Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, proteinlerdeki doğrulayıcı esnekliği ve çevre, ligand bağlanması veya protein proteini etkileşimlerine yanıt olarak bunların değişikliklerini analiz etmektir. Bu, ligand bağlanması gibi proteinin onaylanmasını etkilediğinden şüphelenilen farklı koşullar altında ilgilenilen proteinin önceden inkübe edilmesiyle elde edilir. Reaksiyon karışımı daha sonra döteryum oksit içinde seyreltilir, farklı zaman aralıkları için inkübe edilir ve daha sonra peptit omurgasına deutero dahil olma derecesini belirlemek için sıvı kromatografi kütle spektrometresi ile analiz edilir.

Amid grupları, korunan alanlar deuterosun dahil edilmesini azalttığı için, deneyin peptit spektrumlarını bir bağlayıcı partnerin yokluğunda ve varlığında karşılaştırmak, proton ve döteron arasındaki ağırlık farkına bağlı olarak spektrumların OID'sinde bir kayma olduğunu ortaya koymaktadır. Bağlayıcı bir ortağın eklenmesinden sonra belirgin koruma sergileyen bölgeler, potansiyel bağlama bölgeleridir. Dizi kapsamına ve örtüşen peptitlerin mevcudiyetine bağlı olarak, bağlanma bölgeleri birkaç amino aside kadar daraltılabilir.

Bu yöntem, proteinlerin nasıl katlandığı, nasıl açıldığı, sıcaklık artışı veya ağır metaller gibi fiziksel ve kimyasal etkilere nasıl tepki verdikleri gibi protein katlanması ve protein dinamiği alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Benzetilmiş bağlanma ve protein-protein etkileşimlerinin bir proteinin onaylanmasını nasıl etkileyebileceği. Protein ilaçlarının geliştirilmesi, uygun katlamanın doğrulanması ve genel kalite kontrolü için de çok önemlidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler çeşitli zorluklarla karşılaşabilir. Örneğin protein, pepsin tarafından iyi sindirilmezse, dizi kapsamı düşük olacaktır. Protein agregasyona çok yatkınsa, inkübasyon sırasında veya söndürme tamponu eklendikten sonra toplanabilir ve kütle spektrometresinde düşük sinyal yoğunluklarına neden olur.

Bu gösteride, hidrojen değişim kütle spektrometresi kullanılarak maya moleküler şaperonu, HP 90'ın cos şaperonu Sty one'a bağlanmasını araştıracağız, STY biri HP 90'a bağlanır ve HB doksanın ABA aktivitesinin inhibisyonu ile istemci bağlanmasını kolaylaştırır. Bu prosedüre, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi tamponların, numunelerin ve boncukların hazırlanmasıyla başlayın. Kolonları amid hidrojen değişimine hazırlamak için, koruma kolonunun bir tarafını sökün ve filtreyi sıkıca çıkarın.

Salmastra hunisini kolonun açık ucuna vidalayın. Kolonun alt çıkışına beş mililitrelik boş bir şırınga takmak için 16. inçlik bir adaptör kullanın. Koruma kolonuna gaz geçirmez şekilde sabitlediğinizden emin olun.

Huninin üstüne birkaç damla bulamaç boncuk malzemesi sürün. Bulamacı huniden koruma kolonuna aspire etmek için şırınganın pistonunu çekin. Huni üzerine daha fazla bulamaç boncuk malzemesi uygulayın ve koruma sütunu tamamen boncuk malzemesi ile dolana kadar işleme devam edin.

Ardından, filtreyi ve filtre halkasını açık uca sıkıca yerleştirmeden önce huniyi çıkarın. Kolon kapağını koruma kolonuna vidalayın ve şırıngayı diğer taraftan çıkarın. Koruma kolonlarının her iki ucunu tapalarla kapatın.

Hidrojen değişimi kütle spektrometresi için sistemi kurmak üzere kolon malzemesinin kurumasını önlemek için. Önce tuzak kolonunu yüksek performanslı sıvı kromatografisine veya HPLC sistemine bağlayın. A pompasının akış hızını çözücü olarak %0.4 formik asit ile dakikada 0.1 mililitreye ayarlayarak sütunu dengeleyin.

Kütle spektrometresini kalibre ettikten sonra, HPLC'nin çıkışını kütle spektrometresinin kaynağına bağlayın. Peptik peptitleri belirlemek için önce Pepin kolonunu ve ardından analitik kolonunu sisteme bağlayın. Gradyan tipini ve kütle spektrometresi yöntemini seçerek kontrol yazılımında kromatografi ve kütle spektrometresi parametrelerini ayarlayın.

İyi bir kromatografik çözünürlük sağlamak için uzun bir gradyan seçin. Kütle spektrometresinde tandem kütle spektrumlarını etkinleştirin. 100 mikrolitre H iki L tamponunda 100 ila 200 pomo ısı şoku proteini 90 veya HSP 90 hazırlayın.

100 mikrolitre söndürme tamponu ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. 200 mikrolitre numuneyi bir Hamilton şırınga ile enjeksiyon valfinin enjeksiyon portuna enjekte edin. Enjeksiyon valfini enjeksiyon konumuna getirin ve kromatografi programını başlatın.

Daha sonra, elde edilen peptitler için bir veri tabanı arayarak ısı şoku proteini 90'ın peptik peptitlerini tanımlayın. Buzlu su ekleyerek sistem sıcaklığını sıfır santigrat dereceye düşürün. Bu adımı tandem kütle spektrometresi olmadan ve gerçek hidrojen değişimi deneyi için kullanılacak gradyan ile tekrarlayın.

Isı şoku proteini 90 ve STI one için, %90 çözücü, %10 çözücü B'den %45 çözücü, %55 çözücü B'den 10 dakikalık bir gradyan kullanın, kullanılan gradyanda tanımlanan peptik peptitlerin tutma sürelerini belirleyin ve peptit dizisi, peptit yükü, durum ve alıkonma süresini içeren bir liste oluşturun. Bu, hidrojen değişim deneylerinden sonra her bir peptidi tanımlamak için kullanılacaktır. Protein protein etkileşim arayüzlerini tanımlamak için önce gradyan ve kütle spektrometresi yöntemini ayarlayın.

Kontrol yazılımında, %90 çözücü, %10 çözücü B'den %45 çözücüye kadar 10 dakikalık doğrusal bir gradyan kullanın. % 55'lik bir çözücü B yükü, peptitlerin çoğu 1000 kütle / şarj oranının altında olmasına rağmen, 300 ila 1.500 kütle / şarj oranları arasında algılama için optimize edilmiş bir kütle spektrometresi yöntemidir. Enjeksiyon valfini yük konumuna ve altı valfe ayarlayın.

Yükleme tuz giderme konumunda, yükleme pompasının akış hızını dakikada 0,4 mililitre olarak ayarlayın. Değiştirilmemiş referansı ve metin protokolünde açıklandığı gibi% 100 kontrol örneğini çalıştırdıktan sonra, bir ila beş mikrolitrelik bir hacimde 20 ila 100 piko mol ısı şoku proteini 90 hazırlayın. Numune hacmini 100 mikrolitreye çıkarmak için sıcaklığa göre ayarlanmış döteryum oksit tamponu ekleyin, metin protokolünde açıklandığı gibi daha önce tanımlanan tam süre boyunca inkübe edin.

Dinamik değişim aralığını belirlerken, 100 mikrolitre buz gibi soğuk ekleyin, tamponu söndürün ve iki kez hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyin, 200 mikrolitreyi HPLC'nin enjeksiyon valfine enjekte edin. Enjeksiyon valfini enjeksiyon konumuna getirin ve hemen kromatografi programını başlatın. İki dakika sonra, altı valfi tuzdan arındırma yükleme konumundan elute konumuna getirin.

Etkileşen proteinin yokluğunda her bir peptide döteron katılımını belirlemek için bunu her bir protein için ayrı ayrı yapın, etkileşimi belirlemek için yüzey karışımı ısı şoku proteini 90, dengeyi bağlı duruma kaydırmak için en az iki kat fazla STI ile birlikte, karmaşık oluşum dengede olana kadar istenen sıcaklığı inkübe edin. İnkübasyonun ardından, numune hacmini 100 mikrolitreye çıkarmak için sıcaklığa ayarlanmış döteryum oksit tamponu ekleyin ve tam olarak tanımlanmış bir süre boyunca inkübe edin. Daha sonra 100 mikrolitre buz gibi soğuk söndürme tamponu ekleyin ve iki kez yukarı ve aşağı pipetleyin, hızlı bir şekilde proteini enjekte edin ve eskisi gibi çalıştırın.

Elde edilen verileri uygun yazılımla analiz edin ve analizdeki her bir peptidi bulmak için belirlenen saklama sürelerini kullanın. Değişmemiş protein için izotop dağılımının OID'sini hesaplayın ve hidrojen değişim deneyleri için, hedef proteinin döterlerinin tek başına ve fazla bağlayıcı partner ile dahil edilmesini karşılaştırın. Bu, ticari yazılımla otomatik olarak veya elektronik tablo programı M ile manuel olarak yapılabilir, HS P 90 ve STI arasındaki doğrudan protein protein etkileşimi, döteryum oksit etiketlemesini takiben HS P 90'ın yokluğunda ve varlığında STI bir peptit spektrumu karşılaştırılarak test edildi.

Ortaya çıkan fark grafiği, çoğunlukla TPR iki A ve TPR iki B'deki peptitlerin HS P 90 varlığında güçlü bir koruma gösterdiğini ortaya koymaktadır, bu da bu bölgelerin HS P 90 ile etkileşime girdiğini göstermektedir. TPR iki A'daki koruma, DEUTERO katılımından korunan amiloid protonlarının sayısına göre renklendirilen bir HS P 90 peptidi ile kompleks halinde STY bir TPR iki A TPR iki B'nin kristal yapısından kolayca rasyonelleştirilebilir. Protein protein etkileşimlerinde bu kadar net bir koruma her zaman gözlenmez.

CYBE bir varlığında HSP 90'daki koruma, CYBE bir kadar belirgin değildir ve lokalize değildir. Tüm peptitler, deutero birleşmesine karşı biraz daha fazla koruma gösterir. Burada gösterilen, döteron birleşmesinden korunan amli protonlarının sayısına göre renklendirilmiş maya HS P 90'ın bir karikatür temsilidir, STY, proteinin hiçbir bölgesi varlığında daha fazla esneklik göstermediği için HS P 90'ı küresel olarak stabilize eder.

Bu indirgenmiş döteron birleşmesinin, arpacık ile doğrudan etkileşimden mi yoksa allosterik etkilerden mi kaynaklandığı açık değildir. HSP 90 sürekli etiketlemesinin doğrulanması üzerine, farklı protein bölgelerinin dinamiklerini incelemek için hidrojen değişimi, kütle spektrometresi kullanıldı. Burada, HSP 90'ın nükleotid bağlanma alanından peptit 43 ila 62'nin spektrumları gösterilmektedir.

STI birinin varlığında ve yokluğunda, peptit spektrumları, daha uzun inkübasyon ile artan zamana bağlı bir döteryum dahil edildiğini gösterir. Koruma derecesi, kuluçka süresi boyunca değişir, daha kısa kuluçka sürelerinde daha büyük fark ve en uzun zaman noktasında hemen hemen benzer döviz kurları gösterir. Bu, daha düşük bir stabilizasyon derecesi veya sık ayrışma ve birleşme ile dinamik etkileşimler bölgesi olduğunu gösterir.

Bu prosedürü denerken, değişim reaksiyonuna başlamadan önce koşulları titizlikle sabit tutmayı ve her şeyin hazır olmasını unutmamak önemlidir. Bu Prosedürü takiben, protein komplekslerindeki etkileşim bölgelerinin konumu gibi ek soruları yanıtlamak için başka yöntemler de kullanılabilir.