Maya Dönüşümü ve Klonlama
Maya veya Saccharomyces cerevisiae, genetik ve hücre biyolojisi çalışmalarında kullanılan ve insan hücresel süreçleri hakkında bilgi verebilen yaygın basit bir ökaryotik model organizmadır. Bu video, maya hücresi tarafından yabancı DNA'nın alınması olan dönüşümü tartışıyor. Maya plazmitlerini, maya hücrelerinin transformasyon için nasıl hazırlanacağını, adım adım dönüşüm prosedürünü tanıtacak ve bu temel tekniğin bazı uygulamalarını sağlayacaktır.
Mayanın dönüşümü hakkında konuşmadan önce, dönüşümde kullanılan bir DNA türünü tartışalım: plazmit. Bir plazmit, bir hücre zarındaki gözeneklerden kolayca geçebilmesi için süper sarmal olabilen küçük, dairesel, çift sarmallı bir DNA'dır.
Plazmitler, kısıtlama endonükleazlarının, yani "kısıtlama enzimlerinin" DNA'yı kesebildiği bir çoklu klonlama bölgesi veya MCS içerir. Aynı enzimlerle kesilen ilgilenilen DNA parçaları daha sonra MCS'ye bağlanabilir. Plazmitler ayrıca, replikasyonun başlaması gereken hücreye sinyal veren bir replikasyon kaynağı veya ORI içerir. Ek olarak, plazmitler, plazmidi içeren maya hücrelerinin belirli çevresel koşullar altında büyümesine izin veren seçilebilir bir işaretleyiciye sahiptir. Plazmidi başarılı bir şekilde dahil etmeyen maya, seçilebilir işaretleyiciyi içeren ortamlarda hayatta kalamaz. Seçilebilir belirteçler, ilaca direnci sağlayan genleri veya bir maya suşunun başka türlü üretemeyecekleri amino asitleri sentezlemesini sağlayan enzimleri kodlayan genleri kodlayabilir.
Mekik vektörleri, birden fazla konakçı türde çoğalabilen plazmitlerdir. Örneğin, E. Coli'den bir plazmit mayada büyüyebilir. Maya Plazmitleri bütünleşemez veya bütünleşebilir olabilir, bu da plazmitin ya genomik DNA ile birleştiği ya da bağımsız kaldığı anlamına gelir.
Mayada kullanılan beş farklı genel plazmit veya vektör türü vardır. Mayanın transformasyonunda en sık kullanılan ikisi, maya epizomal plazmidi veya YEp ve maya sentrometik plazmidi veya YCp'dir. Bu tür vektörlerin her ikisi de özerk bir çoğaltma dizisi veya ARS içerir. ARS, replikasyonun kökenini içerir ve mayada ekstrakromozomal replikasyona izin verir.
Mayayı dönüştürmek için kullanılabilecek sferoplast yöntemi, elektroporasyon ve lityum asetat aracılı dönüşümü içeren birkaç farklı prosedür vardır. Bu video için lityum asetat prosedürüne odaklanacağız.
Bu dönüşüm yönteminde, pozitif yüklü lityum katyonları, hücre zarı ve plazmit DNA üzerindeki yükleri nötralize eder: Tek sarmallı DNA - dönüşüm karışımına eklenir - mayanın hücre duvarına bağlanır ve plazmit DNA'yı maya hücreleri tarafından alınmaya hazır hale getirir. Ani bir sıcaklık artışına veya ısı şokuna maruz kalmak, hücrenin içi ve dışı arasında bir basınç farkı yaratır ve plazmit DNA'nın geçebileceği gözenekler oluşturur. Sıcaklık düştüğünde, maya hücre duvarı yeniden şekillenir ve dönüşüm tamamlanır.
Mayanın dönüşüm için nasıl hazırlanacağına dair adım adım bir prosedürle başlayalım. Maya hücreleri, önce bir agar plakasından bir koloni seçilerek ve koloniyi maya özütü pepton dekstroz ortamı, kısaltılmış YPD - maya büyümesi için tam bir ortam - amplifiye ederek hazırlanmalıdır.
Koloni bir plakadan alındıktan ve YPD ortamına yerleştirildikten sonra, kültür, burada gördüğünüz gibi bir çalkalayıcı veya silindir aparatı üzerinde çalkalama ile 30 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. Maya hücreleri santrifüjleme ile peletlenir ve süpernant çıkarılır. Peletlenmiş hücreler istenen tampon veya steril su ile yeniden süspanse edilir. Bu yetkin hazırlanmış maya hücreleri dönüşüm prosedüründe kullanılacaktır.
Maya hücreleri hazırlandıktan sonra, önce dönüşüm karışımı hazırlanarak dönüşüm gerçekleştirilebilir.
Bu reaktif karışımı şunları içermelidir: steril damıtılmış su; % 50 polietilen glikol veya PEG çözeltisi, 1M lityum asetat, 10 mg / ml tek sarmallı DNA çözeltisi, plazmit DNA ve yetkin maya hücreleri. Her bir çözeltinin kesin oranları, deneye başlamadan önce laboratuvarınızın maya dönüşümü için standart protokolüne danışılarak hesaplanmalıdır.
Karışım daha sonra 30 ° C'de 30 dakika çalkalanarak inkübe edilir. Maya hücrelerinin parçalanmamasını sağlamak için çözelti karıştırılmalı, girdaplanmamalıdır.
Hücreler, 15 dakika boyunca 42 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirilerek ısı şokuna tabi tutulur ve ardından 2 dakika buz üzerinde soğutulur. Hücreler daha sonra santrifüjleme ile toplanır.
Hücreler çift damıtılmış suda yeniden süspanse edilir ve istenen dönüştürücüler için seçilecek agar plakaları üzerine kaplanır. Dönüşüm plakaları daha sonra koloniler oluşana kadar iki ila dört gün boyunca 30 ° C'de inkübe edilir.
Dönüşüm prosedürleri, optimize edilene kadar her zaman pozitif ve negatif kontrol plakalarını içermelidir. Pozitif kontrol, herhangi bir seçilebilir belirteç içermeyen bir YPD plakası üzerinde plazmit DNA'lı bir maya hücresi süspansiyonu olmalıdır. Bu, dönüşüm prosedürünü takiben hücrelerin sağlıklı olduğunu gösterir. Negatif kontrol plakası, antibiyotik içeren bir plaka gibi uygun bir seçim plakası üzerinde bir maya hücresi süspansiyonu olmalıdır. Plakada koloni olmamalıdır ve kontaminasyon olmadığını gösterir.
Maya dönüşümü için sayısız farklı uygulama vardır. Dönüştürülmüş mayanın bir uygulaması, ilgilendiğiniz protein veya yem proteini ile etkileşime giren proteinleri tanımlamak için bir maya-iki hibrit sistemi kullanmaktır. Aday bağlayıcı ortaklardan veya av proteinlerinden oluşan bir kütüphaneden bir plazmit dönüştürüldüğünde ve bir etkileşim olduğunda, Beta-galaktosidaz gibi bir raportör geni aktive edecek bir transkripsiyon faktörü salınır. Raportör gen, beta-galadosidaz için bir substrat olan X-gal içeren plakalar üzerindeyken etkileşime sahip kolonileri maviye çevirecektir.
Çoklu delesyonlar, cinsel döngü kullanan bir teknikle mayaya dönüştürülebilir. Bir raportör ve silinmiş lokus içeren haploid hücreler, rastgele çeşitlilik veya mayotik rekombinasyon yoluyla tek bir hücrede birleştirilir. Seçilebilir işaretleyiciler, delesyonları başarıyla dahil eden mayayı seçmek için kullanılır. Bu durumda, GFP'yi eksprese eden hücreleri seçmek için akış sitometrisi kullanılır.
Maya, mutasyonların protein-protein etkileşimleri üzerindeki etkisini görmek için floresan olarak etiketlenmiş proteinlerle dönüştürülebilir. Bu video makale, farklı mutasyonların endositoz için gerekli olan protein-protein etkileşimleri üzerindeki etkilerini incelemek için floresan mikroskobu kullandı.
Az önce JoVE'nin maya dönüşümüyle ilgili videosunu izlediniz. Artık bir plazmidin temel yönlerini, maya hücrelerinin transformasyon için nasıl hazırlanacağını ve transformasyon prosedürünün nasıl gerçekleştirileceğini anlamalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
S. cerevisiae, biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bir model organizma olan tek hücreli ökaryotlardır. Maya araştırmacıları, çalışmaları…
Maya veya Saccharomyces cerevisiae, genetik ve hücre biyolojisi çalışmalarında kullanılan ve insan hücresel süreçleri hakkında bilgi verebilen yaygın basit bir ökaryotik model organizmadır. Bu video, maya hücresi tarafından yabancı DNA'nın alınması olan dönüşümü tartışıyor. Maya plazmitlerini, maya hücrelerinin transformasyon için nasıl hazırlanacağını, adım adım dönüşüm prosedürünü tanıtacak ve bu temel tekniğin bazı uygulamalarını sağlayacaktır.
Mayanın dönüşümü hakkında konuşmadan önce, dönüşümde kullanılan bir DNA türünü tartışalım: plazmit. Bir plazmit, bir hücre zarındaki gözeneklerden kolayca geçebilmesi için süper sarmal olabilen küçük, dairesel, çift sarmallı bir DNA'dır.
Plazmitler, kısıtlama endonükleazlarının, yani "kısıtlama enzimlerinin" DNA'yı kesebildiği bir çoklu klonlama bölgesi veya MCS içerir. Aynı enzimlerle kesilen ilgilenilen DNA parçaları daha sonra MCS'ye bağlanabilir. Plazmitler ayrıca, replikasyonun başlaması gereken hücreye sinyal veren bir replikasyon kaynağı veya ORI içerir. Ek olarak, plazmitler, plazmidi içeren maya hücrelerinin belirli çevresel koşullar altında büyümesine izin veren seçilebilir bir işaretleyiciye sahiptir. Plazmidi başarılı bir şekilde dahil etmeyen maya, seçilebilir işaretleyiciyi içeren ortamlarda hayatta kalamaz. Seçilebilir belirteçler, ilaca direnci sağlayan genleri veya bir maya suşunun başka türlü üretemeyecekleri amino asitleri sentezlemesini sağlayan enzimleri kodlayan genleri kodlayabilir.
Mekik vektörleri, birden fazla konakçı türde çoğalabilen plazmitlerdir. Örneğin, E. Coli'den bir plazmit mayada büyüyebilir. Maya Plazmitleri bütünleşemez veya bütünleşebilir olabilir, bu da plazmitin ya genomik DNA ile birleştiği ya da bağımsız kaldığı anlamına gelir.
Mayada kullanılan beş farklı genel plazmit veya vektör türü vardır. Mayanın transformasyonunda en sık kullanılan ikisi, maya epizomal plazmidi veya YEp ve maya sentrometik plazmidi veya YCp'dir. Bu tür vektörlerin her ikisi de özerk bir çoğaltma dizisi veya ARS içerir. ARS, replikasyonun kökenini içerir ve mayada ekstrakromozomal replikasyona izin verir.
Mayayı dönüştürmek için kullanılabilecek sferoplast yöntemi, elektroporasyon ve lityum asetat aracılı dönüşümü içeren birkaç farklı prosedür vardır. Bu video için lityum asetat prosedürüne odaklanacağız.
Bu dönüşüm yönteminde, pozitif yüklü lityum katyonları, hücre zarı ve plazmit DNA üzerindeki yükleri nötralize eder: Tek sarmallı DNA - dönüşüm karışımına eklenir - mayanın hücre duvarına bağlanır ve plazmit DNA'yı maya hücreleri tarafından alınmaya hazır hale getirir. Ani bir sıcaklık artışına veya ısı şokuna maruz kalmak, hücrenin içi ve dışı arasında bir basınç farkı yaratır ve plazmit DNA'nın geçebileceği gözenekler oluşturur. Sıcaklık düştüğünde, maya hücre duvarı yeniden şekillenir ve dönüşüm tamamlanır.
Mayanın dönüşüm için nasıl hazırlanacağına dair adım adım bir prosedürle başlayalım. Maya hücreleri, önce bir agar plakasından bir koloni seçilerek ve koloniyi maya özütü pepton dekstroz ortamı, kısaltılmış YPD - maya büyümesi için tam bir ortam - amplifiye ederek hazırlanmalıdır.
Koloni bir plakadan alındıktan ve YPD ortamına yerleştirildikten sonra, kültür, burada gördüğünüz gibi bir çalkalayıcı veya silindir aparatı üzerinde çalkalama ile 30 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. Maya hücreleri santrifüjleme ile peletlenir ve süpernant çıkarılır. Peletlenmiş hücreler istenen tampon veya steril su ile yeniden süspanse edilir. Bu yetkin hazırlanmış maya hücreleri dönüşüm prosedüründe kullanılacaktır.
Maya hücreleri hazırlandıktan sonra, önce dönüşüm karışımı hazırlanarak dönüşüm gerçekleştirilebilir.
Bu reaktif karışımı şunları içermelidir: steril damıtılmış su; % 50 polietilen glikol veya PEG çözeltisi, 1M lityum asetat, 10 mg / ml tek sarmallı DNA çözeltisi, plazmit DNA ve yetkin maya hücreleri. Her bir çözeltinin kesin oranları, deneye başlamadan önce laboratuvarınızın maya dönüşümü için standart protokolüne danışılarak hesaplanmalıdır.
Karışım daha sonra 30 ° C'de 30 dakika çalkalanarak inkübe edilir. Maya hücrelerinin parçalanmamasını sağlamak için çözelti karıştırılmalı, girdaplanmamalıdır.
Hücreler, 15 dakika boyunca 42 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirilerek ısı şokuna tabi tutulur ve ardından 2 dakika buz üzerinde soğutulur. Hücreler daha sonra santrifüjleme ile toplanır.
Hücreler çift damıtılmış suda yeniden süspanse edilir ve istenen dönüştürücüler için seçilecek agar plakaları üzerine kaplanır. Dönüşüm plakaları daha sonra koloniler oluşana kadar iki ila dört gün boyunca 30 ° C'de inkübe edilir.
Dönüşüm prosedürleri, optimize edilene kadar her zaman pozitif ve negatif kontrol plakalarını içermelidir. Pozitif kontrol, herhangi bir seçilebilir belirteç içermeyen bir YPD plakası üzerinde plazmit DNA'lı bir maya hücresi süspansiyonu olmalıdır. Bu, dönüşüm prosedürünü takiben hücrelerin sağlıklı olduğunu gösterir. Negatif kontrol plakası, antibiyotik içeren bir plaka gibi uygun bir seçim plakası üzerinde bir maya hücresi süspansiyonu olmalıdır. Plakada koloni olmamalıdır ve kontaminasyon olmadığını gösterir.
Maya dönüşümü için sayısız farklı uygulama vardır. Dönüştürülmüş mayanın bir uygulaması, ilgilendiğiniz protein veya yem proteini ile etkileşime giren proteinleri tanımlamak için bir maya-iki hibrit sistemi kullanmaktır. Aday bağlayıcı ortaklardan veya av proteinlerinden oluşan bir kütüphaneden bir plazmit dönüştürüldüğünde ve bir etkileşim olduğunda, Beta-galaktosidaz gibi bir raportör geni aktive edecek bir transkripsiyon faktörü salınır. Raportör gen, beta-galadosidaz için bir substrat olan X-gal içeren plakalar üzerindeyken etkileşime sahip kolonileri maviye çevirecektir.
Çoklu delesyonlar, cinsel döngü kullanan bir teknikle mayaya dönüştürülebilir. Bir raportör ve silinmiş lokus içeren haploid hücreler, rastgele çeşitlilik veya mayotik rekombinasyon yoluyla tek bir hücrede birleştirilir. Seçilebilir işaretleyiciler, delesyonları başarıyla dahil eden mayayı seçmek için kullanılır. Bu durumda, GFP'yi eksprese eden hücreleri seçmek için akış sitometrisi kullanılır.
Maya, mutasyonların protein-protein etkileşimleri üzerindeki etkisini görmek için floresan olarak etiketlenmiş proteinlerle dönüştürülebilir. Bu video makale, farklı mutasyonların endositoz için gerekli olan protein-protein etkileşimleri üzerindeki etkilerini incelemek için floresan mikroskobu kullandı.
Az önce JoVE'nin maya dönüşümüyle ilgili videosunu izlediniz. Artık bir plazmidin temel yönlerini, maya hücrelerinin transformasyon için nasıl hazırlanacağını ve transformasyon prosedürünün nasıl gerçekleştirileceğini anlamalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Maya veya Saccharomyces cerevisiae, genetik ve hücre biyolojisi çalışmalarında kullanılan ve insan hücresel süreçleri hakkında bilgi verebilen yaygın basit bir ökaryotik model organizmadır. Bu video, maya hücresi tarafından yabancı DNA'nın alınması olan dönüşümü tartışıyor. Maya plazmitlerini, maya hücrelerinin transformasyon için nasıl hazırlanacağını, adım adım dönüşüm prosedürünü tanıtacak ve bu temel tekniğin bazı uygulamalarını sağlayacaktır.
Mayanın dönüşümü hakkında konuşmadan önce, dönüşümde kullanılan bir DNA türünü tartışalım: plazmit. Bir plazmit, bir hücre zarındaki gözeneklerden kolayca geçebilmesi için süper sarmal olabilen küçük, dairesel, çift sarmallı bir DNA'dır.
Plazmitler, kısıtlama endonükleazlarının, yani "kısıtlama enzimlerinin" DNA'yı kesebildiği bir çoklu klonlama bölgesi veya MCS içerir. Aynı enzimlerle kesilen ilgilenilen DNA parçaları daha sonra MCS'ye bağlanabilir. Plazmitler ayrıca, replikasyonun başlaması gereken hücreye sinyal veren bir replikasyon kaynağı veya ORI içerir. Ek olarak, plazmitler, plazmidi içeren maya hücrelerinin belirli çevresel koşullar altında büyümesine izin veren seçilebilir bir işaretleyiciye sahiptir. Plazmidi başarılı bir şekilde dahil etmeyen maya, seçilebilir işaretleyiciyi içeren ortamlarda hayatta kalamaz. Seçilebilir belirteçler, ilaca direnci sağlayan genleri veya bir maya suşunun başka türlü üretemeyecekleri amino asitleri sentezlemesini sağlayan enzimleri kodlayan genleri kodlayabilir.
Mekik vektörleri, birden fazla konakçı türde çoğalabilen plazmitlerdir. Örneğin, E. Coli'den bir plazmit mayada büyüyebilir. Maya Plazmitleri bütünleşemez veya bütünleşebilir olabilir, bu da plazmitin ya genomik DNA ile birleştiği ya da bağımsız kaldığı anlamına gelir.
Mayada kullanılan beş farklı genel plazmit veya vektör türü vardır. Mayanın transformasyonunda en sık kullanılan ikisi, maya epizomal plazmidi veya YEp ve maya sentrometik plazmidi veya YCp'dir. Bu tür vektörlerin her ikisi de özerk bir çoğaltma dizisi veya ARS içerir. ARS, replikasyonun kökenini içerir ve mayada ekstrakromozomal replikasyona izin verir.
Mayayı dönüştürmek için kullanılabilecek sferoplast yöntemi, elektroporasyon ve lityum asetat aracılı dönüşümü içeren birkaç farklı prosedür vardır. Bu video için lityum asetat prosedürüne odaklanacağız.
Bu dönüşüm yönteminde, pozitif yüklü lityum katyonları, hücre zarı ve plazmit DNA üzerindeki yükleri nötralize eder: Tek sarmallı DNA - dönüşüm karışımına eklenir - mayanın hücre duvarına bağlanır ve plazmit DNA'yı maya hücreleri tarafından alınmaya hazır hale getirir. Ani bir sıcaklık artışına veya ısı şokuna maruz kalmak, hücrenin içi ve dışı arasında bir basınç farkı yaratır ve plazmit DNA'nın geçebileceği gözenekler oluşturur. Sıcaklık düştüğünde, maya hücre duvarı yeniden şekillenir ve dönüşüm tamamlanır.
Mayanın dönüşüm için nasıl hazırlanacağına dair adım adım bir prosedürle başlayalım. Maya hücreleri, önce bir agar plakasından bir koloni seçilerek ve koloniyi maya özütü pepton dekstroz ortamı, kısaltılmış YPD - maya büyümesi için tam bir ortam - amplifiye ederek hazırlanmalıdır.
Koloni bir plakadan alındıktan ve YPD ortamına yerleştirildikten sonra, kültür, burada gördüğünüz gibi bir çalkalayıcı veya silindir aparatı üzerinde çalkalama ile 30 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. Maya hücreleri santrifüjleme ile peletlenir ve süpernant çıkarılır. Peletlenmiş hücreler istenen tampon veya steril su ile yeniden süspanse edilir. Bu yetkin hazırlanmış maya hücreleri dönüşüm prosedüründe kullanılacaktır.
Maya hücreleri hazırlandıktan sonra, önce dönüşüm karışımı hazırlanarak dönüşüm gerçekleştirilebilir.
Bu reaktif karışımı şunları içermelidir: steril damıtılmış su; % 50 polietilen glikol veya PEG çözeltisi, 1M lityum asetat, 10 mg / ml tek sarmallı DNA çözeltisi, plazmit DNA ve yetkin maya hücreleri. Her bir çözeltinin kesin oranları, deneye başlamadan önce laboratuvarınızın maya dönüşümü için standart protokolüne danışılarak hesaplanmalıdır.
Karışım daha sonra 30 ° C'de 30 dakika çalkalanarak inkübe edilir. Maya hücrelerinin parçalanmamasını sağlamak için çözelti karıştırılmalı, girdaplanmamalıdır.
Hücreler, 15 dakika boyunca 42 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirilerek ısı şokuna tabi tutulur ve ardından 2 dakika buz üzerinde soğutulur. Hücreler daha sonra santrifüjleme ile toplanır.
Hücreler çift damıtılmış suda yeniden süspanse edilir ve istenen dönüştürücüler için seçilecek agar plakaları üzerine kaplanır. Dönüşüm plakaları daha sonra koloniler oluşana kadar iki ila dört gün boyunca 30 ° C'de inkübe edilir.
Dönüşüm prosedürleri, optimize edilene kadar her zaman pozitif ve negatif kontrol plakalarını içermelidir. Pozitif kontrol, herhangi bir seçilebilir belirteç içermeyen bir YPD plakası üzerinde plazmit DNA'lı bir maya hücresi süspansiyonu olmalıdır. Bu, dönüşüm prosedürünü takiben hücrelerin sağlıklı olduğunu gösterir. Negatif kontrol plakası, antibiyotik içeren bir plaka gibi uygun bir seçim plakası üzerinde bir maya hücresi süspansiyonu olmalıdır. Plakada koloni olmamalıdır ve kontaminasyon olmadığını gösterir.
Maya dönüşümü için sayısız farklı uygulama vardır. Dönüştürülmüş mayanın bir uygulaması, ilgilendiğiniz protein veya yem proteini ile etkileşime giren proteinleri tanımlamak için bir maya-iki hibrit sistemi kullanmaktır. Aday bağlayıcı ortaklardan veya av proteinlerinden oluşan bir kütüphaneden bir plazmit dönüştürüldüğünde ve bir etkileşim olduğunda, Beta-galaktosidaz gibi bir raportör geni aktive edecek bir transkripsiyon faktörü salınır. Raportör gen, beta-galadosidaz için bir substrat olan X-gal içeren plakalar üzerindeyken etkileşime sahip kolonileri maviye çevirecektir.
Çoklu delesyonlar, cinsel döngü kullanan bir teknikle mayaya dönüştürülebilir. Bir raportör ve silinmiş lokus içeren haploid hücreler, rastgele çeşitlilik veya mayotik rekombinasyon yoluyla tek bir hücrede birleştirilir. Seçilebilir işaretleyiciler, delesyonları başarıyla dahil eden mayayı seçmek için kullanılır. Bu durumda, GFP'yi eksprese eden hücreleri seçmek için akış sitometrisi kullanılır.
Maya, mutasyonların protein-protein etkileşimleri üzerindeki etkisini görmek için floresan olarak etiketlenmiş proteinlerle dönüştürülebilir. Bu video makale, farklı mutasyonların endositoz için gerekli olan protein-protein etkileşimleri üzerindeki etkilerini incelemek için floresan mikroskobu kullandı.
Az önce JoVE'nin maya dönüşümüyle ilgili videosunu izlediniz. Artık bir plazmidin temel yönlerini, maya hücrelerinin transformasyon için nasıl hazırlanacağını ve transformasyon prosedürünün nasıl gerçekleştirileceğini anlamalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a plasmid and what are its key components?
A plasmid is a small, circular, double-stranded DNA molecule that can supercoil to pass through cell membrane pores. Key components include a multiple cloning site (MCS) where restriction enzymes cut DNA, an origin of replication (ORI) that signals where replication begins, and a selectable marker allowing transformed cells to survive under specific environmental conditions.
Q2: How do yeast cells prepare for transformation?
Yeast cells are prepared by picking a colony from an agar plate and amplifying it in YPD medium overnight at 30°C with agitation. Cells are then pelleted by centrifugation, the supernatant is removed, and pelleted cells are resuspended in buffer or sterile water to create competent cells ready for the transformation procedure. Growth and maintenance of saccharomyces cerevisiae requires careful culture conditions.
Q3: What happens during the lithium acetate transformation method?
Positively-charged lithium cations neutralize charges on the cell membrane and plasmid DNA. Single-stranded DNA binds to the cell wall, leaving plasmid DNA available for uptake. Heat shock at 42°C creates pores allowing DNA entry. When temperature decreases, the cell wall reforms, completing transformation.
Q4: What is the difference between YEp and YCp plasmid vectors?
YEp (yeast episomal plasmid) and YCp (yeast centromeric plasmid) are the most commonly used vectors in yeast transformation. Both contain an autonomous replication sequence (ARS) that enables extrachromosomal replication in yeast. YEp plasmids are non-integrating and replicate as independent elements, while YCp plasmids associate with yeast centromeres.
Q5: Why are positive and negative controls important in yeast transformation?
Positive controls use plasmid DNA on YPD plates without selectable markers to confirm cells remain healthy after transformation. Negative controls use selection plates with no plasmid to verify absence of contamination. These controls validate that the transformation procedure works correctly and results are reliable.
Q6: How does the yeast-two hybrid system identify protein interactions?
Transformed yeast containing prey protein plasmids from a library are screened for interactions with a bait protein. When interaction occurs, a transcription factor activates a reporter gene like beta-galactosidase. Colonies with interactions turn blue on plates containing X-gal substrate, allowing researchers to identify binding partners.
Q7: What are practical applications of yeast transformation in research?
Yeast transformation enables control of gene expression, induction of genetic deletions, expression of recombinant proteins, and labeling of subcellular structures. Researchers use fluorescently-labeled proteins to study mutation effects on protein-protein interactions. Flow cytometry selects cells expressing GFP, and fluorescent microscopy visualizes cellular processes essential for understanding human biology.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
0:41
Important Aspects of Yeast Transformation
2:42
Principles Behind Yeast Transformation
3:38
Lithium Acetate Transformation Procedure
6:31
Applications
8:04
Summary