Non Replikatif Kanin adenovirüs tip 2 türetilmiş vektörler üretimi ve saflaştırılması

Son 15 yılda, köpek adenovirüsü tip 2 (CAV2) türevi vektörler, in vitro ve in vivo hücreleri dönüştürme etkinliklerini kanıtlamıştır ve aşılama ve gen tedavisi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, yüksek titreli viral süspansiyonlara yol açan CAV2 vektörlerini oluşturmak, üretmek ve saflaştırmak için bir prosedür açıklıyoruz.

Bu prosedürün genel amacı, köpek adenovirüsü tip iki türetilmiş vektörü oluşturmak, üretmek ve saflaştırmaktır. Bu, önce ilgilenilen genin bir mekik plazmidine klonlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, homolog rekombinasyon ile rekombinant bir genomik plazmit elde etmektir.

Daha sonra, rekombinant kusurlu buzağı, bir trans tamamlayıcı hücre hattında üretilen ve çoğaltılan iki virüs. Son adım, elde edilen rekombinant virüsü in vivo ve in vitro olarak çeşitli uygulamalar için saflaştırmak ve konsantre etmektir. Sonuç olarak, kemirgen beyninde viral transdüksiyon örneklerini göstermek için immünofloresan konfokal mikroskopi kullanılır.

Bu tekniklerin insan ad nevrozundan türetilen vektörler gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, insan popülasyonlarında buzağı ikisine karşı önceden var olan bir bağışıklığın olmamasıdır. Dolayısıyla bu yöntem, belirli beyin bölgelerinde ifade edilen proteinlerin rolünü değerlendirmek gibi aşılama veya gen terapisi alanlarındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Dolayısıyla bu prosedürü göstermek KY ve Corin Bergeron olabilir.

Laboratuvarlarımızdan iki doktora sonrası araştırmacı, transfeksiyondan bir gün önce, DKE bir hücreyi altı oyuklu bir plaka üzerine ekleyerek, 37 santigrat derecede ve DMEM'de% 5 CO2'de% 7 ısı içeren yüksek glikoz, inaktive fetal baldır, serum sodyum, piruvat, penisilin ve streptomisin ile büyüyen hücreler yetiştirerek bu prosedüre hazırlanın. Ertesi gün, hücreler transfeksiyon için %70 ila 80 oranında birleşmiş olmalıdır, iki mikrogram pcal GOI'yi sindirin, rekombinant kav iki genomik plazmit, ASC ile bir, plazmidin viral olmayan dizisini serbest bırakmak için, elde edilen kısıtlama modelini %0.8 ile kontrol edin, Agro jel elektroforezi sindirimi, rekombinant genomu içeren yaklaşık 31 kilobaz çifti fragmanı ve plazmid omurgasına karşılık gelen iki kilobaz çifti fragmanı vermelidir. Sindirilmiş DNA'yı 200 mikrolitre jet prime tamponu ile karıştırın ve 10 saniye boyunca girdap yapın.

Dört mikrolitre jet prime ekleyin ve 10 saniye boyunca girdap yaparak karıştırın. Damlacıkları çıkarmak için kısa bir süre döndürün ve 10 dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında, transfeksiyon karışımını DKE one hücrelerinin üzerine damla damla ekleyin.

Karışımı eşit şekilde dağıtmak ve 37 santigrat derecede inkübe etmek için plakayı hafifçe sallayın. Transfeksiyondan bir hafta sonra, hücreleri ve kültür ortamını 15 mililitrelik bir polipropilen tüpte toplayın. Hücreleri üç donmuş düşünce döngüsü ile bozun.

Lizatı 1.800 kez 10 dakika santrifüjleme ile temizleyin G. Süpernatanı toplayın ve virüsü çoğaltmak için% 80 ila 90 birleşik tek tabakalı bir DKE hücresini enfekte etmek için eksi 20'de saklayın, altı oyuklu bir plakanın bir oyuğunda büyütülen bir hücre, 0.5 mililitre süpernatan içeren bir plaka. Hafif çalkalama altında bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin Bir saat sonra. Aşıyı çıkarın ve %5 Isı ile etkisiz hale getirilmiş FCS içeren 1,5 mililitre tam DMEM ile değiştirin, hücreleri üç ila dört gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Hücreler, sitopatik bir etki veya CPE'nin görünümü için günlük olarak izlenmelidir. Net bir CPE görünmüyorsa. Dört günlük kültürden sonra hücreleri toplayın ve net bir CPE hücrelerin çoğunu etkilediğinde viral amplifikasyonu tekrarlayın.

Genellikle iki ila dört viral amplifikasyon turundan sonra, kültür ortamı ile hücreleri toplayın ve daha önce gösterildiği gibi üç kez dondurun, çözün. % 80 ila 90 oranında enfekte olur. DKE, CPE tamamlandığında üç ila dört gün sonra tabak başına 1.5 mililitre virüs içeren süpernatan kullanılarak 10 santimetre çapında üç doku kültürü kabında büyütülen bir hücredir.

Bu 10 santimetre çapındaki tabaklardan hücreleri hasat edin, onları üç serbest stil döngüsüyle bozun ve lizatı 1.800 kez 10 dakika santrifüjleme ile temizleyin. G süpernatant toplayın ve büyük ölçekli Cav için eksi 20'de saklayın, ölçek büyütme prosedürüne başlamak için iki amplifikasyon, DKE'nin% 80 ila 90'ını birleşik tek katmanlarını enfekte edin, her tabak için 40 10 santimetre çapında doku kültürü kaplarında büyütülen bir hücre, FCS olmadan bir mililitre tam DMEM'de seyreltilmiş süpernatan içeren 0.1 mililitre virüs kullanın, hafif ajitasyon altında üç ila dört saat boyunca hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin. Üç ila dört saat sonra,% 5 FCS ile takviye edilmiş beş mililitre tam DMEM ekleyin ve üç gün boyunca inkübe edin.

Üç gün sonra, 50 mililitrelik polipropilen tüplerdeki 40 10 santimetrelik tabaklardan enfekte olmuş hücreleri, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1.200 kez G'de pelet hücrelerini hasat edin. Resus, bunları 15 mililitre DMEM ortamında askıya alır, hücreleri üç donma-çözülme döngüsü ile bozar. 10 dakika boyunca 1.800 kez G'de santrifüjleyerek hücre kalıntılarını çıkarın.

Viral partiküllerin saflaştırılması için viral partiküllerin saflaştırılmasından önce süpernatanı eksi 20'de saklayın. 14 mililitrelik bir UltraClear tüpte süreksiz bir sezyum klorür gradyanı hazırlayın. İlk olarak, tüpün dibine iki mililitre yüksek yoğunluklu sezyum klorür çözeltisi dökün.

Daha sonra, ilk çözeltinin üzerine yavaşça iki mililitre düşük yoğunluklu sezyum klorür çözeltisi ekleyin. Viral süpernatanı sezyum klorür gradyanının üzerine dikkatlice yükleyin. Tüpü, santrifüjlemeden sonra 130.000 kez g ve 18 santigrat derece sıcaklıkta bir saat 30 dakika boyunca sallanan bir SW 40 rotorunda üst santrifüjden iki ila üç milimetreye kadar mineral yağ ile doldurun.

İki sezyum klorür çözeltisi tabakası arasındaki arayüzde iki beyaz bant açıkça görülebilir. 21 gauge bir iğne ve yandan toplanan bir şırınga kullanarak, olgun kav iki parçacık içeren alt bandı delin. Boş viral partiküllere karşılık gelen üst bandı toplamaktan kaçınmak için mümkün olduğunca deneyin.

Kolektif viral parçacıkları bir sezyum klorür çözeltisi ile karıştırarak 14 mililitrelik şeffaf bir tüpte sürekli bir sezyum klorür gradyanı hazırlayın. Tüpü, 130.000 kez G ve 18 derecede 18 saat boyunca sallanan bir SW 40 rotorunda üst santrifüjden iki ila üç milimetreye kadar mineral yağ ile doldurun. Santrifüjlemeden sonra, daha önce gösterildiği gibi bir şırınga ile yan yana delinme içeren iki beyaz buzağıyı toplayın.

Yine, kalan üst bandı toplamaktan kaçınmaya çalışın. İki bandı daha iyi ayıran bu sürekli gradyanda bu daha kolay olmalıdır. Toplanan süspansiyonun toplam hacmi iki mililitreyi geçmemelidir.

Daha sonra bir cidex G 25 PD 10 sütununu 30 mililitre PBS ile dengeleyin. Viral süspansiyonu kolona yükleyin ve 500 mikrolitrelik PBS fraksiyonları ile elute boyunca akışı atın, genellikle tuzdan arındırılmış cav iki partikülü içeren beş ila yedi fraksiyonları toplayın. Virüs içeren fraksiyonlar, kutsanmış kokular olduğu için kolayca tanımlanabilir.

Son olarak, 1.5 mililitre CAV iki süspansiyonuna 150 mikrolitre gliserol ekleyin ve eksi 80 santigrat derecede Eloqua'da saklayın, son nokta seyreltme ile cav iki titre edin, buz üzerinde saflaştırılmış virüsün bir kısmını çözün ve serum serbest DMEM'de 10 ila eksi iki ila 10 ila eksi 12 arasında değişen on kat seri seyreltme gerçekleştirin. 96 oyuklu bir plakanın beş oyuğuna her viral seyreltmeden 50 mikrolitre ekleyin, dördüncü DKE'ye 1.5 kez 10 ekleyin, her oyuğa bir hücre ekleyin, plakayı beşinci günde beş gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Enfeksiyon sonrası mikroskobik gözlem ile CPE görünümünü izleyin.

Enfeksiyöz titreler, viral vektörlerin üretilmesinden önce okuma ve men istatistiksel yöntemi kullanılarak medyan doku kültürü enfeksiyöz dozları olarak belirlenir. Transgen için bir ekspresyon kaseti taşıyan bir rekombinant CAV iki genomu, standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak oluşturulur. İlk olarak, ilgilenilen gen, bir sitomegalovirüs erken promotörü ve yukarı ve aşağı akış rekombinasyon hedef dizilerini temsil eden iki CAV iki türetilmiş genomik dizi ile çevrili bir poliadenilasyon sinyali ile bir ekspresyon kaseti olarak bir mekik plazmidinde klonlanır.

İkinci adımda, ekspresyon kaseti, mekik plazmidinden homolog rekombinasyon ile CAV iki genomuna yerleştirilir. GOI ekspresyon kasetinin eklenmesi, rekombinant genomdaki EA'nın ve E bir B geninin bir kısmının silinmesine yol açacaktır. Rekombinant genomik plazmit elde edildikten sonra, viral partiküller, DKE bir hücreyi tamamlayan CAV iki E bir kullanılarak üretilir.

Enfekte hücrelerde üretilen büyük miktarda viral partiküllere bağlı net bir sitopatik etki, parlak alan mikroskobu veya transgen ekspresyonu ile kolayca görselleştirilebilir. Bu örnek, CAV iki vektörünü ifade eden bir GFP'dir. Taze DKE one hücreleri kullanılarak birkaç viral amplifikasyon turundan sonra, viral partiküller sezyum klorür gradyanları üzerinde ultrasantrifüjleme ile saflaştırılır.

Konsantre viral parçacıklar, sezyum gradyanı içinde iki yanardöner bant olarak görünür. Alt bant, toplanması gereken matür rekombinant kav iki'ye karşılık gelir. Üst bant, kaçınılması gereken boş, bulaşıcı olmayan parçacıklar içerirken.

Elde edilen rekombinant buzağı iki vektörü, in vitro veya in vivo olarak çok çeşitli türlerde neredeyse tüm hücre tiplerini dönüştürmek için kullanılabilir. Burada, CAV iki eksprese eden GFP'nin stereo taksi ile fare merkezi sinir sisteminin farklı bölgelerine enjekte edildiği bir uygulama örneği gösterilmektedir. Bu protokol yüksek titre ve saf, saf viral stoklar verdiğinden, dentat girus veya DG'de CAV iki vektörünü eksprese eden bir mikrolitre kadar küçük PBS seyreltilmiş GFP enjeksiyonu %40 ila 50 nöronal transdüksiyona yol açar.

Ayrıca, C 2'nin aksonlarda retrograd olarak taşınabilme özelliği nedeniyle, striatumda CAV iki vektörünü eksprese eden iki mikrolitre PBS seyreltilmiş GFP enjeksiyonu, nigro stri AAL nöronlarının yaklaşık %80'inin transdüksiyonunu sağlar, nigra pars compacta Gelişmelerden sonra. Bu teknikler, alanlardaki veya aşı bilimi veya sinirbilim alanlarındaki araştırmacıların, birçok farklı hayvan modelinde beyindeki yeni antijenleri ve gen fonksiyonlarını keşfetmelerinin yolunu açmaktadır. Bu nedenle, CAF iki türetilmiş vektörle çalışmanın son derece tehlikeli ve tehlikeli olabileceğini unutmayın, örneğin kişisel koruyucu ekipman ve BSL'deki laminer akış davlumbazlarında çalışma dahil olmak üzere uygun muhafaza ve atık işleme önlemleri gibi iki laboratuvar bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman alınmalıdır.