Name: CDNAdan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-11T23:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Öğrenin, klonlanmış DNA'dan rekombinant Newcastle hastalığı virüsünü kurtarma yöntemini. Memeli hücre enfeksiyonu, plazmid transfeksiyonu ve embriyonlu yumurta kullanımıyla viroloji ve aşı geliştirme araştırmalarında uygulanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr laboratuvarlarında geçmiş ve bugünkü üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Peter Palese ve NDVnin gelişimi için Adolfo García-Sastre genetik teknikleri ve teknik yardım için ters. NiaD R01AI088770 hibe ve Mükemmeliyet İç Güvenlik Bilim ve Teknoloji Merkezi Bölümü tarafından tarafından AG-S laboratuvarda Newcastle hastalığı virüsü Araştırma kısmen finanse Gelişen ve Zoonotik Hayvan Hastalıkları (CEEZAD, ödül sayısı 2010-ST-061-AG001). LM-S Araştırma laboratuvarında NIH hibe RO1&#39;e AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, Grip Araştırma ve Gözetleme (HHSN266200700008C) Mükemmeliyet NIAID Merkezleri ve biyosavunma Bağışıklık Modelleme için Rochester Merkezi Üniversitesi (HHSN272201000055C) tarafından finanse edilmektedir .

1.. Memeli Hücreleri hazırlanması (Şekil 4A, Gün 1) Bölünmüş HEp-2 ya da A549 hücreleri, 6 oyuklu plakalar içerisinde transfeksiyondan bir gün önce. Hücrelerin yoğunluğu ertesi gün% 80-90 ulaşması gerekmektedir. Genellikle, 100 mm tabak birleşik 8 kuyulara (kuyu başına 6 ila 10 x yaklaşık 1 hücreleri) ayrılabilir. Her virüs kurtarılmaya için, 2-4 farklı kuyular dahil edilmelidir, yanı sıra sırasıyla transfeksiyon ve MVA-T7 enfeksiyon verimliliği takip amaçlanmıştır kontrol pCAGGs-GFP ve GFP pCITE-18 için 2 ilave kuyular,,. 2. Bakteriyofaj T7 RNA polimerazı (MVA-T7) ifade Rekombinant Vaccinia Modifiye Ankara Virüsü ile enfeksiyon Memeli Hücrelerinin (Şekil 4A, Gün 2) <ol><li> 37 ° C&#39;de PBS 1x/BA/PS ve medya ısınmak </li><li> PBS 1x/BA/PS 1 ml ile iki kez, hücreler yıkayın. </li><li> Bir enfeksiyon çokluğu (en MVA-T7 virüs ile kültürlenen memeli hücreleri, Infect moi: 1) oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS / BA / PS 200 ul&#39;lik bir nihai hacim içinde pfu / hücre. </li><li> 3 de tarif edildiği gibi viral enfeksiyon inkübasyon sırasında transfeksiyon karışımı hazırlayın. </li></ol> 3. Memeli Hücreleri transfeksiyonu (Şekil 4A, Gün 2) <ol><li> Lipofectamine hazırlanması: kurtarma girişimi OptiMEM başına 250 ul LPF2000 1-2 ug karıştırınız ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> DNA hazırlanması: OptiMEM 50 ul her bir kurtarma için bir plazmid kokteyl yapın. 0,4 PTM1-NP ug PTM1-P, 0.2 ug, ve tüp başına PTM1-L 0.2 ug ekleyin. Her tüpe kurtarılmaya NDV&#39;nin tam boy cDNA klonu 1 ug ekleyin. Ayrıca iki kontrol transfections, pCAGGs-GFP 2 mikrogram ile birini (transfeksiyon etkinliğini kontrol etmek için) ve (T7 polimeraz MVA-T7 ile ifade tahrik kontrol etmek) pCITE-GFP 2 mikrogram ile diğer hazırlar. </li><li> LPF2000-OptiMEM solüsyonu, 5 dakika boyunca (adım 3.1) boyunca önceden kuluçkalanır sonra, ekleme 250DNA tüplere çözeltinin ul (3.2 adım) ve oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe edilir. </li><li> MVA-T7 ile inkübasyondan sonra, aspirasyon ile virüs aşının çıkması ve DNA-LPF2000 transfeksiyon karışımı (adım 3.3) ile değiştirin. </li><li> Her yemeğin DMEM% 10 FBS / PS 1 ml ekleyin. </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 6-8 saat (ya da gece boyunca) için enfekte / transfekte edilmiş hücrelerin inkübe edin ve daha sonra taze DMEM,% 10 FBS / PS 1.5 ml transfeksiyon ortamı değiştirin. </li><li> 24 saat post-transfeksiyon olarak, kontrol kuyuları transfeksiyon verimi (pCAGGs-GFP) ve T7 polimeraz aktivitesi (pCITE-GFP) (Şekil 5A) değerlendirmek için bir floresan mikroskobu altında gözlemlenebilir. Aşağıda tarif edildiği gibi kuş fibroblastlar ile enfekte / transfekte edilmiş hücrelerin ko-kültürü ile devam edin. </li></ol> 4. Avian Hücreler, memeli hücrelerinin ko-kültür (Şekil 4A, Gün 3) Genellikle, tavuk konfluent 100 mm doku kültürü çanağı (CEFS) or ördek (Defs) embriyoblastlarında iki transfekte kuyularının başına kullanılır. , Önceden, bütün kurtarma girişimleri başına kuş hücreleri yeterince 100 mm doku kültürü yemekleri hazırlamak için emin olun. Virüsün etkin kurtarılması için, DMEM,% 10 FBS / PS ortam alantoik akışkan, 30 mM MgCl2 ve% 5 ile takviye edilir. Bu noktada, 24 saat pi, memeli hücreleri nedeniyle MVA-T7 enfeksiyon, Şekil 5A&#39;da asevident için sitopatik etki (CPE) arası başlayabilir. <ol><li> 37 ° C&#39;ye kadar PBS 1x ve medya ısınmak </li><li> 1x PBS içinde 1 ml, 2x, memeli hücrelerini yıkayın. </li><li> Bu müstakil kadar EDTA-tripsin 0.2 ml memeli hücrelerini tripsinize edin. DMEM,% 10 FBS / PS 1 ml hücrelerin tekrar,% 5&#39;lik alantoik akışkan, 30 mM MgCI2 ve bir 100 mm doku kültürü çanağı transfer. Aynı medya 3 ml ekleyin. </li><li> 1x PBS içinde 4 ml ile iki kez, kuş hücreleri yıkayın. </li><li> Hücreleri ayırmak kadar 1 EDTA-tripsin ml ile tripsinize kuş hücreleri, 37 ° C&#39;de 1-2 dakika boyunca inkübe edin. Süspanse inci8 DMEM,% 10 FBS / PS,% 5&#39;lik alantoik akışkan, 30 mM MgCl2 ve 8 ml toplam hacim için ko-kültürlenmiştir 100 mm doku kültürü çanağı içinde memeli hücreleri tripsinize edilmiş hücre 4 ml eklemek e hücrelerin ml (4 ml memeli, kuş hücreleri 4 mi). </li><li> Yavaşça muntazam bir dağılımının ve daha sonra, 3-4 gün boyunca 37 ° C&#39;de inkübatör içinde yerleştirmek için, el ile 100 mm tabak içinde ko-kültür hücreleri sallayın. 3 ya da 4 gün memeli ve avian hücrelerinin ortak kültürden sonra yumurta enfekte edilmesi için kriterler (hücre yuvarlama, ölüm, yüzeyden ayrılması, vb.) MVA-T7 viral enfeksiyon gözlenmiştir ne kadar sitopatik etki bağlıdır. </li></ol> 5. Tavuk Embriyone Yumurta Enfeksiyon (Şekil 4A, Gün 6-7) <ol><li> Memeli ve avian hücrelerinin ko-kültür 3-4 gün sonra, yüzen doku kültürünün 1 ml çıkarın ve bir Eppendorf tüpüne ekleyin. </li><li> Bir tezgah içinde 12,000 rpm&#39;de 1 dakika için doku kültürü süpernatantı santrifüjhücresel enkaz kaldırmak için üst santrifüj. </li><li> Hava kesesi ve Allantoik boşluğu arasındaki arayüzünü görmek için bir ışık ışıklı denetim kutusunu kullanarak yumurta Mum. Arayüz sınır kan damarı yerelleştirme kaçınarak bir işareti yapmak. Steril koşulları kurmak için fazla yumurta% 70 etanol sprey. Yavaşça işaretli noktada kabuğu bir delik yapmak ve allantoik oyuğuna dikey ve doğrudan iğne amaçlayan, bir insülin (1 mi) şırınga kullanılarak süpernatan 500 ul inokülasyon. (Şekil 4B). </li><li> Erimiş mum veya parafin ile yumurta kabuğu içinde nick Seal. </li><li> 37 ° C sıcaklıkta 2-3 gün boyunca inkübe yumurta </li></ol> 6. Enfekte Tavuk Embriyone Yumurta dan Alantoyik Fluid (Şekil 4A, Gün 8-10) Hasat <ol><li> Tavuk embriyo öldürmek ve kan pıhtılaşmasını için 4 ° C&#39;de 2-4 saat veya gece boyunca enfekte edilmiş yumurta inkübe edin. </li><li> % 70 etanol (steril koşulların muhafaza edilmesi için) ile yumurta püskürtün. </li><li> Dikkatli bir kaşıkla hava boşluğunun üzerindeki yumurtanın apikal bölümüne dokunun. Yumurta kabuğu çatlamış sonra, forseps ile parçaları kaldırmak ve tam Allantoik zarı maruz. </li><li> Kan damarlarının zarar görmesini ve yumurta sarısı kaçınarak, forseps ve makas ile Allantoik membran kesilmesiyle Allantoik boşluğuna maruz. </li><li> Dikkatlice bir spatula ile embriyo aşağı doğru itin ve 10 ml pipet ile upflowing Allantoik sıvı (yumurta başına 8-12 ml) toplamak. Sarısı zarına zarar kaçının. Buz üzerinde bir 15 ml santrifüj tüpüne (yumurta için bir tüp kullanmak) için alantoik akışkan aktarın. </li><li> 1500 rpm&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj ile, allantoik akışkanın açıklığa kavuşturulacaktır. Pelet bozmadan, yeni bir tüpe transfer süpernatant. </li><li> En fazla 1 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın örnekleri, hemaglütinasyon testi ile NDV nin varlığı için onları kontrol kadar. </li></ol> 7. Hemaglüsinasyon (HA) Deneyi Allant virüsün varlığıenfekte yumurtadan oik sıvı hindi, kırmızı kan hücrelerini (RBC) hemagglutinate kabiliyetleri ile makroskopik olarak belirlenebilir. NDV nin durumunda, ml başına yaklaşık olarak 10 birim oluşturan 6 plaka (pfu) HA deneyinde pozitif bir sinyal vermek için gereklidir. HA deneyler, V-dipli, 96 oyuklu plakalar içerisinde gerçekleştirilir. Negatif (PBS 1x, bulaşmamış allantoik sıvı) gibi pozitif (herhangi NDV virüs allantoik sıvı) kontrol örnekleri her zaman doğrulamak için herhangi bir HA deneyde dahil edilmelidir. Bir HA deneyi gerçekleştirmek için: <ol><li> Pipet, bir V-tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına PBS 1x 50 ul. </li><li> Pipet plakanın birinci sütun üzerindeki kuyu içine alantoik sıvı örneklerinin 50 ul. Plakanın geri kalanı ile 2 kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek ve son sütunda kuyulardan son, ilave 50 ul atın. </li><li> Kuyu başına PBS 1x 0.5% türkiye RBC 50 ul dağıtın. Hafifçe dokunarak plaka sallayın. </li><li> 4 ° C (ya da buz) f de inkübeya da 30-45 dakika ya da açık bir topak kadar negatif kontrol kuyuları oluşturulur. </li></ol>

<ol><li>Lamb, R. A., Parks, G. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLamb%2C+RA+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Howley, P. H., Knipe, D. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).</li>
<li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).</li>
<li>Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+Newcastle+disease+virus+from+cloned+cDNA%3A+evidence+that+cleavability+of+the+fusion+protein+is+a+major+determinant+for+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence.</a> J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).</li>
<li>Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+lentogenic+Newcastle+disease+virus+from+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA.</a> J. Gen. Virol. 80 (Pt 11), 2987-2995 (1999).</li>
<li>Nakaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector.</a> J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).</li>
<li>Zamarin, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+cancer+therapy%3A+old+challenges+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions.</a> Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).</li>
<li>Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+V+protein+is+a+determinant+of+host+range+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction.</a> J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).</li>
<li>Park, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29-based+assay+demonstrates+interferon-antagonist+activity+for+the+NDV+V+protein+and+the+Nipah+virus+V%2C+W%2C+and+C+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins.</a> J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).</li>
<li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+oncolytic+properties+of+recombinant+newcastle+disease+virus+through+antagonism+of+cellular+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses.</a> Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).</li>
<li>Vigil, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reverse+genetics+to+enhance+the+oncolytic+properties+of+Newcastle+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus.</a> Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).</li>
<li>Swayne, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+paramyxovirus+type+1-avian+influenza-H7+virus+as+a+vaccine+for+protection+of+chickens+against+influenza+and+Newcastle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease.</a> Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).</li>
<li>Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+viral+vaccine+constructs+with+dual+specificity%3A+avian+influenza+and+Newcastle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).</li>
<li>Carnero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+human+immunodeficiency+virus+gag+expression+by+newcastle+disease+virus+vectors+for+the+induction+of+potent+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses.</a> J. Virol. 83, 584-597 (2009).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+type+I+interferon+secretion+through+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+measles+virus+hemagglutinin+stimulates+antibody+secretion+in+the+presence+of+maternal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies.</a> J. Virol. 85, 200-207 (2011).</li>
<li>DiNapoli, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus%2C+a+host+range-restricted+virus%2C+as+a+vaccine+vector+for+intranasal+immunization+against+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).</li>
<li>Martinez-Sobrido, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+respiratory+syncytial+virus+by+a+recombinant+Newcastle+disease+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector.</a> J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).</li>
<li>Bukreyev, A., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).</li>
<li>Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+type+I+interferon+response+by+the+nucleoprotein+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus.</a> J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).</li>
<li>Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thogoto+virus+ML+protein+suppresses+IRF3+function%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function.</a> Virology. 331, 63-72 (2005).</li>
<li>Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+anti-interferon+actions+of+the+influenza+A+virus+NS1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein.</a> J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).</li>
<li>Munoz-Jordan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+alpha%2Fbeta+interferon+signaling+by+the+NS4B+protein+of+flaviviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses.</a> J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).</li>
<li>Cardenas, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+virus+VP35+protein+binds+double-stranded+RNA+and+inhibits+alpha%2Fbeta+interferon+production+induced+by+RIG-I+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling.</a> J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).</li>
<li>Mibayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+retinoic+acid-inducible+gene+I-mediated+induction+of+beta+interferon+by+the+NS1+protein+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus.</a> J. Virol. 81, 514-524 (2007).</li>
<li>Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+open+reading+frame+%28ORF%29+3b%2C+ORF+6%2C+and+nucleocapsid+proteins+function+as+interferon+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists.</a> J. Virol. 81, 548-557 (2007).</li>
<li>Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+coronavirus+delays+expression+of+a+subset+of+interferon-stimulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes.</a> J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).</li>
<li>Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+alpha%2Fbeta+interferon+response+by+mouse+hepatitis+virus+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels.</a> J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).</li>
<li>Andersson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crimean-Congo+hemorrhagic+fever+virus+delays+activation+of+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response.</a> J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).</li>
<li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li>
<li>Kato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Sendai+virus+multiplication+from+transfected+cDNA+or+RNA+with+negative+or+positive+sense%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense.</a> Genes Cells. 1, 569-579 (1996).</li>
<li>Durbin, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+infectious+human+parainfluenza+virus+type+3+from+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA.</a> Virology. 235, 323-332 (1997).</li>
<li>Zhao, H., Peeters, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector%3A+effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).</li>
<li>Calain, P., Roux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rule+of+six%2C+a+basic+feature+for+efficient+replication+of+Sendai+virus+defective+interfering+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA.</a> J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).</li>
<li>Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-deficient+vaccinia+virus+encoding+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+for+transient+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells.</a> Virology. 210, 202-205 (1995).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+review.+New+mammalian+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Product review. New mammalian expression vectors.</a> Nature. 348, 91-92 (1990).</li>
<li>Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+of+mononegavirales%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics of mononegavirales.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).</li>
</ol>

Adolfo García-Sastre Mount Sinai Tıp Okulu Icahn aittir rekombinant Newcastle hastalığı virüsleri üzerinde patent bir mucit.

Çeşitli faktörler NDV tahlisiye sırasında iyi sonuçlar elde etmek için kabul edilmelidir. İlk olarak, kullanılacak olan tam uzunluktaki bir cDNA konstruktu NDV genomuna yeni transgenler / modifikasyonlarının işlevsel dahil edilmesini sağlamak için tasarlanmış olması gerekmektedir. (Ii) herhangi bir varsayımsal GE GS sekansları, dış içine vardır, yukarıda belirtildiği gibi, bu (i) Uygun bir gen ucu (GE), intergenik (IG) ve gen start (GS) dizileri gerekirse ilave edilmesi olduğu, anlamına gelir, geni, ve (iii) tam rekombi...

Newcastle hastalığı virüsü (NDV), Avulavirus cinsine 1 ait bir kuş paramyxovirus, ciddi, tüm dünyada kanatlı hayvancılığın etkileyebilir ekonomik kuruluşları ve dolayısıyla yaygın olarak araştırılmış ve surveilled zoonotik ajandır. Bir insan patojeni rağmen, NDV de iyice bir model olarak paramixovirüsün nedeniyle son derece ilgi çekici doğal onkolitik özellikleri 6&#39;ya hem de veteriner alanının ötesine incelenmiştir. NDV&#39;nin Araştırma ölçüde ilk Conzelmann ve coleagues 2 ile kuduz virüsü için açıklanan tek iplikli, non-segmentli negatif anlamda RNA virüsler için ters genetik tekniklerin geliştirilmesi yararlanmıştır. Yabancı genlerin ya da vahşi tip genomun modifikasyonlarını taşıyan genetik olarak değiştirilmiş NDVs, bir dizi geniş beri incelenmiştir. Bu rekombinant virüsler ile çalışma NDV nin değil, aynı zamanda diğer ilgili huma sadece farklı hastalık oluşturma faktörlerini tanımlamak için önemli olmuşturn, influenza A virüsünün 7 gibi patojenler - veya acil Nipah virüsü 8. Ayrıca, farklı bir dizi çalışma çoğunlukla virüs immün sistemi uyarıcı özelliklerini geliştirerek, NDV 6,9,10 doğuştan gelen anti-tümör aktivitesini geliştirmek için bu tekniklerin kullanımı denenmiştir. Rekombinant NDVs araştırma diğer ilgili alanı, grip 5,11,12 gibi diğer viral hastalıklara karşı aşı adaylarının üretimi olmuştur HIV 13, SARS 15, 14, kızamık, ya da solunum sincytial virüsü (RSV) 16 kaynaklanır. NDV tarafından sağlanan çeşitli önemli avantajlar, insan popülasyonlarında önceden varolan bağışıklık eksikliği olan arasında, yabancı genetik uçlar, recombinatory bir etkinlik eksikliği ve genel olarak yukarıda sözü edilen doğal immün sistemi uyarıcı özellikleri 17, ve yüksek bir güvenlik profili kararlılığı. Ayrıca, p rekombinant bivalent aşıların potansiyel kullanımı çekicidiroultry, NDV karşı hem koruyucu ve çok patojen Avian influenza virüsleri 11,12. Bu nedenle de insanlar için korkunç bir kuş gribi olası arası özel atlama önlemek için yardım, evcil hayvanlara vahşi yayılan ikincisinin şansını azaltmak için mükemmel bir yol olabilir. Son olarak, raportör salgılayan NDV doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin değerlendirilmesi yanı sıra birden fazla virüs 18-27 tarafından kodlanan interferon antagonistinin tanımlanması için kullanılmıştır. Bir rekombinant kurtarma işlemi, segmentli olmayan, negatif-şeritli RNA virüsüdür temel olarak yapay ribonükleoprotein ve RNP olarak bilinen en az iltihaplı bir moleküler makinaları, (Şekil 2) kodlayan cDNA ile transfekte üreten bir hücre içinde viral replikasyon döngüsü zorlama üzerinde oluşur. RNP viral polimeraz (P ve L proteinleri) oluşur, nükleoprotein (NP) ve virüsün tam uzunluklu antigenomik RNA. Bu RNA + antigenome thAyrıca, viral RNP proteinlerinin geri kalanı ile ilişkili tamamlayıcı RNA-genomların, üretimi için gerekli e şablon, doğal bir virüs enfeksiyonu üzerine hücrenin sitoplazması (Şekil 2A ile ilgili serbest olacağı aynı bulaşıcı kompleksi tartışıldı .) Itibaren bu adımından, viral çevrim doğal olarak devam edebilir ve modifiye genomları encapsidating rekombinant virionları, (Şekil 2B) oluşturulur. Dikkate değer, yerine antigenomik cDNA&#39;nın genomik cDNA transfeksiyon büyük ölçüde engelleyen ya da tamamen ortadan kaldırmaktadır kurtarma verim 2,28-30. Antigenomik cDNA transfekte edilmiş olsa bile, transfekte edilmiş hücreler içinde RNP içine rekombinant RNA encapsidation verimliliği muhtemelen çok düşüktür. Bu nedenle, NDV için kurtarma protokoller genellikle permisif hücreler ve / veya bunları coculturing tarafından orijinal olarak transfekte edilmiş hücrelerden salınan birkaç viral parçacıkların yükseltilmesi için farklı adımlar şunlardırembriyolu yumurtaların enfeksiyonu. Önceki kurtarmak için, cDNA istenilen değişiklikleri oluşturmak için standart klonlama prosedürleri ile manipüle edilebilir. Farklı gen ürünleri ve virüs düzenleyici sekansların spesifik mutasyonlar doğrudan doğruya bu şekilde elde edilebilir olsa da, yeniden birleştirici NDV ile ilgili yayınlanmış iş birçok NDV genomuna yeni bir transkripsiyonel birim eklenmesini gerektirmiştir. Paramiksovirüs ailesinin diğer üyeleri gibi, NDV genomu farklı olarak, viral yaşam çevriminde kritik 1 azalan bir gradyanı içinde 3 &#39;ucuna konumları bakımından bağlı olarak ifade edilmiştir altı transkripsiyon birimleri halinde sekiz farklı proteinleri kodlar. Bu nedenle, genomu içinde yeni transkripsiyon ünitesinin yeri dikkatlice viral replikasyon ve transgen sentezlenmesi yetmezliği arasında bir denge elde etmek için seçilmelidir. P ve M genleri arasında Ekleme en, t kullanılmıştırhough diğer siteler de 13,31 test edilmiştir. (I) NDV genomuna dahil edilmesi için yeni bir gen, viral RNA-bağımlı RNA için uygun sinyallerinin kontrolü altında olduğu var ne olursa olsun, insert, NDV cDNA içine klonlama rescuable bir yapı oluşturmak için bazı kurallar takip etmek gerekiyor polimeraz. Bu sekanslar, yeni açık okuma çerçevesinin (ORF) üst akışında eklenmelidir, böylece polimerazı, bir tek nükleotid sekansı intergenik (IG) ile aralıklı, önceki geni (GE) ve yeni transgen (GS) başından sonuna tanıyabilir . Paramyxoviridae ailesinin en üyeleri için olduğu gibi, NDV nin (ii) etkili bir replikasyon, genom uzunluğu birden fazla olmak bağlıdır, geçerli bir Kozak (K) ökariyotik ribozomal Çeviri geliştirmek için dizisi eklenmesi de daha iyi bir yabancı protein ifadesi 32 için önerilir Altı 33, bu nedenle herhangi bir NDV ekleme, bu &quot;altı kural&quot; takip etmelidir. Gerekirse, reqedinilmiş ek nükleotidleri alt yeni ORF eklenebilir ve (iii) transgen sekansı bulmak için kontrol edilmelidir mümkün GE ve kurtarma verimlilik, transgen ekspresyonu ve / veya virüs canlılığını bozabilecek dizileri gibi GS. Eğer mevcutsa, bu diziler sessiz mutagenezi ile temizlenmelidir. Yukarıda belirtilen kurallara yeniden birleştirici tam uzunlukta bir cDNA üretimi etkili bir şekilde burada ayrıntılı biçimde açıklandığı gibi, genetik olarak değişime uğramış NDV üretmek için ilk adımdır. Sistemde tüm DNA yapıları, T7 RNA polimeraz promoteri (Şekil 3) kontrolü altındadır. Bu sitoplazmik polimerazı, bir modifiye edilmiş rekombinant vaccinia virüsü Ankara (MVA-T7) 34 ile birlikte-enfeksiyon ile trans sağlanır. Şekil 3A, tam uzunluklu antigenomik cDNA 5 kodlayan pNDV-B1 plazmid göstermektedir. Şekil 3B PTM1 plazmidler NP kodlayan gösterir, P ve L ORF. , U kodlayan plazmidler pCITE-GFP,nder T7 promoteri, yeşil floresan proteini (GFP) ve tavuk beta aktin promoteri 35 altında aynı ORF kodlayan pCAGGs GFP 18, kontrol olarak kullanılmıştır. Bu protokolde, lentojenik NDV soyu Hitchner B1 5 (Şekil 4) yeniden birleştirici NDV cDNA&#39;sından kurtarmak için bir işlemi göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>CORNING Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>Herhangi bir tedarikçi</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000 (LPF2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>%35 Sığır Albümini (BA)</td><td>Sigma</td><td>232-936-2</td><td>Herhangi bir tedarikçi</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>CORNING Cellgro</td><td>25-052-CI</td><td>Herhangi bir tedarikçi</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin (PS) 100x</td><td>CORNING Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>Herhangi bir tedarikçi</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td> Herhangi <td>bir tedarikçi</td></tr><tr><td colspan="4"> Hücre hatları A549 hücreleri (katalog numarası CRL-185), HEp-2 hücreleri (katalog numarası CRL-185), tavuk embriyosu fibroblastları (katalog numarası CRL-12203) ve ördek embriyosu fibroblastları (katalog numarası CCL-141) American Type Culture Collection'dan (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 ABD) temin edilebilir. Tüm hücre hatları 37 & derece; DMEM'de %5 CO2 içeren C inkübatörü %10 FBS, %1 PS. <güçlü>Embriyonlu tavuk yumurtası Embriyonlu tavuk yumurtaları Charles River Laboratuvarları, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services'ten (Franklin Commons, 106 Route 32, Kuzey Franklin, CT 06254, ABD) ve 37 ° C'de tutulur. Embriyoların canlılığı bir yumurta mumcusu ile değerlendirilir. Yumurtalar 8-10 günlük olduklarında enfekte olurlar. Allantoik sıvının hem enfeksiyonu hem de toplanması steril koşullar altında gerçekleşir. Tüm yumurtalar standart laboratuvar biyogüvenlik protokollerine göre otoklavlanır ve atılır. Türkiye kırmızı kan hücreleri (RBC) Türkiye RBC, Truslow Farms'tan (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, ABD) satın alınabilir ve 4 ° C'de saklanabilir. RBC'yi HA testi için hazırlamak için, 5 ml'lik ticari stoğu 50 ml'lik bir konik tüpte 45 ml PBS 1x ile yıkayın. 1.000 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice atın. Son %0.5-1.0 konsantrasyon için peletlenmiş RBC 1: 1.000'i PBS 1x içinde seyreltin. Yıkanmış RBC 4 ° C'de saklanabilir; Birkaç gün boyunca C. <güçlü>Plazmitler</güçlü> Plazmid preparatları, üretici&#039'u takiben piyasada bulunan herhangi bir maxiprep kiti ile elde edilir; ddH 2 0 içinde 1 & mu'luk bir nihai konsantrasyona seyreltilmiş s talimatları; g/&mu; DNA konsantrasyonu ve saflığı, 260 ve 280 nm'de spektrofotometri ile değerlendirilir. 260/280 oranı 1.8'den yüksek olan müstahzarlar, kurtarma için kabul edilebilir kalitede kabul edilir. Plazmid DNA kalitesi ayrıca agaroz jel kromatografisi ile rutin olarak iki kez kontrol edilir. Virus Lentojenik NDV suşu Hitchner B1'in kurtarılması için açıklanan protokol, biyogüvenlik seviyesi (BSL) 2 koşulları altında gerçekleştirilebilir. T7 RNA polimerazı (MVA-T7) eksprese eden Modifiye Vaccinia Ankara34 olarak tanımlandı ve Dr. Bernard Moss'tan elde edildi. Bu virüs, tavuk embriyosu fibroblastlarının birleşik tek tabakalarında büyür ve memeli (A549 veya HEp-2) hücrelerinde titre edilir. NDV stokları embriyonlu tavuk yumurtalarında büyütülür ve saflaştırılmış viryonlara karşı yükseltilmiş poliklonal serum kullanılarak IFA ile titre edilir. Tüm kontamine materyaller standart biyogüvenlik prosedürlerine göre güvenli bir şekilde sterilize edilmeli ve atılmalıdır. Doku kültürü ortamı ve solüsyonları: DMEM %10 FBS %1 PS:</güçlü> Dulbecco&#039; s modifiye Kartal&#039; % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve Penisilin / Streptomisin (P / S) ile desteklenmiş Orta (DMEM): 445 ml DMEM, 50 ml ısıyla inaktive edilmiş FBS, 5 ml 100x ticari P / S çözeltisi. 4 derece < güçlü > 10x Fosfat tamponlu salin (PBS) de saklayın: < / güçlü> 80 g NaCl, 2 g KCl, 11.5 g Na2HPO<>sub4.7H2O, 2 g KH2PO4. 1 L'ye kadar ddH2O ekleyin. PH'ı 7.3'e ayarlayın. Otoklav ile sterilize edin. Oda sıcaklığında saklayın. <güçlü>1x PBS: < / güçlü> 10x PBS 1:10'u ddH2O ile seyreltin. Otoklav ile sterilize edin ve oda sıcaklığında saklayın. <güçlü>100x Ca/Mg: </güçlü> 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O ve 100 ml'ye kadar ddH2O ekleyin. Otoklavlayın ve oda sıcaklığında saklayın. <güçlü>1x PBS/BA/PS:</güçlü> 50 ml 10x Fosfat tamponlu salin (PBS) 437 ml ddH2O. Otoklav ve oda sıcaklığına soğutulduğunda 5 ml 100x Penisilin / Streptomisin 3 ml %35 Sığır ve 5 ml 100x Ca/Mg ekleyin. 4 derece C.</p'de saklayın> </td></tr></tbody></table>

cdna&#39;dan rekombinant newcastle hastalığı virüsü rescue

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle hastalığı virüsü (NDV), ailenin Paramyxoviridae 1&#39;in Avulavirus cinsinin prototip üyesi, segmentli olmayan, negatif sens, tek iplikçikli bir aşılama için bir vektör olarak olası uygulamaları ile RNA virüsü (Şekil 1) saran ve bir insan hastalıklarının tedavisi. Bu uygulamaların derinlemesine keşif sadece cDNA 2-5 olarak tam genomu kodlayan plazmid rekombinant virüsleri kurtarmak için ters genetik tekniklerin kurulmasından sonra mümkün hale gelmiştir. Viral cDNA uygun bir virüsün genotipinin değiştirilmesi için ve / veya yeni transkripsiyon birimleri dahil etmek için, standart klonlama prosedürlerini kullanarak, in vitro olarak modifiye edilebilir. Bu tür genetik olarak modifiye edilmiş virüsler Rescue faktörleri çok sayıda enfeksiyon aşamaları etki, hem de antijenlerinin ifadesi ve dağıtımı için vektörlerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesi için izin anlamak için değerli bir araç sağlarAşılama ve tedavisi için. Burada rekombinant NDVs kurtarılması için bir protokol açıklar.

NDV'nin Kurtarma rutin virüsün tam cDNA erişebilir laboratuarlarda yapılan köklü bir işlemdir. Bununla birlikte, yöntemin içsel stokastik doğası zor% 100 verim elde etmek için kurtarma kılar. Işlemin ilk aşamaları, MVA-T7 ile özel olarak transfeksiyon verimi ve enfeksiyon izlenmesi, olası sorunları. Şekil 5A, standart transfeksiyon ve başarılı bir NDV kurtarma için yeterli transfeksiyon / enfeksiyon verimlilik gösterir belirleme yardımcı olur. Avyan memeli ko-kültür ve embriyolu yumurtalarda amplifikasy...

Newcastle hastalığı virüsü (NDV) yaygın olarak, diğerleri arasında, aşı ve tedavi için yeni vektörler geliştirmek için, son birkaç yıl içinde incelenmiştir. Bu çalışmalar nedeniyle bu tür burada açıklandığı gibi rekombinant virüs cDNA&#39;sından kurtarmak için teknikler, mümkün olmuştur.

CDNA&#39;dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Bu prosedürün genel amacı, rekombinant Newcastle hastalığı virüsünü veya NDV'yi klonlanmış DNA'dan kurtarmaktır. Bu, önce memeli hücrelerini T yedi polimerazı kodlayan bir yardımcı virüs ile enfekte ederek ve daha sonra bu hücreleri plazmitlerle keserek, T yedi promotörün kontrolü altında virüsün minimal replikasyon mekanizmasını kodlayarak gerçekleştirilir. İkinci adım, transfekte edilmiş memeli hücrelerini, virüsün doğal konakçılarından olan kuş hücreleri ile birlikte yetiştirmektir.Memeli hücrelerinden salınan yeni üretilen varyanslar, ilk amplifikasyon turu için kuş hücrelerini enfekte edecektir. Daha sonra, ko-kültürün süpernattanı, kurtarılan virüsün daha da büyümesi için embriyonlu tavuk yumurtalarına aşılanır, son adım, aşılanmış yumurtalardan LAN toik sıvısını toplamaktır. Sonuç olarak, LAN toik sıvısında NDV'nin varlığını ve kurtarma işleminin başarısını göstermek için basit bir Hemaglutinin nation testi kullanılır.Bu yöntemle kurtarılan rekombinant virüsler, enfeksiyonu etkileyen farklı faktörler hakkında bilgi sağlayabilir ve ayrıca aşılama ve antitümöral tedavi için antijenlerin verilmesi için vektörler olarak kullanılabilir. Memeli hep iki veya 5 49 hücreyi altı oyuklu plakada transfeksiyondan bir gün önce bölmeye başlamak için, hücrelerin yoğunluğu ertesi gün %80 ila 90 oranında birleşmelidir. Kurtarılacak her virüs için iki ila dört farklı kuyu ekleyin.Ayrıca PCA'lar, GFP ve pite kontrolleri için iki ekstra kuyu içerir, GFP sırasıyla transfeksiyon ve MVAT yedi enfeksiyon verimliliğini izlemeyi amaçlamıştır. Hücreleri bir mililitre ısıtılmış PBS ile iki kez yıkayın, daha sonra kültürlenmiş memeli hücrelerini, hücre başına bir PFU enfeksiyonu çokluğunda MVA T yedi virüsü ile enfekte edin. PBS'de 200 mikrolitrelik son hacimde, viral enfeksiyon inkübasyonu sırasında hücreleri oda sıcaklığında bir saat inkübe etmeye bırakın, lipektomi optimum solüsyonu hazırlandıktan ve beş dakika boyunca ön inkübe edildikten sonra transfeksiyon karışımını yazılı metinde anlatıldığı gibi hazırlayın.DNA tüplerine 250 mikrolitrelik bir çözelti ve MVAT yedi ile inkübasyonu takiben oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin, virüs inokulumunu aspirasyon ile çıkarın ve DNA lipo transfeksiyon karışımı ile değiştirin. Her yemeğe bir mililitre DMEM% 10 FBS ekleyin. Enfekte olmuş transfekte edilmiş hücreleri 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte altı ila sekiz saat inkübe edin.Daha sonra transfeksiyon ortamını 1.5 mililitre taze DMEM% 10 FBS ile değiştirin Transfeksiyondan 24 saat sonra, enfekte olmuş transfekte edilmiş memeli hücrelerinin kuş fibroblastları ile ko-kültürüne devam etmeden önce transfeksiyon verimliliğini ve T yedi polimeraz aktivitesini değerlendirmek için bir floresan mikroskobu altında kontrol kuyuları gözlemlenebilir. Genellikle, iki transfekte edilmiş kuyucuk başına 100 milimetrelik bir doku kültürü tavuk veya ördek embriyosu fibroblast tabağı kullanılır. Yeterince önceden hazırlandığınızdan emin olun.Virüsün verimli bir şekilde kurtarılması için tüm kurtarma girişimlerinde kuş hücrelerinin 100 milimetre doku kültürü kapları. DMEM %10 FBS ortamı, %5 elan toik sıvı ve 30 milimolar magnezyum klorür ile desteklenir. Memeli hücrelerini ısıtılmış bir XPBS tripsin ile iki kez yıkadıktan sonra, hücreleri ayrılana kadar 0.2 mililitre EDTA, tripsin ile gözler.Hücreleri takviye edilen DMEM'in bir mililitresinde yeniden süspanse edin ve aynı ortamın üç mililitresinde 100 milimetrelik bir doku kültürü kabına aktarın. Kuş hücrelerini ısıtılmış bir XPBS tripsin ile iki kez yıkadıktan sonra, hücreleri bir mililitre EDTA tripsin ile gözler ve hücreler ayrılana kadar 37 santigrat derecede bir ila iki dakika inkübe edin. Hazırlanan ortamdan sekiz mililitre ekleyerek kuş hücrelerini yeniden askıya alın.Daha sonra, toplam sekiz mililitre hacim için, ko-kültür 100 milimetre doku kültürü kabındaki memeli hücrelerine dört mililitre trips ile inized kuş hücresi ekleyin. Düzgün bir dağılım sağlamak için 100 milimetrelik tabakta birlikte kültürlenmiş hücreleri hafifçe çalkalayın ve ardından üç ila dört gün boyunca 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin. Yumurtalar, birlikte kültürlenmiş hücrelerin tümü MVAT yedi viral enfeksiyonu nedeniyle sitopatik etkiden etkilendiğinde enfekte olur.Bu noktada, doku kültürü süpernatantından bir mililitre çıkarın ve bunu bir eend DPH tüp santrifüjüne ekleyin. Doku kültürü, bir tezgah üstü santrifüjde 12.000 RPM'de bir dakika boyunca süpernatant. Hücresel kalıntıları temizlemek için, hava kesesi ile Alan Toic boşluğu arasındaki arayüzü görmek için hafif bir kutu kullanarak yumurtaları mumlayın.Kan damarı lokalizasyonundan kaçınarak arayüz sınırında bir işaret yapın. Steril koşullar oluşturmak için yumurtaların üzerine% 70 etanol püskürtün. İşaretli noktada yumurta kabuğunda yavaşça bir delik açın.Daha sonra, bir mililitrelik bir şırınga kullanarak 500 mikrolitre snat aşılayın ve iğneyi dikey olarak ve doğrudan Alan Toic boşluğuna hedefleyin. Yumurta kabuğundaki çentiği eritilmiş balmumu veya parafin ile kapatın. Yumurtaları iki ila üç gün kuluçkaya yatırın 37 santigrat derecede.Tavuk embriyosunu öldürmek ve kanı pıhtılaştırmak için enfekte yumurtaları iki ila dört saat veya gece boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Steril koşulları korumak için yumurtalara %70 etanol püskürtün. Yumurtanın apikal kısmını bir kaşıkla hava boşluğunun üzerine dikkatlice vurun.Yumurta yumurta kabuğu çatladığında, parçaları forseps ile çıkarın ve LAN toik zarını tamamen açığa çıkarın. KBB toik zarını forseps ve makasla eksize ederek, kan damarlarına ve meşe ağacına zarar vermekten kaçınarak LAN toik boşluğunu ortaya çıkarın. Embriyoyu bir spatula ile dikkatlice aşağı doğru itin ve yukarı akan LAN toik sıvısını 10 mililitrelik bir pipetle toplayın.Yumurta sarısı zarına zarar vermekten kaçının. LAN toik sıvısını buz üzerinde 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. LAN toic sıvısını 1500 RPM'de beş dakika santrifüjleyerek berraklaştırın.Süpernatanı, peleti bozmadan yeni bir tüpe aktarın. Numuneleri, Hemaglutinin Nation testi ile NDV varlığını kontrol edene kadar bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. Enfekte yumurtalardan Alan Toic sıvısında virüsün varlığı, hemaglutinin, sekiz hindi, kırmızı kan hücresi, bir XPBS veya enfekte olmamış Alan Toic sıvısı gibi negatif kontrol numunelerinin yanı sıra herhangi bir NDV virüsünden Al Toic sıvısı gibi pozitif kontrol numuneleri ile makroskopik olarak belirlenebilir, doğrulamak için her zaman herhangi bir HA testine dahil edilmelidir.HA tahlilini gerçekleştirmek için, V tabanlı 96 oyuklu bir plakaya oyuk başına 50 mikrolitre bir XPBS pipetleyin, ardından 50 mikrolitre LAN toik sıvı numunesini plakanın ilk sütunundaki kuyucuklara pipetleyin. Plakanın geri kalanı boyunca iki kat seri seyreltme yapın ve son 50 mikrolitreyi kuyucuklardan atın. Son sütunda, bir kuyucuk başına bir XPBS'de 50 mikrolitre% 0.5 Türkiye kırmızı kan hücresi dağıtın, plakayı 30 ila 45 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe ederek veya negatif kontrol kuyucuklarında berrak bir pelet oluşana kadar hafifçe sallayın.NDV kurtarma prosedüründeki erken adımlar, özellikle transfeksiyon verimliliği ve burada gösterilen MVAT yedi ile enfeksiyon izlenebilir. PAG GFP ile transfekte edilmiş veya MVAT yedi ile enfekte olmuş ve P sekiz GFP ile transfekte edilmiş 5 49 hücrenin temsili bir floresan ve parlak alan görüntüleri. PCA'lar tarafından yönlendirilen GFP ekspresyonu, transfeksiyon verimliliğinin bir göstergesi iken, P bölgesi tarafından yönlendirilen T yedi promotör güdümlü GFP ekspresyonu, MVAT yedi enfeksiyonu ve T yedi polimeraz aktivitesi için bir kontroldür.Görüntüler, kuş memeli kokültürlerinde ve embriyonlu yumurtalarda amplifikasyon turlarından sonra başarılı bir NDV kurtarması için yeterli olan transfeksiyon ve transfeksiyon enfeksiyonu verimliliklerini göstermektedir, kurtarılan virüsün varlığı HA testinde pozitif kuyucuklar tarafından tespit edilmektedir. NDV, eritrositleri bağlayarak hemaglutinini indükler ve böylece V şeklindeki kuyunun dibinde çökelmelerini önler. Bu nedenle, HA aktivitesinin eksikliği, burada negatif kontrolde gösterildiği gibi kırmızı yuvarlak bir kırmızı kan hücresi peletinin oluşumu ve kurtarma işleminden sonra elde edilen üç bilinmeyen örnekten bir negatif sonuç ile kolayca ayırt edilebilir.Bu videoyu izledikten sonra, rekombinant Newcastle hastalığı virüsünü CDNA'dan yüksek tekrarlanabilirlik ile nasıl kurtaracağınızı iyi anlamış olmalısınız.

rescue-of-recombinant-newcastle-disease-virus-from-cdna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Plazmid DNA influenza A virüsleri Kurtarma grip araştırmacılar grip virüsünün biyoloji çeşitli yönlerini incelemek amacıyla rekombinant virüsler üretmek için, ve potansiyel vektörler veya aşı olarak kullanılmak üzere izin veren bir temel ve temel deneysel bir tekniktir.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Rift Vadisi ateşi virüs MP-12 aşı suşu için ters genetik sistemi ek MP-12 mutantlar artan zayıflama ve immünojenite oluşturmak için yararlı bir araçtır. Biz NSS mutant suşlar oluşturmak ve karakterize etmek için protokol açıklar.

Rift Vadisi Ateşi Virüsü Aşı Güvenliği ve Etkinliği Artırmak İçin MP-12 Gerinim NSS Gen işleyin Ters Genetik kullanma

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

Klonlanmış cDNAs, gibi genetik tersine adlandırılan bir yaklaşım, gelen rekombinant arenaviruses kurtarma araştırmacılar arenavirus biyolojisi birçok farklı yönlerine, spesifik viral gen ürünlerinin rolü, hem de onların farklı özel etki ve kalıntılarının katkısını araştırmak için izin verir . Benzer şekilde, insan patojen arenaviruses mücadele etmek için etkili ve güvenli aşıların üretimi için yeni olanaklar sağlar aşı geliştirilmesi için FDA onaylı hücre çizgileri (Vero) bölgesindeki genetik...

FDA onaylı Vero hücrelerinde Aşı Geliştirme için bir araya getiren Arenavirus üretimi

Son 15 yılda, köpek adenovirüsü tip 2 (CAV2) türevi vektörler, in vitro ve in vivo hücreleri dönüştürme etkinliklerini kanıtlamıştır ve aşılama ve gen tedavisi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, yüksek titreli viral süspansiyonlara yol açan CAV2 vektörlerini oluşturmak, üretmek ve saflaştırmak için bir prosedür açıklıyoruz.

Non Replikatif Kanin adenovirüs tip 2 türetilmiş vektörler üretimi ve saflaştırılması

Burada, Japon ensefalit virüsünün pozitif sarmallı genomik RNA'sının tam uzunlukta bir cDNA'sını içeren bulaşıcı bir bakteriyel yapay kromozom oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, diğer pozitif sarmallı RNA virüslerinin işlevsel bir cDNA'sını oluşturmak için kullanılabilir, bu da onu virüs biyolojisini incelemek için güçlü bir genomik araç haline getirir.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Biz üretmek için bir yöntem tanımlamak ve genetik olarak yükseltecek solunum sinsisyal virüs (RSVs) ve bir en iyi duruma getirilmiş plak tahlil RSVs için değiştirilebilir. Biz bu protokolü sırasıyla miktar RSV çoğaltma izin ve analiz RSV dahil organları ve granül dahil organları ilişkili dynamics canlı iki rekombinant virüs oluşturarak göstermektedir.

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

Zika virüsü son salgını aşılar ve/veya terapötik stratejileri geliştirmek için ters genetik yaklaşımlar kurulması önemini vurgular. Burada, biz insan sitomegalovirus acil-erken Organizatör kontrolü altında bir bakteriyel yapay kromozom monte tam uzunlukta cDNA klon bir bulaşıcı rekombinant Zika virüsü kurtarmak için protokol tarif.

Bir bakteriyel yapay kromozom cDNA klon rekombinant Zika virüs kurtarma

Burada, yüksek titreli rekombinant Newcastle hastalığı virüsünün üretimi, saflaştırılması ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bu protokol sürekli olarak &gt; 6 × 109 plak oluşturan birim / mL verir ve in vivo hayvan çalışmaları için uygun virüs miktarlarını sağlar. İn vivo güvenliği sağlamak için ek kalite kontrol testleri açıklanmaktadır.

Allantoik Sıvıdan Yüksek Titerli Rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Üretimi

Bu protokol belgesi, lens gelişimi sırasında in situ fonksiyon ve proteinlerin ekspresyonunu incelemek için bir araç olarak bir RCAS(A) retrovirüsünün embriyonik tavuk lensi mikroenjeksiyonunun metodolojisini açıklamaktadır.

Rekombinant RCAS(A) Retrovirüsünün Embriyonik Tavuk Lensine Mikroenjeksiyonu

Bu makale, Newcastle hastalığı virüsü serolojik testi için 4 hemaglutinasyon ünitesi antijen hazırlamak için basitleştirilmiş bir yöntem sunmaktadır. Antijenin hemaglutinasyon titresini doğru bir şekilde belirleyerek, daha titiz bir geri titrasyon yöntemi ve iyi tanımlanmış bir ayarlama süreci ile birleştiğinde, test verimliliğini artırır, yanlış pozitifleri azaltır ve kümes hayvanlarında hastalık sürveyansını iyileştirir.

Hemaglutinasyon İnhibisyonu için Antijen Preparatının Optimizasyonu: Newcastle Hastalığı Virüsü Serolojisinin Testi

Öğrenin, klonlanmış DNA'dan rekombinant Newcastle hastalığı virüsünü kurtarma yöntemini. Memeli hücre enfeksiyonu, plazmid transfeksiyonu ve embriyonlu yumurta kullanımıyla viroloji ve aşı geliştirme araştırmalarında uygulanır.

CDNA'dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

Daha fazla video keşfet