Name: Non Replikatif Kanin adenovirüs tip 2 türetilmiş vektörler üretimi ve saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-03T13:50:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Öğrenin CAV2 türevli vektörlerin yapımını, üretimini ve saflaştırılmasını. Bu yöntem gen tedavisi ve aşılama uygulamalarında yüksek verimli hücre transdüksiyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, INSERM, CNRS, Fondation pour la Recherche Médicale ve Agence Nationale pour la Recherche (ANR- 10-Blanc-1322) tarafından DGD'ye verilen hibelerle finansal olarak desteklenmiştir; Avrupa Komisyonu'nun B.K.'ye yönelik Yedinci Çerçeve Programı; Yüksek Lisans, FRM'den ("Equipe FRM 2009" programı) doktora sonrası bursu ile desteklenmiştir; C.B., 245266 numaralı hibe sözleşmesi (Orbivac) kapsamında UE'den doktora sonrası bir burs ile desteklenmiştir.

1. Replikatif Olmayan CAV2 Genom Plazmidinin İnşası
Not: Bu protokolde açıklanan tüm plazmitler daha önce7 açıklanmıştır ve istek üzerine temin edilebilir.
<ol>
	<li>pShuttle-GOI oluşturmak için uygun kısıtlama enzimlerini kullanarak GOI'yi pShuttle plazmidine klonlayın (Şekil 1A).</li>
	<li>2 μg pShuttle-GOI'yi AscI/PacI ile sindirin. Sindirim, plazmit omurgasından (2.8 kbp) Shuttle-GOI fragmanını (~ 2.9 kbp + GOI ORF dizisi) serbest bırakır.</li>
	<li>NucleoSpin Jel ve PCR Temizleme kiti kullanarak agaroz jel elektroforezinden sonra Shuttle-GOI fragmanını saflaştırın.</li>
	<li>Paralel olarak, 1 μg pCAV2 genomik plazmitini SwaI ile sindirin. pCAV2 plazmidi, E1 bölgesi içinde bulunan benzersiz bir SwaI bölgesi içerir (Şekil 1B). Bu kısıtlama enzimini 65 ° C'de 20 dakika boyunca ısıyla etkisiz hale getirin.</li>
	<li>Yetkili E. coli BJ5183 bakterilerini homolog rekombinasyon için 500 ng saflaştırılmış Shuttle-GOI fragmanı ve 100 ng doğrusallaştırılmış pCAV2 plazmidi ile dönüştürün (Figure 1B). LB-Amp plakalarına yayın. Plakaları 37 °C'de en az 20 saat inkübe edin.</li>
	<li>Aşağıdaki döngü koşulları altında ileri (5'-CACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA-3') ve geri (5'-GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGC-3') primerli EmeraldAmp ana karışımını kullanarak doğrudan bakteri kolonileri üzerinde PCR analizi gerçekleştirin: 95 °C'de 10 dakika (bir döngü için), 95 dakika boyunca 1 °C; 58 dakika boyunca 1 °C; 72 °C için 1 dk/kbp (39 döngü için), ve son olarak 72 °C'de 5 dakika. 1 kbp + GOI ORF dizisinin bir ürünü, pCAV-GOI pozitif klonlardan amplifiye edilirken, negatif klonlarla hiçbir PCR ürünü tespit edilemez.</li>
	<li>Bir çalkalayıcıda (220 rpm) 37 ° C'de 5 ml LB-amp ortamda, her biri gece boyunca en az iki pozitif koloniyi aşılayın.</li>
	<li>Nucleospin plazmit kitini kullanarak plazmit DNA'larını çıkarın. Yetkili E. coli DH5α bakterilerini her DNA hazırlığının bir alikotu ile dönüştürün. Bakteriyel süspansiyonu LB-Amp plakalarına yayın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>Her pozitif klonun iki kolonisini gece boyunca 3 ml LB-amp ortamında 37 ° C'de bir çalkalayıcıda (220 rpm) aşılayın. Nucleospin plazmit kitini kullanarak plazmit DNA'sını çıkarın.</li>
	<li>Elde edilen DNA'yı ve ebeveyn pCAV2 plazmidini (kontrol olarak) NdeI ile sindirin. Ebeveyn pCAV2'nin kısıtlama modeli 14,8 kbp, 9 kbp, 7,9 kbp ve 1,6 kbp'dir. GOI ifade kaseti, 7.9 kbp fragmanının içine yerleştirilir ve en az bir NdeI bölgesi, yani kasette bir tane ve GOI'de bulunan potansiyel bölgeleri içerir.</li>
	<li>Pozitif yapıları seçin ve en az 2 bağımsız klon ile 2. adıma geçin.</li>
</ol>
2. Rekombinant CAV2 Genom Plazmidinin DK-E1 Hücrelerine Transfeksiyonu
Not: CAV2'den türetilen replikatif olmayan vektörler, Biyogüvenlik Seviyesi 2 (BSL-2) olarak sınıflandırılan genetik olarak değiştirilmiş organizmalardır, oysa hayvan modellerinde kullanımları BSL-1 olarak sınıflandırılır. Lütfen kişisel koruyucu ekipman da dahil olmak üzere uygun muhafaza ve atık işleme önlemlerini kullanın ve BSL-2 laminer akış davlumbazları altında çalışın.
<ol>
	<li>Transfeksiyondan bir gün önce, DK-E1 hücrelerini 6 oyuklu bir plakaya tohumlayın. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) %7 ısıyla inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS), 1 mM sodyum piruvat ve 100 U/ml penisilin / 100 μg/ml streptomisin içeren yüksek glikozlu Modifiye Kartal Ortamında 37 °C ve %5 CO2'de hücreleri büyütün. Transfeksiyon için hücreler% 70-80 birleşik olmalıdır.</li>
	<li>Plazmidin viral olmayan dizisini serbest bırakmak için 2 μg pCAV-GOI plazmitini AscI ile sindirin. Ortaya çıkan kısıtlama modelini% 0.8 agaroz jel elektroforezi ile kontrol edin. Sindirim, rekombinant genomu içeren ~ 31 kbp'lik bir fragman ve plazmit omurgasına karşılık gelen 2 kbp'lik bir fragman vermelidir.</li>
	<li>Sindirilmiş DNA'yı 200 μl Jet Prime Tamponu ile 10 saniye girdaplayarak karıştırın. 4 μl Jet Prime ekleyin ve 10 saniye girdaplayarak karıştırın. Damlacıkları çıkarmak için kısa bir süre döndürün ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Transfeksiyon karışımını hücrelere damla damla ekleyin. Karışımı eşit şekilde dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın ve 37 °C'de inkübe edin.</li>
</ol>
3. Rekombinant CAV2'nin Yayılımı
<ol>
	<li>Transfeksiyondan bir hafta sonra, hücreleri ve kültür ortamını 15 ml'lik bir polipropilen tüpte toplayın. Hücreleri üç donma-çözülme döngüsü (-80 °C / 37 °C) ile bozun ve lizatı 1.800 x g'da 10 dakika santrifüjleme ile temizleyin.</li>
	<li>Süpernatanı toplayın ve sonraki virüs yayılımı için -20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>0.5 ml virüs içeren süpernatan ile 6 oyuklu plakanın bir oyuğunda büyütülen% 80-90 birleşik DK-E1 hücresi tek tabakasını enfekte edin. Hafif çalkalama altında 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. İnokulumu çıkarın ve %5 ısıyla etkisiz hale getirilmiş FCS içeren 1,5 ml tam DMEM ile değiştirin.</li>
	<li>Hücreleri 37 ° C'de 3-4 gün inkübe edin. Hücreler, sitopatik bir etkinin ortaya çıkması için günlük olarak izlenmelidir (CPE, Şekil 2A-B). Net bir CPE görünmüyorsa, 4 günlük kültürden sonra hücreleri hasat edin ve 3.1-3.4 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Berrak bir CPE hücrelerin çoğunu etkilediğinde, genellikle 2-4 viral amplifikasyon turundan sonra, hücreleri kültür ortamı ile toplayın ve yukarıda tarif edildiği gibi 3 kez dondurun. Her seferinde 0.5 ml virüs içeren süpernatan kullanarak, 10 cm çapında üç doku kültürü kabında büyütülen %80-90 birleşik DK-E1 hücrelerini enfekte edin.</li>
	<li>3-4 gün sonra (CPE tamamlandığında), bu 10 cm'lik tabaklardan hücreleri hasat edin, tekrar üç donma-çözülme döngüsü ile parçalayın, lizatı 1.800 x g'da 10 dakika santrifüjleme ile temizleyin, süpernatant toplayın ve büyük ölçekli CAV2 amplifikasyonu için -20 ° C'de saklayın.</li>
</ol>
4. Büyük Ölçekli CAV2 Saflaştırma
<ol>
	<li>Kırk adet 10 cm çapında doku kültürü kaplarında büyütülen DK-E1 hücrelerinin %80-90 birleşik tek tabakalarını enfekte eder. Her yemek için, FCS olmadan 1 ml tam DMEM içinde seyreltilmiş 0.1 ml virüs içeren süpernatan kullanın. Hücreleri hafif çalkalama altında 37 ° C'de 3 ila 4 saat inkübe edin. % 5 FCS ile desteklenmiş 5 ml tam DMEM ekleyin.</li>
	<li>3 gün kuluçkaya yatırın. 50 ml'lik polipropilen tüplerdeki kırk 10 cm'lik tabaktan enfekte olmuş hücreleri hasat edin. Pelet hücreleri 1,200 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca ve 15 ml DMEM ortamında yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücreleri üç donma-çözülme döngüsü (-80 °C/37 °C) ile bozun. 10 dakika boyunca 1.800 x g'da santrifüjleyerek hücre kalıntılarını çıkarın ve viral partiküllerin saflaştırılmasından önce süpernatanı -20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>14 ml'lik Ultra-Clear bir tüpte süreksiz bir CsCl gradyanı hazırlayın. İlk olarak, tüpün dibine 2 ml CsCl çözeltisi (fosfat tamponlu tuzlu su içinde 1.40 g / ml) dökün. Daha sonra, ilk çözeltinin üzerine yavaşça 2 ml CsCl çözeltisi (fosfat tamponlu tuzlu su içinde 1.25 g / ml) ekleyin.</li>
	<li>Viral süpernatanı CsCl gradyanının üstüne dikkatlice yükleyin. Tüpü üstten 2-3 mm'ye kadar mineral yağ ile doldurun. Sallanan bir SW40 rotorda 130.000 x g ve 18 °C'de 1,5 saat santrifüjleyin.</li>
	<li>Santrifüjlemeden sonra, 2 CsCl çözelti katmanı arasındaki arayüzde iki beyaz bant açıkça görülebilir (Şekil 2C). 21 G'lik bir iğne ve bir şırınga kullanarak, olgun CAV2 parçacıkları içeren alt bandı yandan delinerek toplayın. Boş viral partiküllere karşılık gelen üst bandı toplamaktan kaçınmak için mümkün olduğunca deneyin.</li>
	<li>Toplanan viral partikülleri bir CsCl çözeltisi (fosfat tamponlu salin içinde 1.34 g / ml) ile karıştırarak 14 ml'lik şeffaf bir tüpte sürekli bir CsCl gradyanı hazırlayın. Tüpü üstten 2-3 mm'ye kadar mineral yağ ile doldurun. Sallanan bir SW40 rotorda 130.000 x g ve 18 °C'de 18 saat santrifüjleyin.</li>
	<li>Santrifüjlemeden sonra, beyaz CAV2 içeren bandı yukarıda açıklandığı gibi bir şırınga ile yan yana delinerek toplayın. Yine, kalan üst bandı toplamaktan kaçınmaya çalışın. İki bandı daha iyi ayıran bu sürekli gradyanda bu daha kolay olmalıdır. Toplanan süspansiyonun toplam hacmi 2 ml'yi geçmemelidir.</li>
	<li>Bir Sephadex G-25 PD-10 kolonunu 30 ml PBS ile dengeleyin.</li>
	<li>Viral süspansiyonu yükleyin ve akışı atın.</li>
	<li>500 μl PBS'nin fraksiyonları ile elute. Genellikle tuzdan arındırılmış CAV2 parçacıklarını içeren 5-7 fraksiyonlarını toplayın. Virüs içeren fraksiyonlar, yanardöner oldukları için kolayca tanımlanabilir. 1.5 ml CAV2 süspansiyonuna 150 μl gliserol ekleyin ve -80 ° C'de alikotlarda saklayın.</li>
</ol>
5. Son Nokta Seyreltme ile CAV2 Titrasyonu
<ol>
	<li>Saflaştırılmış virüsün bir kısmını buz üzerinde çözdürün ve serumsuz DMEM'de 10 kat seri seyreltme (10-2-10-12 arasında değişen) gerçekleştirin.</li>
	<li>96 oyuklu bir plakanın 5 oyuğuna her viral seyreltmeden 50 μl ekleyin. Her oyuğa 1,5 x 104 DK-E1 hücresi ekleyin. Plakayı 5 gün boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin.</li>
	<li>Enfeksiyondan sonraki 5. günde, mikroskobik gözlemle CPE görünümünü izleyin (Şekil 2A-B). Enfeksiyöz titreler, Reed ve Muench istatistiksel yöntemi13 kullanılarak medyan doku kültürü enfeksiyöz dozları (TCID50) olarak belirlenir.</li>
</ol>

<ol><li>Kaufmann, J. K., Nettelbeck, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+chimeras+for+gene+therapy%2C+vaccination%2C+and+oncolysis%3A+adenoviruses+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Virus chimeras for gene therapy, vaccination, and oncolysis: adenoviruses and beyond.</a> Trends Mol. Med. 18, 365-376 (2012).</li>
<li>Curr, Topics Microbiol. Immunol. 343, 195-224 (2010).</li>
<li>Zak, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merck+Ad5%2FHIV+induces+broad+innate+immune+activation+that+predicts+CD8%28%2B%29+T-cell+responses+but+is+attenuated+by+preexisting+Ad5+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Merck Ad5/HIV induces broad innate immune activation that predicts CD8(+) T-cell responses but is attenuated by preexisting Ad5 immunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3503-3512 (2012).</li>
<li>Paillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+non-human+adenoviruses+versus+human+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Advantages of non-human adenoviruses versus human adenoviruses.</a> Hum. Gene Ther. 8, 2007-2009 (1997).</li>
<li>Ackermann, A., Guelzow, T., Staeheli, P., Schneider, U., Heimrich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+dissemination+in+the+mouse+nervous+system%2C+using+a+green+fluorescent+protein-expressing+Borna+disease+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral dissemination in the mouse nervous system, using a green fluorescent protein-expressing Borna disease virus vector.</a> J. Virol. 84, 5438-5442 (2010).</li>
<li>Bru, T., Salinas, S., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+canine+adenovirus+type+2+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">An update on canine adenovirus type 2 and its vectors.</a> Viruses. 2, 2134-2153 (2010).</li>
<li>Bouet-Cararo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+adenoviruses+elicit+both+humoral+and+cell-mediated+immune+responses+against+rabies+following+immunisation+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunisation of sheep.</a> Vaccine. 29, 1304-1310 (2011).</li>
<li>Soudais, C., Skander, N., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+transduction+of+neurons+throughout+the+rat+CNS+using+novel+helper-dependent+CAV-2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo transduction of neurons throughout the rat CNS using novel helper-dependent CAV-2 vectors.</a> FASEB J. 18, 391-393 (2004).</li>
<li>Deinhardt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5+and+Rab7+control+endocytic+sorting+along+the+axonal+retrograde+transport+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway.</a> Neuron. 52, 293-305 (2006).</li>
<li>Soudais, C., Laplace-Builhe, C., Kissa, K., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+transduction+of+neurons+by+canine+adenovirus+vectors+and+their+efficient+retrograde+transport+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Preferential transduction of neurons by canine adenovirus vectors and their efficient retrograde transport in vivo.</a> FASEB J. 15, 2283-2285 (2001).</li>
<li>Peltekian, E., Garcia, L., Danos, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotropism+and+retrograde+axonal+transport+of+a+canine+adenoviral+vector%3A+a+tool+for+targeting+key+structures+undergoing+neurodegenerative+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Neurotropism and retrograde axonal transport of a canine adenoviral vector: a tool for targeting key structures undergoing neurodegenerative processes.</a> Mol. Ther. 5, 25-32 (2002).</li>
<li>Chartier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+recombinant+adenovirus+vectors+by+homologous+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli.</a> J. Virol. 70, 4805-4810 (1996).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hyg%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Segura, M. M., Puig, M., Monfar, M., Chillon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatography+purification+of+canine+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Ther.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatography purification of canine adenoviral vectors.</a> Human Gene Ther. Methods. 23, 182-197 (2012).</li>
<li>Segura, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+assay+for+quantification+of+canine+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virological%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR assay for quantification of canine adenoviral vectors.</a> Journal of virological. 163, 129-136 (2010).</li>
<li>Fernandes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocess+development+for+canine+adenovirus+type+2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioprocess development for canine adenovirus type 2 vectors.</a> Gene Ther. , (2012).</li>
<li>Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K., Kienitz, M. C., Pott, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+delivery+of+short+hairpin+RNA+%28shRNA%29+mediates+efficient+gene+silencing+in+terminally+differentiated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes.</a> Methods Mol. Biol. 515, 107-123 (2009).</li>
<li>Huang, B., Kochanek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+silencing+of+huntingtin+expression+by+shRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated silencing of huntingtin expression by shRNA.</a> Hum. Gene Ther. 16, 618-626 (2005).</li>
<li>Tordo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+adenovirus+based+rabies+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Canine adenovirus based rabies vaccines.</a> Dev. Biol. 131, 467-476 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada açıklanan ve iyi belgelenmiş Ad5 teknolojisinden uyarlanan basit yöntem, ~4,2 kbp'lik tipik bir klonlama kapasitesine sahip, replikatif olmayan CAV2 vektörlerinin verimli bir şekilde üretilmesine olanak tanır. Zaman değerlendirmeleri ile ilgili olarak, rekombinant bir CAV2 genomu genellikle iki hafta içinde üretilirken, viral süspansiyonları çoğaltmak, saflaştırmak ve titrek etmek için ek 5 hafta sürecektir.
CAV2'den türetilen vektörlerin ilk partisinin üretimi zaman alıcı görünse de, C...

Son on yıllarda, adenovirüslerden (Ads) türetilen vektörler, gen terapisi ve aşılamanın yanı sıra onkolitik viroterapi 1 için etkinliklerini kanıtlamıştır. Reklamlar, memelilerden, kuşlardan, sürüngenlerden, amfibilerden ve balıklardan izole edilmiş Adenoviridae familyasının zarfsız ikosahedral virüsleridir. 1953'teki keşiflerinden bu yana, ADS, virüs/hücre etkileşimlerini incelemek için modeller olarak ve daha yakın zamanda vektör tabanlı gen dağıtım sistemleri olarak yoğun bir şekilde incelenmiştir 2. Gerçekten de, Ads tabanlı vektörler, geniş konak yelpazesi ve iyi karakterize edilmiş biyolojileri gibi birçok avantajın yanı sıra, büyük ölçekli üretim için genetik olarak manipüle edilebilme ve büyütülebilme kolaylığı sunar.
İnsan popülasyonlarında insan Ads 3'ten türetilen vektörlere karşı önceden var olan bağışıklıkla ilgili klinik zorlukların üstesinden gelmek için, biz ve diğerleri insan olmayan Ads 4'ten vektörler türetmeye başladık. Ek olarak, insan dışı adenoviral vektörler, ulusal düzenleyici makamlar tarafından risk değerlendirmesi sırasında güvenlik ve güvenlik gerekliliklerine daha uyumlu olmaları gerektiğinden, veteriner hekimlikte toplu aşılama için klasik olarak kullanılan adenovirüs tip 5'ten (Ad5) daha fazla uyarlanmış görünmektedir. 1990'ların sonlarında, ilk rekombinant CAV2'yi Ad5 5'ten türetilen vektörlere insan olmayan bir alternatif olarak tanımladık. O zamandan beri, çok sayıda çalışma, CAV2 vektörlerinin terapötik veya antijenik gen transferi için potansiyelini doğrulamıştır (incelemeler için 6,7). Diğer Reklamlar gibi, CAV2'den türetilen vektörler de kararlıdır ve yüksek titrelerde üretilebilir, bu da in vivo kullanımlarını kolaylaştırır. Uzun süreli transgen ekspresyonuna izin vermelerine rağmen bütünleştirici olmadıkları için de güvenlidirler in vivo (>1 yıl) 8. Dikkat çekici bir şekilde ve insan Ads serotiplerinden daha iyi olan CAV2 vektörlerinin, aksonlarda çok verimli bir retrograd taşıma ile oldukça nörotropik olduğu gösterilmiştir 9,10. Bu içsel özellik, şimdiye kadar merkezi sinir sistemine gen transferi için yaygın olarak kullanılan, lentiviral vektörler tarafından zorlukla erişilemeyen belirli beyin bölgelerinin nöronlarını dönüştürmek için rekombinant CAV2 vektörlerini kullanma fikrini getirdi 11.
Burada, Manhattan suşundan türetilen replikatif olmayan CAV2 vektörlerini oluşturmak, üretmek ve saflaştırmak için basit ve klasik bir protokolü açıklıyoruz. Rekombinant CAV2 genomları, her yerde bulunan bir ekspresyon sağlayan sitomegalovirüs (CMV) erken promotörün bir kaset aşağı akışında istenen ilgilenilen genin (GOI) klonlanmasıyla oluşturulur. CAV2 vektörleri, büyük cDNA'nın eksprese edilmesine izin veren ~ 4.2 kbp'lik bir klonlama kapasitesine sahiptir. İkinci adımda, bu ekspresyon kaseti, CAV2 genomunun E1 bölgesinin yerine homolog rekombinasyon ile yerleştirilir ve başlangıçta Chartier ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi replikatif olmayan bir virüse (dlE1) yol açar. 12 Son olarak, genomik plazmidin bir CAV2-E1 eksprese eden köpek böbrek hücre hattına (DK-E1) transfeksiyonu üzerine viral partiküller üretilir ve viral stokların konsantrasyonu ve saflaştırılmasından önce seri olarak amplifiye edilir. Burada tarif edilen yöntem, sezyum klorür (CsCl) gradyanlarında iki aşamalı bir ultrasantrifüjleme kullanır, bu da bulaşıcı parçacıkların yüksek bir nihai titre ile zenginleştirilmesini sağlar (genellikle ml başına 1010'dan fazla bulaşıcı parçacık). Viral süspansiyon daha sonra tek kullanımlık Sephadex G-25 kolonları aracılığıyla kromatografi ile tuzdan arındırılır, böylece sonuçta doğrudan in vivo olarak kullanılabilecek kadar saf olur.

<table><tbody><tr><td>Restriksiyon enzimleri</td><td>New England Biolabs</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Jet Prime transfeksiyon kiti</td><td>Polyplus</td><td>114-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (Yaşam Teknolojileri)</td><td>10567014</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BJ5183 bakteri</td><td>Agilent</td><td>200154</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 tuz giderme kolonu</td><td>GE Sağlık</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>EmeraldAmp polimeraz</td><td>Takara</td><td>RR320A</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin plazmid kiti</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740558.250</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Jel ve PCR Temizleme</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>14 ml tüpler, Ultra Clear</td><td>Beckman</td><td>344060</td><td></td></tr></tbody></table>

non replikatif kanin adenovirüs tip 2 türetilmiş vektörler üretimi ve saflaştırılması

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Adenovirüs (Ad) türevi vektörler, hem gen tedavisi hem de aşı uygulamaları için kısa veya uzun süreli gen transferi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Klasik olarak kullanılan insan adenovirüsü tip 5'e karşı önceden var olan sık bağışıklık nedeniyle, köpek adenovirüsü tip 2 (CAV2), insan gen transferi için alternatif bir vektör olarak önerilmiştir. CAV2'nin iyi karakterize edilmiş biyolojisi, genetik manipülasyon kolaylığı ile birlikte, özellikle merkezi sinir sistemine gen transferi veya humoral bağışıklıktan hücresel bağışıklığa kadar çok çeşitli koruyucu bağışıklık tepkilerini indüklemek için büyük avantajlar sunar. Günümüzde CAV2, bir aşı vektörü olarak kullanım için en çekici insan dışı adenovirüslerden birini temsil etmektedir. Bu protokol, rekombinant CAV2 vektörlerini oluşturmak, üretmek ve titre etmek için basit bir yöntemi açıklar. İlgilenilen genin ekspresyon kasetinin bir mekik plazmidine klonlanmasından sonra, rekombinant genomik plazmit, E. coli BJ5183 bakteri suşunda homolog rekombinasyon ile elde edilir. Elde edilen genomik plazmit daha sonra tamamlayıcı CAV2-E1 genlerini (DK-E1) eksprese eden köpek böbrek hücrelerine transfekte edilir. Viral amplifikasyon, sezyum klorür gradyanları yoluyla ultrasantrifüjleme ile saflaştırılan ve diyaliz ile tuzdan arındırılan büyük bir viral stoğun üretilmesini sağlar. Elde edilen viral süspansiyon rutin olarak ml başına 1010'dan fazla enfeksiyöz partikülden oluşan bir titreye sahiptir ve doğrudan in vivo olarak uygulanabilir.

Rekombinant CAV2 vektörlerinin üretimi, temel ancak önemli moleküler biyoloji tekniklerine dayanır. Viral vektörlerin üretilmesinden önce, transgen için bir ekspresyon kaseti taşıyan rekombinant bir CAV2 genomu oluşturulması gereklidir. Bu oluşturma süreci iki aşamadan oluşur: ilk olarak, ilgilenilen gen (GOI), bir shuttle plazmide ekspresyon kaseti olarak (yani promotör ve poliadenilasyon sinyali ile birlikte) klonlanır. Bu fonksiyonel element, yukarı akış (upstream) ve aşağı akış (downstream) rekombinasyon böl...

Son 15 yılda, köpek adenovirüsü tip 2 (CAV2) türevi vektörler, in vitro ve in vivo hücreleri dönüştürme etkinliklerini kanıtlamıştır ve aşılama ve gen tedavisi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, yüksek titreli viral süspansiyonlara yol açan CAV2 vektörlerini oluşturmak, üretmek ve saflaştırmak için bir prosedür açıklıyoruz.

Non Replikatif Kanin adenovirüs tip 2 türetilmiş vektörler üretimi ve saflaştırılması

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Bu prosedürün genel amacı, köpek adenovirüsü tip iki türetilmiş vektörü oluşturmak, üretmek ve saflaştırmaktır. Bu, önce ilgilenilen genin bir mekik plazmidine klonlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, homolog rekombinasyon ile rekombinant bir genomik plazmit elde etmektir.Daha sonra, rekombinant kusurlu buzağı, bir trans tamamlayıcı hücre hattında üretilen ve çoğaltılan iki virüs. Son adım, elde edilen rekombinant virüsü in vivo ve in vitro olarak çeşitli uygulamalar için saflaştırmak ve konsantre etmektir. Sonuç olarak, kemirgen beyninde viral transdüksiyon örneklerini göstermek için immünofloresan konfokal mikroskopi kullanılır.Bu tekniklerin insan ad nevrozundan türetilen vektörler gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, insan popülasyonlarında buzağı ikisine karşı önceden var olan bir bağışıklığın olmamasıdır. Dolayısıyla bu yöntem, belirli beyin bölgelerinde ifade edilen proteinlerin rolünü değerlendirmek gibi aşılama veya gen terapisi alanlarındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Dolayısıyla bu prosedürü göstermek KY ve Corin Bergeron olabilir.Laboratuvarlarımızdan iki doktora sonrası araştırmacı, transfeksiyondan bir gün önce, DKE bir hücreyi altı o

production-purification-non-replicative-canine-adenovirus-type-2

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada biz sadece kullanılan diğer protokollere göre 100'den fazla kat rekombinant parvovirüs üretim verimliliğini artırır hücre enfeksiyonu, dayalı bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, parvovirüsü VP transkripsiyon ünitesi (AD-VP) ihtiva eden 5-bazlı yardımcı yeni bir adenovirüs kullanımına dayanır.

Adenovirüs kaynaklı Sistemleri Yardımı ile verimli Rekombinant Parvovirus Üretim

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Tüm viral kodlama dizilerinden yoksun yüksek kapasiteli adenoviral vektörlerin üretilmesi için bir protokol sunulmuştur. Vektör genomunda bulunan transgenlerin klonlanması, hedef güdümlü endonükleazlara dayanmaktadır. Yapışık hücreler olarak büyütülen ve süspansiyon halinde üretilen üretici hücrelerde virüs amplifikasyonu, trans halinde viral genler sağlayan yardımcı bir virüse dayanır.

İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim

Burada, biz üretmek için verimli ve tekrarlanabilir bir strateji, titresi ve adeno ilişkili virüs vektörlerin kalite kontrol toplu işlemleri açıklanmaktadır. Bir vektör hazırlık ile yüksek-titresi elde etmek kullanýcýnýn (≥1 x 1013 vektör genleri/mL) ve yüksek saflıkta, vitro veya vivo içinde kullanıma hazır.

Üretim, arıtma ve kalite kontrol için virüs tabanlı vektörel çizimler Adeno ilişkili

Burada, pAdEasy sistemini kullanarak adenovirüs üretimi için bir protokol sunuyoruz. Teknoloji, pAdTrack ve pAdEasy-1 plazmidlerinin rekombinasyonunu, adenovirüs paketleme ve amplifikasyonunu, adenoviral parçacıkların hücre lysate ve kültür ortamından arındırılmasını, viral titrasyonunu ve adenovirüsün fonksiyonel testini içerir.

Adenovirüs Üretimi İçin Verimli Bir Yöntem

Burada, hücre yığınlarında yetişen yapışan HEK 293 hücrelerini ve benzeşim kromatografisi saflaştırmayı kullanarak araştırma sınıfı AAV vektörlerinin büyük ölçekli üretimi için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bu protokol sürekli olarak &gt;1 x 1013 vektör genomları /mL verir ve büyük hayvan çalışmaları için uygun vektör miktarları sağlar.

Büyük Hayvan Modellerinde Preklinik Çalışmalar İçin Hücre Yığınlarında Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Üretimi

Bu protokolde AAV2 vektörü, süspansiyon kültüründe baculovirüs (BV)-AAV2-yeşil floresan protein (GFP) veya terapötik gen ve BV-AAV2-rep-cap enfekte Sf9 hücreleri ile Spodoptera frugiperda (Sf9) böcek hücrelerinin birlikte kült haline sokulmasıyla üretilmektedir. AAV parçacıkları deterjan kullanılarak hücrelerden salınır, netleştirilir, benzeşim kolonu kromatografisi ile saflaştırılır ve teğetsel akış filtrasyonu ile konsantre edilir.

Baculovirus-Insect Hücre Kültürü Sistemi Kullanılarak Adeno-İlişkili Virüsün (AAV)2 Vektörün Üretimi ve Saflaştırılması için Süreç Geliştirme

Burada, yüksek titreli rekombinant Newcastle hastalığı virüsünün üretimi, saflaştırılması ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bu protokol sürekli olarak &gt; 6 × 109 plak oluşturan birim / mL verir ve in vivo hayvan çalışmaları için uygun virüs miktarlarını sağlar. İn vivo güvenliği sağlamak için ek kalite kontrol testleri açıklanmaktadır.

Allantoik Sıvıdan Yüksek Titerli Rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Üretimi

Burada, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü sunulmakta olup, ticari satıcılardan araştırma amacıyla temin edilebilen bileşenleri kullanarak vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azaltılmasına neden olmaktadır.

HEK293 Süspansiyon Hücreleri Kullanılarak Yüksek Verimli Adeno İlişkili Vektör Partilerinin Üretimi

Gen terapisi alanı gelişmeye devam ettikçe, bu zorlukların üstesinden gelebilecek yenilikçi yöntemlere artan bir ihtiyaç var. Burada, in vivo çalışmalar için kalite standartlarını karşılayan, bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek verimli ve yüksek saflıkta AAV vektörleri üretme sürecini kolaylaştıran benzersiz bir yöntem sunulmaktadır.

Bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek titre, yüksek kaliteli adeno-ilişkili virüs vektörleri oluşturmak için kolaylaştırılmış ve standartlaştırılmış bir prosedür

Öğrenin CAV2 türevli vektörlerin yapımını, üretimini ve saflaştırılmasını. Bu yöntem gen tedavisi ve aşılama uygulamalarında yüksek verimli hücre transdüksiyonu sağlar.

Non Replikatif Kanin adenovirüs tip 2 türetilmiş vektörler üretimi ve saflaştırılması

Daha fazla video keşfet