi için bütün organ homojenatlarının seri dilüsyonları kaplama ile incelenebilir. Akciğer tüberkülozunda hastalık tezahürü için birincil site ancak dalak, karaciğer ve lenf düğümleri genellikle buna göre analiz edilir. Kaplama olmak üzere dilüsyonlar dokuda, yanı sıra organ ve bir zaman noktasında farklı bakteri yüklere neden olur, ilk aşı (yüksek doz genel düşük doz) bağlıdır organlardaki beklenen mikobakteriyel yüke bağlıdır analiz edilebilir. Düşük dozda enfeksiyonu üzerine, akciğerde Mtb H37Rv bakteriyel yük genellikle günde 25-30 arasında bir düzlüğe ulaşır. <ol><li> CO 2 boğulma ya: ötenazi hayvanları (Ötanazi yerleştirinTerminal bir sınıf II biyogüvenlik kabini içinde bir diseksiyon gemide emici kağıt üzerinde anestezi) ve% 70 etanol ile dezenfekte fareler. NOT:% 70 alkol sadece yüzey dekontaminasyon için ve MTB öldürmez. </li><li> Karın ortasında küçük bir kesi yapmak ve başının üstünde fare derisi geri çekin. </li><li> Cerrahi makas ile karın ve göğüs kafesi açın ve akciğerler erişilebilir, böylece göğüs duvarını kaldırın. </li><li> Akciğerleri çıkarın ve homojen hale getirme tamponunda (steril su /% 1 h / h Tween 80/1% w / v albümini) ile bir 15 ml tüp içine aktarın. </li><li> Küçük bir Petri kabı içine 100 mikron elek ile 5 ml şırınga gerginlik akciğerlerin pistonu kullanarak. </li><li> Gömme elekler birkaç kez bir engel ucu ile donatılmış bir 1 ml pipet kullanılarak ve 8 agar plakaları arasında akciğer homojenatı dağıtmak (yaklaşık 250 ul / plaka;. Emin bir de kuru bir yüzeye sahip olun). </li><li> Dikkatlice% 2 içine atılan tek kullanımlık gübre kullanılarak örnekleri plakaBuraton. </li><li> Kabine içinde kurumaya agar plakaları bırakın. , Parafilm ile her bir levha mühür alüminyum folyo sarılmakta ve en az 4 hafta süreyle 37 ° C&#39;de inkübe dik. </li></ol> 3. Kaçış-proof Sivrisinek Kafesleri İnşaatı Kemirgen Plasmodium suşları insanlara zararlı değildir. Bununla birlikte, Mtb-enfekte edilmiş fareler parazit ve işin alıcıları olduğu BSL 3 koşullar altında yapılır, önlemler, kafesleri kaçmasını sivrisinek önlemek için gereklidir. Planlanan enfeksiyon rejimine bağlı olarak, otoklavlanabilir ve metal çerçeve kafesler veya kendi kendine yapılan tek kafesler yeniden kullanılabilir. Deney hayvanlarının bite enfeksiyonu ile fare başına sivrisinek tanımlanmış bir dizi ile gerçekleştirilebilir için gerekli ise, bu ikinci olanlar tavsiye edilmektedir. Self-made kafesleri gerekiyorsa, sivrisinek ve laboratuvar güvenliği sağlığı gibi tam özelliklerine kafesleri hazırlamak onların sou bağlıdırnd inşaat (Şekil 2). <ol><li> Böyle bir yarım litrelik dondurma karton veya kağıt kahve fincan (Şekil 2) gibi bir karton alın. </li><li> Kartonun yan içine, küçük bir açıklık kesin ve sivrisinekler için güvenli bir giriş oluşturmak için her bir parça kesilmiş bir yarık ile lateks bir çift tabaka ile kapatın. Not: açıklığı 2 cm x 2 cm arasında bir toplam boyut vardır, biz getirmek ve / veya almak-out sivrisinekler için kullanılan boru (aspiratör cihazı) bir vakum pompasına bağlı bir tadil edilmiş 15 ml Falcon tüpü olan ve bu nedenle olarak hizmet 1.5 cm&#39;lik bir çapa sahip bir aspiratör. </li><li> Damlar kadar emmek için kartonun iç altındaki filtre kağıt parçası bantlayın. </li><li> Netleştirme (Naylon örgü, çift katmanlı, büyüklüğü 1 mm x 1 mm) ile dondurma bardak kapatın kapatın ve bant ve elastik bant ile karton düzeltmek. </li><li> Fare başına sivrisinek sayısı tanımlanmış gerekmektedir enfeksiyon deneyleri için, enfekte olmuş 10-15 sivrisinek ile kafesleri hazırlamak, bunların her biri, ideal bir av içeren10.000 yabani tip tükürük bezi P. erage berghei sporozoites. </li><li> İdeal olarak, önce kan yemek yerine, 24 saat süre ile sivrisinekleri açlıktan. </li></ol> 4. Sivrisinek Bite Farelerde Sıtma Enfeksiyon Burada kullanılan kemirgen malarya paraziti olan P. berghei ancak ilgi duyulan herhangi bir başka kemirgen Plasmodium suşu kullanılabilir. Bulaşıcı sivrisinek elde etmek için sporozoit iletim için parazitin bütün yaşam döngüsü omurgalı bir konakçının (fare) ve sivrisinek vektör hem de muhafaza edilmektedir. Parazit bakım bir insectary gerçekleştirilir. Doğal iletim deneyler için, tükürük bezi sporozoitler başına en az sayıda en az 10,000 olmalıdır. Detaylı protokollerin parazit bakım biz Moll ve ark Sıtma Araştırma Yöntemleri bakın., 2013. <ol><li> Naif fare veya Ketamine ile Mtb ile 40 gün boyunca hayvanlar preinfected uyuşturan (100 mg / kg)intraperitoneal enjeksiyon ile (200 ul / fare) ile ve Xylazine (7 mg / kg) çözeltisi. NOT: Mtb ve Plasmodium enfeksiyonu arasındaki süre yatan araştırma sorusuna bağlı olarak ayarlanabilir. Aynı şekilde, patojen zorlukların sırası tersine çevrilebilir, yani önce fareler Mtb enfeksiyonu bulaşıcı sivrisinek ısırığı maruz olabilir. </li><li> Sivrisinek kafeslere (fare oranı olarak tanımlanır sivrisinek için sivrisinek kafes başına bir fare) ve örgü üzerine anestezi fareler yerleştirin ve sivrisinek 10-15 dakika boyunca zarın içinden beslemek için izin verir. Not: sivrisinek bağırsaklarında kan varlığı besleme ve dolayısıyla, iletim sporozoit ifade eder. </li><li> Geri kafesler içine fare aktarmak ve bunlar anestezi uyanmak kadar sürekli denetleyecek. Kağıt havlu üzerine değil, yatak (boğulma tehlikesi) yerleştirin fareler ve (yakından birlikte yer ve kağıt havlu ile organları kapsayan) sıcak tutmak: Not. </li><li> Nett ile,% 70 etanol ya da diğer dezenfektan püskürterek sivrisinek öldürmekKafesin ing. Tek olanlar kullanılmış olsaydı Otoklav kafesleri ve atın. </li></ol> 5. İzleme Parazitemi <ol><li> Delinme kuyruk çok bir iğne ile sona erdirmek ve bir slayt her sonunda bir damla kan toplamak damarlar. </li><li> Slaytın uzunluğunun yarısından bir damla kan çekmek için başka bir slayt kullanın. Ikinci smear için diğer kenarı kullanmak için dağıtıcıya ters çevirin. Kuru hava slaytlar bırakın. </li><li> Giemsa leke <ol><li> Slayt sahipleri slaytlar yerleştirin ve mutlak metanol kısa daldırma tarafından kan smear düzeltmek. NOT: cam eşya kullanımı tüm çözümler için polipropilen cuvettes kullanmak BSL 3 minimumda tutulmalıdır çünkü. </li><li> Giemsa lekesi içindeki (deiyonize su içinde 1:10) bırakın. 10 dakika sonra, fazla leke uzak durulamak için deiyonize su ile bir kaç kez doldurulmuş boyama küvetler içinde ve dışında slaytlar daldırma. </li><li> Son olarak, dik bir konumda hava kuru kayar. </li></ol></li><li> ALTERNATİF LEKE: Wright &amp; #180; s leke <ol><li> Metanol içinde 1 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyonda Wright lekesi çözülür. </li><li> Kullanmadan önce katlanmış filtre üzerinden filtre. </li><li> Boyama çözüm kan smear daldırın ve 4 dakika boyunca inkübe (NOT: boyama çözüm dayanır metanol gibi smear metanol tespit gerekli değildir). </li><li> Yukarıda tarif edildiği gibi, iyonu giderilmiş su içinde durulama slaytlar ile yıkanır ve hava ile kurumasına slaytlar bırakın. </li><li> Giemsa / Wright &#39;ın leke tamamlandıktan sonra, hafifçe bir Buraton içeren bertaraf pota kullanılan tüm reaktifler aktarın. </li></ol></li><li> Kan yayması analizi <ol><li> Yağ daldırma ile 100 misli büyütmede, ışık mikroskobu ile lekeli kan smear analiz edin. </li><li> Eritrositler, bir tek tabaka halinde düzenlenmiş kan yayma bir alanda enfekte edilmemiş ve enfekte eritrositler sayısı. </li><li> Iyi tanımlanmış bir paraziteminin elde etmek için, bir tek tabaka eritrosit gösteren görünümü, en az 10 farklı alanları sayılır. </li><li> Calculeritrositlerin sayısına göre parazitli eritrosit sayısına bölünmesi ve 100 ile çarpılması ile (% olarak) göreli paraziteminin yedi. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mueller, A. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Transmission+of+Plasmodium+berghei+Exacerbates+Chronic+Tuberculosis+in+an+Experimental+Co-Infection+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Natural Transmission of Plasmodium berghei Exacerbates Chronic Tuberculosis in an Experimental Co-Infection Model.</a> PLoS ONE. 7, e48110(2012).</li>
<li>Korbel, D. S., Schneider, B. E., Schaible, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+tuberculosis%3A+myths+and+truth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in tuberculosis: myths and truth.</a> Microbes Infect. 10, 995-1004 (2008).</li>
<li>Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+parasite+development+in+the+mosquito+and+infection+of+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host.</a> Annu. Rev. Microbiol. 63, 195-221 (2009).</li>
<li>Cirimotich, C. M., Dong, Y., Garver, L. S., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+immune+defenses+against+Plasmodium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Compar.+Immuno%22%5BJournal%5D)">Mosquito immune defenses against Plasmodium infection.</a> Dev. Compar. Immuno. 34, 387-395 (2010).</li>
<li>Page, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium-induced+potentiation+of+type+1+immune+responses+and+protection+against+malaria+are+host+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium-induced potentiation of type 1 immune responses and protection against malaria are host specific.</a> Infect. Immun. 73, 8369-8380 (2005).</li>
<li>Hawkes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+exacerbates+experimental+mycobacterial+infection+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Malaria exacerbates experimental mycobacterial infection in vitro and in vivo.</a> Microbes Infect. 12, 864-874 (2010).</li>
<li>Scott, C. P., Kumar, N., Bishai, W. R., Manabe, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+report%3A+modulation+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection+by+Plasmodium+in+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Short report: modulation of Mycobacterium tuberculosis infection by Plasmodium in the murine model.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 70, 144-148 (2004).</li>
<li>Hoffman, S. L., Doolan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+vaccines-targeting+infected+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Malaria vaccines-targeting infected hepatocytes.</a> Nat. Med. 6, 1218-1219 (2000).</li>
<li>Mueller, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+attenuated+Plasmodium+berghei+liver+stages+persist+and+elicit+sterile+protection+primarily+via+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells.</a> Am. J. Pathol. 171, 107-115 (2007).</li>
<li>Mueller, A. K., Labaied, M., Kappe, S. H., Matuschewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+Plasmodium+parasites+as+a+protective+experimental+malaria+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetically modified Plasmodium parasites as a protective experimental malaria vaccine.</a> Nature. 433, 164-167 (2005).</li>
<li>Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+immunity+produced+by+the+injection+of+x-irradiated+sporozoites+of+plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei.</a> Nature. 216, 160-162 (1967).</li>
<li>Vaughan, J. A., Scheller, L. F., Wirtz, R. A., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+Plasmodium+berghei+sporozoites+delivered+by+intravenous+inoculation+versus+mosquito+bite%3A+implications+for+sporozoite+vaccine+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Infectivity of Plasmodium berghei sporozoites delivered by intravenous inoculation versus mosquito bite: implications for sporozoite vaccine trials.</a> Infect. Immun. 67, 4285-4289 (1999).</li>
<li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. , e228(2007).</li>
<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Plasmodium+berghei+reference+line+that+constitutively+expresses+GFP+at+a+high+level+throughout+the+complete+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).</li>
<li>Lin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-function+analyses+defines+vital+and+redundant+functions+of+the+Plasmodium+rhomboid+protease+family%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Loss-of-function analyses defines vital and redundant functions of the Plasmodium rhomboid protease family.</a> Mol. Microbiol. 88, 318-338 (2013).</li>
<li>Bancroft, J. D. G., M, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBancroft%2C+JDG+%22Theory+and+Practice+of+Histological+Techniques%22">Theory and Practice of Histological Techniques</a>. , Churchill Livingstone. New York. (2007).</li>
<li>Schneider, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+IL-18+in+protective+immunity+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A role for IL-18 in protective immunity against Mycobacterium tuberculosis.</a> Eur. J. Immunol. 40, 396-405 (2010).</li>
<li>Craig, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+animal+models+for+research+on+severe+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The role of animal models for research on severe malaria.</a> PLoS Pathog. 8, e1002401(2012).</li>
<li>de Souza, J. B., Hafalla, J. C., Riley, E. M., Couper, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+malaria%3A+why+experimental+murine+models+are+required+to+understand+the+pathogenesis+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Cerebral malaria: why experimental murine models are required to understand the pathogenesis of disease.</a> Parasitology. 137, 755-772 (2010).</li>
<li>Van den Steen, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopathology+and+dexamethasone+therapy+in+a+new+model+for+malaria-associated+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Immunopathology and dexamethasone therapy in a new model for malaria-associated acute respiratory distress syndrome.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 181, 957-968 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Biz fareler verimli Mtb ve P. ile enfekte olabilir nasıl tarif Enfeksiyon doğal yolla berghei. Biz deneysel tüberküloz 13 veya sıtma 12 çalışma enfeksiyon protokolleri kurulan ve son zamanlarda fare modelinde 1 Mtb ve Plasmodium arasında Koenfeksiyonu incelemek için onları kabul uygulanır. Başarılı enfeksiyon için en kritik adımlar, istenen sayı hem de patojen iletim bulunmaktadır. Zamanla canlılığını kaybeder çünkü Mikobakteriyel stokları 2 yıldan eski olmamalı ve stokların başlangıçta belirlenen titre büyük olasılıkla artık doğru olacaktır. Bunun bir sonucu olarak, enfeksiyon dozlar beklenenden daha düşük olacaktır. Bu nedenle, stok kültürleri CFU titerleri birkaç ayda belirlenmelidir. Aynı derecede önemli ilk etapta standart yetiştirme ve Mtb stoklarının nesil. Gibi kültür koşullarıorta, ek, zaman ve hacim Mtb farklı stokları kullanılarak yapılan deneylerden elde verileri karşılaştırma yapabilmek için standardize edilmelidir. Mikobakteri bu nedenle hasat bakteri aynı büyüme aşamasında, standart kültür koşulları tutmak ve şişelemeden sırasında sık sık tekrar süspansiyon önemlidir, kültür sırasında gelme eğilimindedir. Aksi CFU titreleri ve enfeksiyon sonucu geniş bir varyasyon olabilir. Homojen enfekte sivrisinek toplu nesil bir başka önemli adımdır. Farklı sivrisinek, her bir fare doyurmaya bu yana, bir enfeksiyon deney için kullanılan sivrisinek aynı partiden gelen ve sivrisineklerin% 90&#39;ından fazlası bulaşmış yalnızca toplu kullanılması önemlidir. Mevcut model bir enfekte edilmiş bağışıklık yanıtlarına karşılaştırarak bir koinfekte konakçıda bağışıklık karşılıklarının ve bağışıklık modülasyon incelemek için kullanılabilir. Biz va uygulayabilirsinizbu tipi, immünohistokimya, immün hücre popülasyonlarının sitometri analizi ya da ilgi konusu doku ya da vücut sıvılarını sitokin ve kemokin tespiti için PCR ve ELISA gibi rious iyi kurulmuş yöntemleri. Bu tür fare modelleri bazı kısıtlamalar olduğu unutulmamalıdır. Mtb ile enfekte kişilerin çoğunluğu klinik belirtilerin hiçbir belirti ile bir latent enfeksiyon gelişir ise, fareler, ilerleyici akciğer patolojisi olan bir kronik hastalığı gelişebilir. Yine de, C57BL / 6 fareleri, Mtb çok enfeksiyona karşı dayanıklı olup, tüberküloz, insan hastalarda görülen gibi klasik granülom gelişmez. Sonuç olarak, fare, otoimmün reaksiyonların uygun şekilde de gizli, ne de aktif insan tüberküloz hastalığına yansıtmaktadır. Insan ve fare latent ve kronik hastalığı arasındaki tutarsızlık rağmen, fareler yoğun Mtb enfeksiyonu kontrol etmek ve araştırmak için değerli ve vazgeçilmez araçlardır konakçı faktörleri belirlemek ve incelemek için kullanılmıştırbulaşıcı hastalıklarda bağışıklık tepkileri. Önemli olarak, Mtb enfeksiyona karşı hassasiyet yaygın olarak kullanılan fare soylannda ve bu DBA veya C3H daha fazla duyarlı suşları arasında önemli farklılıklar ko-ve tek enfeksiyon çalışmalara dahil edilebilir. Ayrıca, dışında burada tarif edilen patojen türünden, de (örneğin, klinik izolat) herhangi bir başka Mycobacterium türleri kullanılabilir. Tek bir sıtma modeli, insan hastalık farklı fare modellerinin tüm yönleriyle çoğaltır Aynı şekilde, yakından doğal kazanılmış insan sıtma enfeksiyonu farklı yönlerini benzemektedir. Örneğin, P. berghei ANKA ve P. yoelii YM/17XL yaygın olarak P., insan (P. falciparum kaynaklı) ağır sıtma modelleri çalışılmaktadır berghei ANKA insan serebral malari s 14,15 için mükemmel bir model olarak kabul ediliyor. P. berghei NK65 hyperparasitaemia ve akut sıtma anemi için mükemmel bir model olduğunu ve son zamanlarda olmuştursıtma ilişkili akut solunum distres sendromu (ARDS MA-16) için deneysel bir modeli olarak tarif. Açıklanan koenfeksiyonuna modelini kullanarak, son zamanlarda gösteriyor ki eşzamanlı P. berghei NK65 enfeksiyonu kronik tüberküloz 1 şiddetlendirir. Apart farklı kemirgen sıtma parazitleri kullanarak, enfeksiyon olayların sırası ve zamanlaması yatan araştırma sorusuna bağlı olarak adapte edilebilir. Alanında, eşlik eden enfeksiyonların Plasmodium Mtb enfeksiyonu zamanında mevcut ya da sonradan edinilmiş olabilir. Her iki senaryoda da Mtb ve Plasmodium bağışıklık tepkileri farklı şekilde etkilenebilir. Bu nedenle, fareler önce veya Mtb sonra enfeksiyon ya Plasmodium sporozoitler ile enfekte olabilir. Dahası, fareler farklı zamanlarda itiraz edilebilir kronik karşı akut üzerinde Plasmodium-uyarılmış bağışıklık tepkisinin etkisini değerlendirmek için Mtb efeksiyonutüberküloz. Sıtma tüberküloz Koenfeksiyonu eğitim için bir sıtma paraziti seçerken önemlisi, bir bazı kemirgen Plasmodium suşları bazı fare türlerinde akut hastalığa neden ve Mtb kronik ve imünokompetan uzun süreli enfeksiyonlara neden olurken, sadece gün veya hafta içinde enfeksiyon yenik farkında olmalıdır fareler. Bu nedenle, koenfeksiyonu zamanlaması deney hayvanlarının erken ölüm önlemek için çok önemlidir. Birden fazla patojen türleri ile aynı anda bir ev sahibi enfeksiyonu ile bağışıklık modülasyonu az anlaşılmaktadır. Bir koinfekte konağın bağışıklık sistemi ile Plasmodium etkileşim ve coinfections patogenezi, hastalık sonucu, aşılama, Immunodiagnostics ve tedavisi nasıl etkilediğini anlamamıza katkıda bulunacaktır - Bizim deneysel koenfeksiyonuna modeli Mycobacterium araştırmak için güçlü bir araç sağlar.

İnsan popülasyonları nadiren tek bir patojene maruz kalmaktadır. Özellikle böyle Sahra-altı Afrika gibi enfeksiyonların insidansı yüksek olan bölgelerde, coinfections bir başbakan ama son derece hakir halk sağlığı sorunu oluşturmaktadır. Tüberküloz ve sıtma sırasıyla insanlarda, en yaygın bakteriyel ve paraziter enfeksiyonlar ve tropik yoksul toplumlarda morbidite ve mortalite nedenidir olmaya devam etmektedir. Koenfeksiyonu riski tüberküloz ve sıtma ve bireylerin çok sayıda arasındaki geniş coğrafi örtüşme olmasına rağmen, çok az eşzamanlı koinfekte bireylerde sıtma parazitlerinin ve tüberküloz basilinin karşı ortaya çeşitli ve genellikle mücadele immün düzenleyiciler ve efektörler arasındaki etkileşimleri hakkında bilinmektedir. Karışık enfeksiyonların kemirgen modelleri, böylece karşılıklı gribin ışık tutan, bir konakta farklı patojenlere karşı diferansiyel bağışıklık reaksiyonlarını karakterize izinAyrıca tedavi ve önlenmesi için yeni öneriler belirlemek yardımcı olacaktır modüle patoloji ve bireysel hastalığın klinik gidişini, farklılıklara. Biz aynı ana 1. içinde Mycobacterium tuberculosis (MTB) ile eşzamanlı enfeksiyon neden etkileri ve kemirgen Plasmodium türlerini araştırmak için bize sağlayan deneysel bir fare modeli kurduk. Önemlisi, mümkün olduğunca yakından doğal kazanılmış insan enfeksiyonları taklit etmek, bizim modeli hem patojenler tarafından kullanılan enfeksiyon doğal yolları uygular. Tüberküloz, bu nedenle esas olarak akciğerlerde gösteren bir hava enfeksiyondur. Onlar öksürme veya hapşırma sırasında bulaşıcı aerosol damlacıkları sınırdışı zaman etkeni, Mtb aerosol yolla aktif hastalığı olan kişiler tarafından iletilir. Bu nedenle, aerosol enfeksiyon doğal enfeksiyonu taklit etmek için tercih edilen bir yöntemdir. MTB içeren havadaki partiküllerin Generation kullanımı ile elde edilebilirBir inhalasyon pozlama sistemi. Bütün vücut maruz odası bulaşıcı aerosol damlacıkları enfeksiyon 2 başlatılır akciğerlerin alveollerine solunması (Şekil 1) Mtb içeren deneysel hayvanlar maruz sağlar. Öte yandan Malaria doğal bir dişi sivrisinek anopheline türü ısırması ile iletilir protozoon Apicomplexan parazit Plasmodium neden olduğu bir vektör kaynaklı bir hastalıktır. Kan yemek sırasında, enfeksiyon sporozoites konakçı deri altında yatırılır ve daha sonra, kan dolaşımı yoluyla karaciğer ulaşır. Hepatositler içinde onlar geliştirmek ve hızla karaciğer aşamalı schizontsun içine çarpın. Sonunda, olgun schizontsun delinmesine ve kırmızı hücre işgali, çoğaltma, kırmızı hücre rüptürü, ve reinvasion 3 aşamalı bir döngüsü başlatmak nerede kan akışı içine patojenik ilk-nesil merozoit binlerce bırakın. Plasmodium yaşam döngüsü pazaBazı merozoit gibi daah cinsel parazit aşamalarında, kan yemek sırasında sivrisinekler tarafından alınabilir erkek ve dişi gametositlerine, gelişir. Sivrisinek, Plasmodium sporozoites sivrisinek midgut ikamet oocystsu içinde gelişir ve sonunda başka bir konak 3,4 içine nakil için tükürük bezlerine göç. Deneysel hayvan modellerinde, aerosol ve böylece en uygun yol aracılığıyla Mtb teslim çok yaygın olsa da, sıtma-tüberküloz koenfeksiyonu 5-7 ile ilgili çalışmalar dahil olmak üzere pek çok deneysel çalışmalar kemirgen Plasmodium enfeksiyon yol açan, parazitli eritrosit ile enfekte fareler ile gerçekleştirilmiştir Klinik olarak sessiz karaciğer kademeli faz hariç tutulduğunda kan aşamalı sıtma enfeksiyonuna. Bununla birlikte, anti-karaciğer aşama plasmodial bağışıklık 8-11 için enfeksiyon ve ilgili sırasında zorunlu bir adımdır. Biz karaciğer ph dahil etmek bu nedenle önemli düşününsıtma iletim ve sırasıyla sıtma ve sıtma-tüberküloz koenfeksiyonu, her iki çalışmalarında bakım ase. Buna ek olarak, doğal olarak iletilen sporozoites yerine izole tükürük bezi türetilmiş sporozoites enjekte bite sivrisinek ile sıtma enfeksiyonu belirlemek için istenir iğne enfeksiyonlar 12 üzerinden aktarılır daha fazla bulaşıcı olduğu gösterilmiştir. Sıtma parazitlerinin doğal iletimi için bulaşıcı sivrisinek elde etmek için tek yol omurgalı bir konakçının (burada fare) ve sivrisinek vektör hem de parazitin tüm yaşam döngüsü korumaktır. Böylece, parazit bakım için bir insectary erişim lokma doğal iletimini gerçekleştirmek için kaçınılmazdır. Burada tarif Bizim protokol Plasmodium ile koenfeksiyonuna kronik tüberküloz 1 üzerindeki etkilerini Sporozoitlere nasıl araştırmak için geliştirilmiştir. Bunu yapmak için, farenin aerosol M. bulaştırılır tüberküloz ve 40 gün sonra, ne zaman M. tüberküloz enfeksiyonu fareler sıtma bulaşıcı sivrisinek maruz kalan, kronik faz ulaşmıştır. Koinfekte hayvanlarda sıtma ve tüberküloz her ikisinin de sonucu sırasıyla dokusundaki kan paraziteminin ve bakteri yükü izlenmesi ile takip edilebilir. Protokolde, biz onların doğal enfeksiyon güzergahı ve ne kadar başarılı patojen bulaşmasını teyit etmek yoluyla hem de patojenler ile fareler bulaştırmak için nasıl ayrıntılı olarak anlatacağız. Bizim ellerde, hem deneysel enfeksiyonlara sık elde enfeksiyon oranı% 100&#39;dür. Bu protokoller, en zor insan enfeksiyon hastalıklarının ikisi arasında-enfeksiyon modeli ve çalışma için bizim gibi ayrı ayrı enfeksiyonlar ya da, her iki çalışma uygulanabilir. Bu model, bu protokolde tarif edilenler dışındaki diğer Mycobacterium kemirgen ve Plasmodium türleri için de geçerlidir.

<table><tbody><tr><td>Buraton</td><td>Sch&uuml; lke</td><td></td><td>aktif bileşenler: aldehitler (formaldehit, glutaraldehit, oksalaldehit, etil hekzanal)</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M0178</td><td>Mtb et suyu kültürleri için</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H11&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>283810</td><td>Mtb kültürü için Agar ortamı</td></tr><tr><td>Middlebrook OADC zenginleştirme ortamı</td><td>BD Biosciences</td><td>212240</td><td>Mtb kültürü için 7H9 ve 7H11'e ekleyin</td></tr><tr><td>Boyama Kabı</td><td>Bilim Hizmetleri</td><td>E62542-12</td><td></td></tr><tr><td>Saplı 24 Kızaklı Tutucu Bilim</td><td>Hizmetleri</td><td>E62543-06</td><td></td></tr><tr><td>Giemsas Azur-Eozin-Metilen mavisi çözeltisi</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td>109204</tr><tr><td>Wright&akut; s leke</td><td>Sigma</td><td>W0625</td><td></td></tr><tr><td>Soluma Maruz Kalma Sistemi</td><td>Glas-Col</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nebulizatör-Venturi</td><td>Glas-Col</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dondurma kapları</td><td>H&auml; agen-Dazs</td><td>Sivrisinek kafesi</td><td></td> olarak kullanılır</tr><tr><td>Metal çerçeveli sivrisinek kafesleri</td><td>BioQuip Ürünleri</td><td>1450A</td><td></td></tr></tbody></table>

doğal İletim üzerine tüberküloz-sıtma koenfeksiyonu Çalışması için deneysel bir model mycobacterium tuberculosis ve plasmodium berghei</i

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections dolayı doğal patojen organizmaların farklı türlerine coğrafi üst üste meydana gelir. Eşzamanlı enfeksiyonları büyük olasılıkla her bir patojene ilgili immün yanıtı düzenleyen ve böylece patogenezi ve hastalık sonuçlarını etkileyebilir. Koinfekte hastaların aynı zamanda anti-enfektif müdahalelere farklı şekilde yanıt verebilir. Mikobakteriler ve Sahra-altı Afrika&#39;nın birçok yerinde coendemic her ikisi de sıtma paraziti Plasmodium, neden olarak tüberküloz arasındaki Koenfeksiyonu detaylı olarak çalışılmamıştır. Bilimsel ve sıtma tüberküloz koenfeksiyonuna modüle konak bağışıklık ve her hastalığın seyri, bize koinfekte konakta hem patojenlere elicited bağışıklık tepkilerini incelemek için izin veren deneysel bir fare modeli kurulmuş nasıl klinik son derece alakalı soru zor ama yaklaşmak için . Notun, en doğrusu mimik doğal kazanılmış insan enfeksiyonları için, deneysel gerçekleştirmeksırasıyla enfeksiyon doğal yolları, yani aerosol ve sivrisinek ısırığı, hem patojenler ile farelerin enfeksiyonları.

Mtb ve P. ile farelerin enfeksiyonu doğal yoldan örneğin, aerosol ve sivrisinek ısırığı, sırasıyla, her hayvan (Tablo 1) tutarlı ve tekrarlanabilir enfeksiyon sonuçları ile berghei 1. Biz başarılı enfeksiyonu ve kan sırasıyla (P. berghei parazitemisi) ve farklı organlarda Mtb yükü, başlangıçtaki oluşumu (prepatensi) ve parazitlerin sayısını belirleyerek sıtma ve tüberküloz hem ders izleyebilirsiniz. Bulaşıcı sivrisinek ısırması ile başarılı bir sıtma paraziti iletiminin bir örneği, Tablo 1 ve Şekil 3 'de gösterilmiştir. 4-5 gün sonra (Tablo 1 ve Şekil 3A), kan-aşaması parazitlerin varlığı ile teyit edildiği gibi, her bir fare 10-sporozoit bulaşmış sivrisinek Besleme% 100 enfeksiyon oranı ile sonuçlanmıştır. Önemli bir şekilde, aynı deney gr tek tek farelerden kan içindeki parazit numaraları bulmakoup, tutarlı ve tekrarlanabilir enfeksiyon sivrisinek ısırığı sonuçlarına göre bu sporozoit iletimini göstermektedir. Mtb-koinfekte hayvanlannınki ile naif kontrol farelerinde hale gelmesinden karşılaştırarak, bu açık hale gelmesinden biraz Mtb (Tablo 1, Şekil 3B) ile preinfected edilmiş farelerde gecikir görebilirsiniz 1. Daha önce 1 rapor gibi Şekil 3B gösterildiği gibi, biz Giemsa lekeli kan lekeleriyle günlük izleme parazitemi tarafından sıtma seyrine Mtb koenfeksiyonu etkisini belirleyebilirsiniz. Farelerin bireysel (Şekil 4A) arasında göreceli olarak düşük bir değişkenlik akciğerlerdeki bakteri başarılı depozisyonunda bir solunması sistemi sonuçları kullanılmasıyla Mtb ile farelerin enfeksiyonu. Biz akciğerler ve CFU belirlenmesi ile zamanla ilgi diğer organlarda mikrobakteriyel yükleri takip edebilirsiniz. Ciğerlerinde mikobakteriyel yük için bir örnekMtb P. yokluğunda veya varlığında, C57BL / 6 fareleri enfekte berghei Şekil 4B'de gösterilmiştir. Tablo 1. Prepatensi sivrisinek ısırması ile sporozoit iletiminden sonra. Tüm fareler P. doğal iletiminden sonra kan-aşamalı enfeksiyonları geliştirilen berghei sivrisinek ısırığı ile Sporozoitlere. 1 PLoS ONE, izni ile 7 (10), e48110 uyarlanmıştır. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Deney fare grubu (C57BL / 6) </td><td> 10 bulaşıcı sivrisinek ısırıkları ile meydan </td><td> Grup başına hayvan kan kademeli pozitif hayvan / No No </td><td> Ortalama prepatensi [d] </td></tr><tr><td> naif </td><td> P. berghei </td><td> 07/07 </td><td> 4,4 </td></tr><tr><td> Mtb enfekte </td><td> P. berghei </td><td> 07/07 </td><td> 5,5 d&gt; </td></tr></tbody></table><img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1.jpg"> Şekil 1. Deneysel prosedür genel şeması. C57BL / 6 fareler, Glas-Col aerosol odasındaki Mtb içeren aerosol damlacıkları maruz kalmaktadır. Bir gün aerosol enfeksiyondan sonra, Mtb alımının akciğerin CFU analizi ile doğrulanır. (Tüberküloz enfekte farelerde kronik hale gelmiştir) Mtb meydan, hayvanlar P. maruz kalan yaklaşık 40 gün sonra berghei sivrisinek enfekte. Başarılı sporozoit iletim onaylamak ve Plasmodium enfeksiyonun seyrini takip etmek, parazitemisi sivrisinek ısırığı 3 gün sonra başlayan Giemsa lekeli kan lekeleriyle günlük takip edilmektedir. / Files/ftp_upload/50829/50829fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50829/50829fig2.jpg "/&gt; Şekil 2. Bir sivrisinek kafesinin kroki. Bulaşıcı sivrisinek gibi bir yarım litrelik dondurma karton gibi bir karton içinde yer alır. Küçük bir açıklık kartonun yan kesilir ve sivrisinekler için güvenli bir giriş oluşturmak için her bir parça kesilmiş bir yarık ile lateks bir çift tabaka ile kaplanır. Filtre kağıt parçası damlaları kadar emmek için kartonun iç alt bantlanmış. Dondurma bardak bant ve elastik bant ile kartonun sabitlenmiş olduğu bir (Nylon ağ) örgü ile kapalıdır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3.jpg"> Şekil 3,. Parazitli eritrosit (Ölçek bar, 20 &amp; # gösteren bir Wright `ın lekeli kan yaymasında kan parazitemisi. A) Örnek181;. Fare kanında m) B) Parazitemi günde Giemsa lekeli kan lekesi analizi ile izlenmiştir. Koinfekte farenin Plasmodium tek enfekte edilmiş farelerin (n = 10) ile karşılaştırıldığında daha düşük bir paraziteminin sahiptir; sonuçlar ± SD aracı olarak gösterilmiştir; *** p &lt;0.001. 1 PLoS ONE, izni ile 7 (10), e48110 yayımlanmaktadır. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4.jpg"> Şekil 4. Akciğerde Mtb tespiti. C57BL / 6 fareleri aerosol Mtb 100 CFU ile tehdit edildi ve P ile 40 gün sonra, koinfekte berghei sivrisinek ısırmasıyla. A) bir gün aerosol Mtb enfeksiyonundan sonra, istenen sayıda alım CFU belirlenmesi için bütün akciğer homojenatları kaplama ile doğrulanmıştır. B) Bakterilerkoenfeksiyonu zamanında l yükler CFU analizi (Mtb d40/d0) üzerinden 3 fareden Akciğer lizatları içinde belirlenmiştir. 12 gün koenfeksiyonu sonra, akciğer lisatlar Mtb kontrolü Plasmodium koenfeksiyonu etkisini belirlemek CFU analiz için kaplandı. Akciğerlerde Mtb P. numaraları ile birlikte-enfeksiyon sırasında arttığını, dikkat berghei NK65. X-ekseni etiketleme: koenfeksiyonu sonra Mtb -infection/time sonra zaman. 1 PLoS ONE, izni ile 7 (10), e48110 uyarlanmıştır.

Tüberküloz ve sıtma insan ve tropik yoksul toplumlarda morbidite ve mortalitenin önemli nedenlerinden en yaygın enfeksiyonlardan ikisidir. Bu enfeksiyon, doğal yoldan hem patojenler ile yüklemeden sonra farelerde sıtmaya tüberküloz koenfeksiyonu sonucunu çalışma deneysel bir model sistemi kurulmuştur.

Doğal İletim üzerine Tüberküloz-Sıtma Koenfeksiyonu Çalışması için Deneysel Bir Model Mycobacterium tuberculosis Ve Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Bu prosedürün genel amacı, in vivo olarak tüberküloz ve sıtma ile eşzamanlı enfeksiyonun sonuçlarını araştırmak için kullanılabilecek deneysel bir fare modeli oluşturmaktır. Bu, ilk olarak deney hayvanlarının em'e maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. Bir inhalasyon maruz kalma sistemi kullanarak bulaşıcı aerosol damlacıkları içeren tüberküloz.İkinci adımda, istenen sayıda M tüberkülozunun tutulumu, akciğer dokusunun CFU analizi ile doğrulanır. Aerosol enfeksiyonundan bir gün sonra, 40 gün sonra, fareler, kan yemeği sırasında tüm cilt altında biriken plazmodium sporozoitlerinin doğal iletimi için bulaşıcı sivrisineklere maruz bırakılır. Son adımda, sıtma kan evresi parazitinin gelişimi, giemsa lekeleri, kan yaymalarının analizi ile izlenir.Sonuç olarak, akciğerdeki em tüberküloz yükü ve koenfekte hayvanların kanındaki parazitlerin sayısı, tüberküloz ve sıtmanın seyrini belirlemek için sıralanabilir. Bu yöntem, tüberküloz, sıtma koenfeksiyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: Sıtma paraziti ile koenfeksiyon, mikobakteri tüberkülozu enfeksiyonunun patogenezini ve kontrolünü nasıl etkiler? Bu Protokol, odium buri ile koenfeksiyonun, immün yetmezliği yeterli bir C 57 PL altı fare olan mikrobiyyum tüberkülozunun kronik fazını nasıl etkilediğini araştırmak için geliştirilmiştir.Ayrıca, nakavt fareler de dahil olmak üzere diğer fare türlerine uygulanabilir veya diğer mikobakteri veya odium türleriyle birlikte kullanılabilir. Mycobacterium tuberculosis'i ısıtarak başlayın. Bilinen bir CFU titresinin hisse senetleri.Hücreler çözüldüğünde, bakteri kümelerini dağıtmak için süspansiyonu beş kez dikkatlice karıştırmak için 27 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanın, aerosol üretiminden kaçının, istenen enfeksiyon dozuna bağlı olarak mikobakteri stoğunun gerekli hacmini steril PBS içeren 50 mililitrelik bir tüpe altı mililitrelik bir nihai hacme aktarın. Daha sonra, deney hayvanlarını ayrı ayrı bölmeli örgü sepetlere yerleştirin. Sepetleri dairesel aerosol odasına yerleştirin ve haznenin kapağını kapatın.Venturi nebulizatör ünitesini üç paslanmaz çelik soket bağlantısına takın. Mikobakteriyel süspansiyonu 18 gauge künt iğne ile donatılmış 10 mililitrelik bir şırıngaya aspire edin ve şırıngayı kapalı bir taşıma kutusunda aerosol odasına taşıyın. Şimdi nebulizatör vidalı kapağını çıkarın ve mikobakteri süspansiyonunu üniteye dikkatlice enjekte edin.Aerosol oluşumunu önlemeye özen gösterin. Şırıngayı %2 Burton içeren keskin bir kaba atın ve ardından nebulizatörü kapatın. Döngü tamamlandığında inhalasyon aparatını çalıştırın.Aerosol odasını açmadan önce mikobakteri süspansiyonunun tamamen nebulize edildiğini onaylayın. Motorlu bir hava temizleyici solunum cihazı kasklarını takın, ardından hayvanları kafeslerine geri koyun, aerosol enfeksiyonundan bir gün sonra nebulizatör sepetlerini ve aerosol odasının içini sterilize edin, belirlenmiş ötenazi kontrol hayvanlarını ikinci sınıf bir biyogüvenlik kabininde bir diseksiyon tahtası üzerine emici kağıda yerleştirin ve fareleri her fare için% 70 etanol ile dezenfekte edin. İlk olarak, karnın ortasında küçük bir kesi yapın ve ardından cildi hayvanın başının üzerine geri çekin.Ardından, karın ve göğüs kafesini açmak için cerrahi makas kullanın. Göğüs duvarını, akciğerlere erişilebilecek şekilde çıkarın ve ardından çıkarın. Akciğerleri iki mililitre homojenizasyon tamponu ile 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve daha sonra dokuyu 100 mikrometre eleklerden küçük bir Petri kabına süzmek için pistonu beş mililitrelik bir şırıngadan kullanın.Bariyer ucu ile donatılmış bir mililitrelik bir pipet kullanarak, eleği birkaç kez yıkayın ve ardından yaklaşık 250 mikrolitre akciğer homojenatını sekiz agar plakası arasında dağıtın. Plakalar kuruduğunda numuneleri dikkatlice kaplamak için tek kullanımlık yayıcılar kullanın. Her plakayı perfil ile kapatın.Onları alüminyum folyoya sarın ve en az dört hafta boyunca 37 santigrat derecede dik olarak inkübe edin. Saf veya mikobakteri ile enfekte olmuş fareleri sivrisinek ısırıkları ile sıtma ile enfekte etmek için, anestezi uygulanmış hayvanları sivrisinek kafeslerinin ağına yerleştirin ve bulaşıcı sivrisineklerin başarılı sporozoit iletimini sağlamak için zardan beslenmesine izin verin. Fareleri kafeslerde 10 ila 15 dakika bekletin.Fareleri kafeslerine bir kağıt havluya geri aktarın ve anesteziden uyanana kadar sıcak tutmak için üzerlerini bir kağıt havluyla örtün. Sivrisinekleri kafesin ağından %70 etanol veya diğer dezenfektanlar püskürterek öldürün ve kafesleri otoklavlayarak sterilize edin. Parayı izlemek için, enfekte olmuş her hayvanın damarının en ucunu delmek için bir iğne kullanın ve bir damla kan toplayın.Bir cam kaydırağın her iki ucunda, alt kaydırağın uzunluğunun yarısından fazla bir damla kan çekmek için başka bir kaydırak kullanın. Ardından yayma sürgüsünü ters çevirin ve ikinci leke için diğer kenarı kullanın. Slaytları bir boyama rafına yerleştirin.Kan lekelerini mutlak metanol içinde kısaca sabitleyin ve ardından havayla kurutun. Daha sonra slaytlar, lekeleri Giza'ya daldırın. 10 dakika sonra, fazla lekeyi durulamak için slaytları deiyonize suyla doldurulmuş boyama damarlarının içine ve dışına birkaç kez daldırın.Son olarak, slaytları dikey konumda havayla kurutun. Deney hayvanlarının sivrisinek ısırıkları ile sporozoitin neden olduğu enfeksiyon, dört ila beş gün sonra kan evresi parazitlerinin varlığı ile doğrulandığı gibi% 100 enfeksiyon oranı ile sonuçlanır. Tabloda gösterildiği gibi, hem naif hem de m tüberkülozu ile enfekte farelerin sivrisinek ısırıkları ile plasmodium buri ile enfeksiyonu, bir deney grubundaki tüm hayvanların tutarlı ve tekrarlanabilir enfeksiyonu ile sonuçlanır.Pre pre pre ve naif kontrol fareleri ile mycobacterium tuberculosis ko-enfekte hayvanlar karşılaştırıldığında, pre açıklığın biraz geciktiği gözlemlenebilir. Mikobakteri tüberkülozu ile önceden enfekte olmuş farelerde, bir inhalasyon maruz kalma sistemi kullanılarak mikobakteri tüberkülozlu farelerde, bireysel fareler arasında nispeten düşük değişkenlik ile bakterilerin hayvanın akciğerlerine başarılı bir şekilde birikmesine neden olur. Enfekte C 57 siyah altı farenin akciğerlerindeki mikobakteriyel yükler p burga varlığında artar.Buna karşılık, ko-enfekte fareler, plasmodium tek enfekte farelere kıyasla daha düşük bir paraemiye sahiptir. Bu prosedürü takiben, mal parazitlere ve tüberkül bazisine karşı eş zamanlı olarak ortaya çıkan immün yanıtları ve bunların ko-enfekte konakçıdaki etkileşimlerini incelemek için ilgilenilen doku veya vücut sıvıları üzerinde akış sitometrisi, PCR Eliza veya histolojik teknikler gibi yöntemler uygulanabilir. İnsan patojeni mikrobakteri tüberkülozu ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve her zaman bulaşıcı aerosollere maruz kalmamak için önlemler alınması gerektiğini unutmayın.Mikrobakteri tüberkülozu ile ilgili tüm deneysel çalışmalar, uygun biyogüvenlik seviyesi üç tesislerinde gerçekleştirilmelidir.

an-experimental-model-to-study-tuberculosis-malaria-coinfection-upon

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Kaynak: Mueller, A. ve diğerleri. Mycobacterium tuberculosis ve Plasmodium berghei'nin doğal bulaşımı üzerine tüberküloz-sıtma koenfeksiyonunu incelemek için deneysel bir model. J. Vis. Exp. (2014)Bu video, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) aerosol olarak farelere aerosol olarak ulaşımı ve nebulizator tabanlı bir oda sistemi kullanılarak akciğer enfeksiyonu indükte göstererek, havadan tüberküloz iletimi ve konak-patojenler etkileşimlerini in vivo incelemek için kontrollü ve tekrarlanabilir bir...

Fare modelinde Mycobacterium tuberculosis'in akciğer enfeksiyonu için aerosol iletimi

Bu video, insan M1 ve M2 polarize monosit türevi makrofajlarda Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonuna verilen yanıtları incelemek için bir yöntemi göstermektedir. Akış sitometrisinin kullanımı, enfekte olmuş ve enfekte olmamış makrofaj popülasyonları ile ilişkili çeşitli yüzey belirteçlerinin incelenmesini sağlar.

Mycobacterium tuberculosis ile Monosit Kaynaklı Hücrelerin Tam Farklılaşmış Makrofaj Enfeksiyon Modeli

Bu video, in vitro sıtma-HIV ko-enfeksiyon hücre kültürü modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Plasmodium falciparum parazitize eritrositlerle birlikte kültürlenen HIV ile enfekte periferik kan mononükleer hücreleri, potansiyel olarak birbirlerinin büyümesini destekler ve HIV ve sıtma ko-enfeksiyonlarında bağışıklık tepkileri ve hastalığın ilerlemesi hakkında bilgi sağlar.

Sıtma-HIV Ko-Enfeksiyonunun İn Vitro Hücre Kültürü Modelinin Oluşturulması

Bu video, serebral sıtmanın deneysel bir fare modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Plasmodium berghei ile enfekte dişi sivrisineklerden izole edilen sporozoitler, kısıtlanmış bir farenin kuyruk damarlarına enjekte edilir, bu da kan-beyin bariyerinin bozulmasına ve beyin iltihabına yol açarak serebral sıtmaya neden olur. Bu enfekte fare modeli, serebral sıtma ile ilişkili in vivo mikrovasküler patolojiyi incelemek için değerli bir araç sunar.

Konakçı sivrisinek türevli sporozoitler kullanılarak deneysel serebral sıtmanın bir fare modelinin oluşturulması

İnsan ko-enfeksiyonunun in vitro olarak çoğaltılması zordur. Bununla birlikte, insan sıtma parazitleri, doğal olarak HIV ile enfekte olmuş taze izole edilmiş insan periferik kan mononükleer hücreleri gibi, in vitro olarak kolayca kültürlenebilir. Bu, HIV ko-enfeksiyonu bağlamında sıtma parazitlerine karşı erken bağışıklık tepkilerini incelemek için mükemmel bir model sağlar.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV Co-enfeksiyon Bağlamında Sıtma için Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Modeli

İnsan tüberkülozu enfeksiyonu, in vitro olarak modellenmesi zor olan karmaşık bir süreçtir. Burada, bağışıklık hücrelerinin göçü ve fizyolojik bir ortamda erken granülom oluşumu da dahil olmak üzere enfeksiyon sırasında meydana gelen dinamikleri özetleyen yeni bir 3D insan akciğer dokusu modelini açıklıyoruz.

Fonksiyonel Araştırmaları 3D İnsan Akciğer Doku Modeli<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Enfeksiyon

Deneysel serebral sıtmanın bir fare modelini tarif ediyoruz ve manyetik rezonans görüntüleme kullanılarak inflamatuar ve mikrovasküler patolojinin in vivo olarak nasıl izlenebileceğini gösteriyoruz.

Manyetik Rezonans Görüntüleme Kullanarak Deneysel Serebral Sıtma Bir Modelinde Ödem Gelişimi ve Mikrovasküler Patolojinin İn Vivo Takibi

Burada, içinde bir yetişkin zebra balığı kendi doğal patojen Mycobacterium marinumkullanarak bir iletişim kuralı modeli insan tüberküloz için mevcut. Ayıklanan DNA ve RNA gelen virüslü zebra balığı iç organlarının balıklar ve ana bilgisayarın bağışıklık yanıtı qPCR ile toplam Mikobakteriyel yükler ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

Galleria mellonella son zamanlarda Mycobacterium tüberküloz kompleksi için reproducible, ucuz ve etik olarak kabul edilebilir bir enfeksiyon modeli olarak kurulmuştur. Burada, Bioluminesans Mycobacterium bovis BCG Lux ile G. mellonella 'nın başarılı enfeksiyonunu kurmak için alınan adımları tarif ediyoruz ve gösteriyoruz .

Mycobacterium tüberküloz kompleksinin incelenmesi Için bir enfeksiyon modeli olarak ınvertebrate Galleria mellonella kullanımı

Burada, zayıflatılmış BSL-2 onaylı Mycobacterium tuberculosis'un intravital görüntüleme protokolünü sunuyoruz. sürün akciğerinde kalıcı akciğer penceresi kullanarak. Bu yaklaşım, aynı akciğer mikro ortamında bakteriler lokalizasyonu, damar dinamikleri ve makrofaj alımı dahil olmak üzere erken konakçı-patojen etkileşimlerinin uzunlamasına, tek hücre çözünürlüklü analizini mümkün kılar.

Erken Intravasküler Enfeksiyonda Sönmüş Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Sönük Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Erken Intravasküler Enfeksiyonda

Keşfedin, tüberküloz ve sıtma koenfeksiyonunu fare modelinde in vivo araştırmak için aerosol inhalasyonu ve doğal bulaş yöntemlerini. Bu yöntem patojen etkileşimlerini ve immün yanıtları analiz etmeye yardımcı olur.

Doğal İletim üzerine Tüberküloz-Sıtma Koenfeksiyonu Çalışması için Deneysel Bir Model Mycobacterium tuberculosis Ve Plasmodium berghei /i (Video) | JoVE Journal

Doğal İletim üzerine Tüberküloz-Sıtma Koenfeksiyonu Çalışması için Deneysel Bir Model Mycobacterium tuberculosis Ve Plasmodium berghei

Daha fazla video keşfet