Doğal İletim üzerine Tüberküloz-Sıtma Koenfeksiyonu Çalışması için Deneysel Bir Model Mycobacterium tuberculosis Ve Plasmodium berghei

Bu prosedürün genel amacı, in vivo olarak tüberküloz ve sıtma ile eşzamanlı enfeksiyonun sonuçlarını araştırmak için kullanılabilecek deneysel bir fare modeli oluşturmaktır. Bu, ilk olarak deney hayvanlarının em'e maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. Bir inhalasyon maruz kalma sistemi kullanarak bulaşıcı aerosol damlacıkları içeren tüberküloz.

İkinci adımda, istenen sayıda M tüberkülozunun tutulumu, akciğer dokusunun CFU analizi ile doğrulanır. Aerosol enfeksiyonundan bir gün sonra, 40 gün sonra, fareler, kan yemeği sırasında tüm cilt altında biriken plazmodium sporozoitlerinin doğal iletimi için bulaşıcı sivrisineklere maruz bırakılır. Son adımda, sıtma kan evresi parazitinin gelişimi, giemsa lekeleri, kan yaymalarının analizi ile izlenir.

Sonuç olarak, akciğerdeki em tüberküloz yükü ve koenfekte hayvanların kanındaki parazitlerin sayısı, tüberküloz ve sıtmanın seyrini belirlemek için sıralanabilir. Bu yöntem, tüberküloz, sıtma koenfeksiyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: Sıtma paraziti ile koenfeksiyon, mikobakteri tüberkülozu enfeksiyonunun patogenezini ve kontrolünü nasıl etkiler? Bu Protokol, odium buri ile koenfeksiyonun, immün yetmezliği yeterli bir C 57 PL altı fare olan mikrobiyyum tüberkülozunun kronik fazını nasıl etkilediğini araştırmak için geliştirilmiştir.

Ayrıca, nakavt fareler de dahil olmak üzere diğer fare türlerine uygulanabilir veya diğer mikobakteri veya odium türleriyle birlikte kullanılabilir. Mycobacterium tuberculosis'i ısıtarak başlayın. Bilinen bir CFU titresinin hisse senetleri.

Hücreler çözüldüğünde, bakteri kümelerini dağıtmak için süspansiyonu beş kez dikkatlice karıştırmak için 27 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanın, aerosol üretiminden kaçının, istenen enfeksiyon dozuna bağlı olarak mikobakteri stoğunun gerekli hacmini steril PBS içeren 50 mililitrelik bir tüpe altı mililitrelik bir nihai hacme aktarın. Daha sonra, deney hayvanlarını ayrı ayrı bölmeli örgü sepetlere yerleştirin. Sepetleri dairesel aerosol odasına yerleştirin ve haznenin kapağını kapatın.

Venturi nebulizatör ünitesini üç paslanmaz çelik soket bağlantısına takın. Mikobakteriyel süspansiyonu 18 gauge künt iğne ile donatılmış 10 mililitrelik bir şırıngaya aspire edin ve şırıngayı kapalı bir taşıma kutusunda aerosol odasına taşıyın. Şimdi nebulizatör vidalı kapağını çıkarın ve mikobakteri süspansiyonunu üniteye dikkatlice enjekte edin.

Aerosol oluşumunu önlemeye özen gösterin. Şırıngayı %2 Burton içeren keskin bir kaba atın ve ardından nebulizatörü kapatın. Döngü tamamlandığında inhalasyon aparatını çalıştırın.

Aerosol odasını açmadan önce mikobakteri süspansiyonunun tamamen nebulize edildiğini onaylayın. Motorlu bir hava temizleyici solunum cihazı kasklarını takın, ardından hayvanları kafeslerine geri koyun, aerosol enfeksiyonundan bir gün sonra nebulizatör sepetlerini ve aerosol odasının içini sterilize edin, belirlenmiş ötenazi kontrol hayvanlarını ikinci sınıf bir biyogüvenlik kabininde bir diseksiyon tahtası üzerine emici kağıda yerleştirin ve fareleri her fare için% 70 etanol ile dezenfekte edin. İlk olarak, karnın ortasında küçük bir kesi yapın ve ardından cildi hayvanın başının üzerine geri çekin.

Ardından, karın ve göğüs kafesini açmak için cerrahi makas kullanın. Göğüs duvarını, akciğerlere erişilebilecek şekilde çıkarın ve ardından çıkarın. Akciğerleri iki mililitre homojenizasyon tamponu ile 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve daha sonra dokuyu 100 mikrometre eleklerden küçük bir Petri kabına süzmek için pistonu beş mililitrelik bir şırıngadan kullanın.

Bariyer ucu ile donatılmış bir mililitrelik bir pipet kullanarak, eleği birkaç kez yıkayın ve ardından yaklaşık 250 mikrolitre akciğer homojenatını sekiz agar plakası arasında dağıtın. Plakalar kuruduğunda numuneleri dikkatlice kaplamak için tek kullanımlık yayıcılar kullanın. Her plakayı perfil ile kapatın.

Onları alüminyum folyoya sarın ve en az dört hafta boyunca 37 santigrat derecede dik olarak inkübe edin. Saf veya mikobakteri ile enfekte olmuş fareleri sivrisinek ısırıkları ile sıtma ile enfekte etmek için, anestezi uygulanmış hayvanları sivrisinek kafeslerinin ağına yerleştirin ve bulaşıcı sivrisineklerin başarılı sporozoit iletimini sağlamak için zardan beslenmesine izin verin. Fareleri kafeslerde 10 ila 15 dakika bekletin.

Fareleri kafeslerine bir kağıt havluya geri aktarın ve anesteziden uyanana kadar sıcak tutmak için üzerlerini bir kağıt havluyla örtün. Sivrisinekleri kafesin ağından %70 etanol veya diğer dezenfektanlar püskürterek öldürün ve kafesleri otoklavlayarak sterilize edin. Parayı izlemek için, enfekte olmuş her hayvanın damarının en ucunu delmek için bir iğne kullanın ve bir damla kan toplayın.

Bir cam kaydırağın her iki ucunda, alt kaydırağın uzunluğunun yarısından fazla bir damla kan çekmek için başka bir kaydırak kullanın. Ardından yayma sürgüsünü ters çevirin ve ikinci leke için diğer kenarı kullanın. Slaytları bir boyama rafına yerleştirin.

Kan lekelerini mutlak metanol içinde kısaca sabitleyin ve ardından havayla kurutun. Daha sonra slaytlar, lekeleri Giza'ya daldırın. 10 dakika sonra, fazla lekeyi durulamak için slaytları deiyonize suyla doldurulmuş boyama damarlarının içine ve dışına birkaç kez daldırın.

Son olarak, slaytları dikey konumda havayla kurutun. Deney hayvanlarının sivrisinek ısırıkları ile sporozoitin neden olduğu enfeksiyon, dört ila beş gün sonra kan evresi parazitlerinin varlığı ile doğrulandığı gibi% 100 enfeksiyon oranı ile sonuçlanır. Tabloda gösterildiği gibi, hem naif hem de m tüberkülozu ile enfekte farelerin sivrisinek ısırıkları ile plasmodium buri ile enfeksiyonu, bir deney grubundaki tüm hayvanların tutarlı ve tekrarlanabilir enfeksiyonu ile sonuçlanır.

Pre pre pre ve naif kontrol fareleri ile mycobacterium tuberculosis ko-enfekte hayvanlar karşılaştırıldığında, pre açıklığın biraz geciktiği gözlemlenebilir. Mikobakteri tüberkülozu ile önceden enfekte olmuş farelerde, bir inhalasyon maruz kalma sistemi kullanılarak mikobakteri tüberkülozlu farelerde, bireysel fareler arasında nispeten düşük değişkenlik ile bakterilerin hayvanın akciğerlerine başarılı bir şekilde birikmesine neden olur. Enfekte C 57 siyah altı farenin akciğerlerindeki mikobakteriyel yükler p burga varlığında artar.

Buna karşılık, ko-enfekte fareler, plasmodium tek enfekte farelere kıyasla daha düşük bir paraemiye sahiptir. Bu prosedürü takiben, mal parazitlere ve tüberkül bazisine karşı eş zamanlı olarak ortaya çıkan immün yanıtları ve bunların ko-enfekte konakçıdaki etkileşimlerini incelemek için ilgilenilen doku veya vücut sıvıları üzerinde akış sitometrisi, PCR Eliza veya histolojik teknikler gibi yöntemler uygulanabilir. İnsan patojeni mikrobakteri tüberkülozu ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve her zaman bulaşıcı aerosollere maruz kalmamak için önlemler alınması gerektiğini unutmayın.

Mikrobakteri tüberkülozu ile ilgili tüm deneysel çalışmalar, uygun biyogüvenlik seviyesi üç tesislerinde gerçekleştirilmelidir.