Name: Caenorhabditis elegansın Çok Hücreli Bir Organizmada Protein Homeostazını İncelemek için Model Sistem Olarak Kullanılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Keşfedin Caenorhabditis elegans kullanarak protein homeostazı, stres ve yaşlanma arasındaki ilişkiyi. Davranışsal fenotipler, immünofloresan mikroskopi ve Western blot analizi ile protein katlanma bozukluklarını izleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmada kullanılan tüm nematod suşları, NIH Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi (NCRR) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlanmıştır. H.F. Epstein tarafından geliştirilen monoklonal antikorlar, NICHD himayesinde geliştirilen ve Iowa Üniversitesi Biyoloji Bölümü tarafından sürdürülen Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası'ndan elde edildi. N. Shemesh, Fay ve Bert Harbour ödülü ile desteklendi. A.B.-Z. İsrail Yüksek Öğrenim Konseyi Alon Bursu, Marie Curie Uluslararası Yeniden Entegrasyon hibesi ve İki Uluslu Bilim Vakfı ve İsrail Bilim Vakfı'ndan (Hibe No. 91/11) alınan hibelerle desteklenmiştir.

Canlı bir organizmada protein katlanmasını izlemek için davranışsal tahliller kullanma
1. Davranışsal Tahliller için Hayvanları Senkronize Etme
<ol>
	<li>C. elegans36'nın bakımı için ortam ve tabak hazırlama, yiyecek hazırlama ve hayvan büyüme koşulları dahil olmak üzere standart yöntemleri izleyin. Sıcaklık (15-25 °C), popülasyon büyüklüğü ve gıda mevcudiyeti dahil olmak üzere yetiştirme koşullarını dikkatlice kontrol edin. Bakteri veya mantar kontaminasyonu gösteren herhangi bir plakayı atın.</li>
	<li>15-30 embriyo toplayın, bunları yeni plakalara aktarın ve deney süresince istenen sıcaklıkta (15-25 ° C) büyütün. Alternatif olarak, 10-20 gravid yetişkini bir tabağa koyun, 30-60 dakika yumurta bırakmalarına izin verin ve ardından tabaktan çıkarın. Hem embriyoların doğrudan toplanması hem de gravid yetişkinlerin ayarlanması yaşlarda bir miktar değişkenlik sağlayacaktır (±6 saat). Bu değişkenliği azaltmak için, embriyoları ya belirli bir aşamada, örneğin virgül aşamasında toplayın ya da yumurtlamaya yeni başlayan 10-20 yetişkin ayarlayın (yetişkinliğin 2. günü). Bu tedavinin stresli olduğu ve proteostazı etkileyebileceği göz önüne alındığında, mümkün olduğunca ağartma ile senkronizasyondan kaçının.</li>
	<li>Senkronize hayvanları seçin, puanlama için bir tahlil plakasına aktarın ve ardından atın.</li>
</ol>
2. Hareket Deneyi
Senkronize hayvanları seçin ve hareket puanlaması için istenen sıcaklıkta (15-25 °C) temiz bir plakaya aktarın. Her biyolojik kopya için >20 hayvan puanlayın ve deney koşulu başına en az 3 kez testi tekrarlayın. İki bağımsız deneysel koşulu karşılaştırmak için Wilcoxon Mann-Whitney sıra toplamı testini kullanın.
<ol>
	<li>Hafif hareket bozukluğunu test etmek için, 5-7 hayvanı temiz bir bakteri çiminin ortasına yerleştirin ve hayvanların plaka üzerinde 2 dakika hareket etmesine izin verin. Bu zaman aralığı, vahşi tip hayvanların %90'ının 1 cm'lik bir daireyi temizlemek için geçen süreye göre belirlendi.</li>
	<li>1 cm'lik bir daireyi temizlemeyen (örneğin, yerleştirildikleri noktadan itibaren 1 cm'lik bir yarıçap içinde kalan) hayvanların sayısını 2 dakika içinde koordinesiz olarak sayın.</li>
	<li>Ciddi hareket bozukluğunu test etmek için hayvanları temiz bir bakteri çimine koyun.</li>
	<li>Sıfır zamanında birkaç hayvanı fotoğraflayın (t = 0) ve 5 dakika sonra tekrar (t = 5). 5 dakika sonra bir vücut uzunluğunu hareket ettirmeyen hayvanları felçli olarak puanlayın.</li>
</ol>
3. Termo direnç
<ol>
	<li>>20 senkronize hayvanı seçin ve 450 μl Isı Şoku (HS) tamponu içeren 24 oyuklu bir plakaya aktarın (Tablo 1). Her biyolojik kopya için >20 hayvan puanlayın ve deney koşulu başına en az 4 kez testi tekrarlayın.</li>
	<li>24 oyuklu plakayı ısıtılmış bir banyoya aktarın. HS sıcaklığı ve süresi, büyüme koşullarına, özellikle de yetiştirme sıcaklığına büyük ölçüde bağlıdır.</li>
	<li>HS tamponunu 9 μl SYTOX orange ile destekleyin.</li>
	<li>TXR filtreli bir floresan stereoskop kullanarak boya alımını izleyerek hayvanların hayatta kalmasını puanlayın. Boyayı alan hayvanlar öldü. İki bağımsız deneysel koşulu karşılaştırmak için Wilcoxon Mann-Whitney sıra toplamı testini kullanın.</li>
</ol>
Belirli hücrelerde protein katlanmasını izlemek için immünoboyama ve etiketli proteinlerin kullanılması
4. İmmün boyama ile proteinlerin lokalizasyonunu izleyin
<ol>
	<li>Gerekli aşamada, en az 30 hayvanı M9 tamponu36 içeren bir Eppendorf tüpüne aktarın.</li>
	<li>Kısa, düşük hızlı bir santrifüj adımı (3.000 rpm / 900 x g, 2 dakika) gerçekleştirerek ve yeniden askıya alarak hayvanları M9 tamponu ile birkaç kez yıkayın.</li>
	<li>Tüpleri soğuması için birkaç dakika buzun üzerine koyun.</li>
	<li>Fazla sıvıyı çıkarın ve 500 μl buz gibi %4 paraformaldehit solüsyonu ile inkübe edin (Tablo 2). Kuluçka süresi, incelenen her protein için kalibre edilmeli ve oda sıcaklığında yaklaşık 5-30 dakika olmalıdır. 4 °C'de uzun süreli inkübasyon da yapılabilir, ancak bu numune geçirgenliğini bozabilir.</li>
	<li>Sabit hayvanları santrifüjleme (3.000 rpm, 1-2 dakika) ile PBS-Tween (pH 7.2) tamponu ile 3 kez yıkayın. Hayvanlar bu aşamada 4 °C'de birkaç hafta saklanabilir.</li>
	<li>Hayvanları santrifüjleme ile toplayın (3.000 rpm, 1-2 dakika).</li>
	<li>Davlumbazda, süpernatantın çoğunu çıkarın ve peleti 1 ml β-merkaptoetanol (β-ME) çözeltisi içinde yeniden süspanse edin (Tablo 2).</li>
	Gece <li>boyunca 37 °C'de bir nutatör üzerinde hafifçe sallayarak inkübe edin.</li>
	<li>Davlumbazda hayvanları 3 kez PBS-Tween (pH 7.2) tamponu ile yıkayın.</li>
	<li>Hayvanları 50-100 μl PBS-Tween (pH 7.2) içinde tekrar süspanse edin. Hayvanlar bu aşamada 4 °C'de birkaç hafta saklanabilir.</li>
	<li>Hayvanları santrifüjleme (3.000 rpm, 1-2 dakika) ile toplayın ve PBS-Tween tamponunun çoğunu çıkarın.</li>
	<li>Her tüpe 100-150 μl kollajenaz çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de güçlü çalkalama ile inkübe edin (bir Termo-karıştırıcı veya çalkalama inkübatörü kullanarak).</li>
	<li>Hayvanları sık sık stereomikroskop altında, 5 dakikalık kuluçka süresinden sonra başlayarak inceleyin. Hayvanların% 20'si kırıldığında, tüpü buzun üzerine yerleştirerek reaksiyonu durdurun. Bu adım son derece hassastır! Tedavi süresi fiksasyon koşullarına bağlıdır ve suşlar arasında büyük farklılıklar gösterebilir. Uzun süreli bir kuluçka, hayvanların tamamen bozulmasına neden olabilir. Kullanılan her enzim partisi için koşullar kalibre edilmeli ve bozunma dikkatle izlenmelidir.</li>
	<li>Hayvanları PBS-Tween'de (pH 7.2) iki kez yıkayın ve ardından santrifüjleme (3.000 rpm, 1-2 dakika) ile toplayın ve PBS-Tween tamponunun çoğunu çıkarın.</li>
	<li>1 ml AbA çözeltisi ekleyin (Tablo 2) ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca hafifçe sallanarak inkübe edin. Hayvanlar bu aşamada 4 °C'de birkaç hafta saklanabilir.</li>
	<li>Hayvanları santrifüjleme (3.000 rpm, 1-2 dakika) ile toplayın ve 200 μl AbA'da yeniden süspanse edin.</li>
	<li>AbA çözeltisinde 1: 100-1: 1.000'e seyreltilmiş birincil antikoru ekleyin ve hafif sallanma ile inkübe edin. İnkübasyonun sıcaklığı ve süresi antikorlar arasında değişebilir ve incelenen her protein için kalibre edilmelidir. Oda sıcaklığında bir gece inkübasyon ile başlıyoruz.</li>
	<li>Hayvanları santrifüjleme ile yıkayın (3.000 rpm, 1-2 dakika).</li>
	<li>AbA tamponu (1 ml) ekleyin ve oda sıcaklığında 15-60 dakika hafifçe karıştırarak inkübe edin. Hayvanlar bu aşamada 4 °C'de birkaç hafta saklanabilir.</li>
	<li>İsteğe bağlı: Numune ayrıca floresan boyalarla da boyanabilir. Bunu yapmak için, boyayı (ör. DAPI (2 mg / ml) veya Phalloidin (1:100)) 200 μl AbA'ya ekleyin ve 1 saate kadar hafifçe sallayarak inkübe edin. Bu adım, ikincil antikorun yıkanması için adımlardan biri sırasında gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>4.18-4.19 adımlarını tekrarlayarak hayvanları 3 kez yıkayın.</li>
	<li>1:100 oranında seyreltilmiş uygun floresan etiketli ikincil antikor ile 100 μl AbA ekleyin.</li>
	<li>Numuneleri kapalı tutun (veya karanlık bir tüpte) ve oda sıcaklığında birkaç saat sallanarak inkübe edin.</li>
	<li>Hayvanları AbA tamponunda (1 ml) oda sıcaklığında 15-60 dakika hafifçe karıştırarak inkübe ederek 3 kez yıkayın ve ardından santrifüjleyin (3.000 rpm, 1-2 dakika). Hayvanlar bu aşamada 4 °C'de birkaç hafta saklanabilir.</li>
	<li>Hayvanları slaytlara monte etmek için, tüm sıvıyı çıkarın ve aynı tamponun 10 μl'sinde yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hayvanların sırıklaşmasını önlemek için pipet ucunun ucunu kesin ve numunenin 1-2 μl'sini bir lam üzerine aktarın.</li>
	<li>Montaj ortamını 1:1 oranında ekleyin.</li>
	<li>Slaytı bir lamel ile nazikçe kapatın ve oje ile kapatın. Slayt hemen izlenmezse, slaytlar -20 °C'de uzun süre saklanabilir.</li>
</ol>
5. Etiketli proteinlerin lokalizasyonunu izleyin
<ol>
	<li>Gerekli aşamada, en az 15 hayvanı bir slayt üzerinde 10 ml'lik bir M9 tamponuna toplayın.</li>
	<li>Bir "solucan penası" kullanarak, hayvanları 10 ml'lik bir damla paraformaldehit çözeltisine (% 4) taşıyın (Tablo 2) ve tüm hayvanlar hareket etmeyi bırakana kadar bekleyin (yaklaşık 5 dakika).</li>
	<li>Bir "solucan penası" kullanarak, hayvanları 2 ml'lik bir damla M9 tamponuna ve montaj ortamına (1: 1) taşıyın (Tablo 2).</li>
	<li>Hayvanları nazikçe bir lamel ile örtün ve oje ile kapatın.</li>
</ol>
Protein katlanmasını ve stabilitesini izlemek için ex vivo tahlillerin kullanılması
6. Kısmi Sindirim
<ol>
	<li>Hayvanları bir mikrofüj tüpünde 1-2 ml M9 tamponu kullanarak 15 plakadan (60 mm) yıkayın. Hayvanların kalabalık olmaması ve deney süresince yeterli yiyeceğin bulunması gerektiğini lütfen unutmayın.</li>
	<li>Hayvanları santrifüjleyerek (3.000 rpm, 2 dakika) M9 tamponu ile birkaç kez yıkayın ve hayvanları yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Son dönüşten sonra, hayvanları 100 μl M9 tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Sıvı N2 içinde flaş dondurma. Numuneler -80 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>Soğutulmuş bir havaneli ve motorlu matkap (elde tutulan bir doku kültürü matkabı da kullanılabilir) kullanarak numuneyi öğütün. Numuneyi buz üzerinde tutun ve aşırı ısınmayı önleyin.</li>
	<li>Öğütmenin tamamlanıp tamamlanmadığını belirlemek için hayvanları sık sık stereomikroskop altında inceleyin. Sağlam hayvanlar kalırsa, işlemi tekrarlayın.</li>
	<li>Solucan ekstraktını pipetleyerek hacmi tahmin edin.</li>
	<li>1: 1 oranında (2x) solucan lizis çözeltisi ekleyin (Tablo 3). Herhangi bir proteaz inhibitörü kullanmayın.</li>
	<li>15 dakika buz üzerinde inkübe edin.</li>
	<li>Önceden soğutulmuş bir santrifüjde (4 °C) santrifüjleme (2 dakika boyunca 1.000 x g) ile kalıntıları temizleyin.</li>
	<li>Süpernatanı temiz bir mikrofüj tüpüne aktarın. Numuneler doğrudan kullanılabilir veya -80 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>Kimotripsin çözeltisini hazırlayın (Tablo 3) ve kullanana kadar buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Bradford testini kullanarak toplam protein konsantrasyonunu belirleyin.</li>
	<li>Gerekirse numuneyi, toplam protein konsantrasyonu 3-3.5 mg / ml olacak şekilde seyreltin.</li>
	<li>Toplam protein lizatına (1: 1.200) kimotripsin çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>İnkübasyon süresini belirlemek için, numuneyi 60 dakika boyunca kimotripsin ile inkübe edin. Farklı zaman noktalarında (örn. 0, 5, 20, 40 ve 60 dakika) numuneden 20 μl alikot çıkarın, hemen SDS numune tamponu ile karıştırın ve 96 ° C'de 5 dakika kaynatın. * Alternatif olarak, numuneyi farklı konsantrasyonlarda kimotripsin ile inkübe edin ve SDS numune tamponu ekleyerek ve 5 dakika kaynatarak belirli bir süre sonra reaksiyonu durdurun 96 °C'de.</li>
	<li>Numuneleri bir SDS-PAGE jeli üzerinde çalıştırın.</li>
	<li>Proteinin nispi stabilitesini belirlemek için uygun antikorlar kullanarak western blot analizi yapın.</li>
	<li>Numuneler arasında önemli değişiklik gösteren en uygun koşulları (kimotripsin konsantrasyonu ve sindirim süresi) belirleyin ve bu koşulları gelecekteki deneyler için kullanın.</li>
	<li>NIH görüntü jel modülü gibi dansitometri yazılımını kullanarak farklı sindirim ürünlerinin (daha düşük moleküler ağırlıklı fragmanlar) yoğunluğunu belirleyin.</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Hücresel proteostaz kapasitesinin probları, katlama ortamındaki değişikliklere karşı oldukça hassas olmalı ve protein katlama kalite kontrol yeteneklerinin gerçek zamanlı değerlendirmesini sağlamak için kolayca izlenebilmelidir. Proteostaz kapasitesinin probları olarak yarı kararlı proteinleri kullanarak fenotip, hücre altı protein lokalizasyonu ve protein konformasyonundaki değişiklikleri izledik. Burada sunulan protokoller, hareketlilik, kas filamenti organizasyonu ve miyozin stabilitesi dahil olmak üzere kas proteini ...

mRNA transkripsiyonu, işleme ve translasyonun yanı sıra protein katlanması, translokasyonu ve montaj/demontaj gibi protein biyosentezinin çeşitli adımlarının etkileşimi, işlevleri için hücresel protein kalite kontrol makinelerine bağlı olan yarı kararlı proteinlerin yükünü belirler1. Bu nedenle, protein kalite kontrol makinelerinin yokluğu veya arızalanması, çeşitli hücresel makine türlerinin işlevsel olarak azalmasına ve protein yanlış katlanma hastalıklarının2-7 başlamasına neden olabilir. Protein katlama ve temizleme makinelerinin kapasitesi, yarı kararlı proteinlerin yükü ile dengelendiğinde, protein homeostazı (proteostaz) elde edilir, bu da sonuçta yanlış katlanmış proteinlerin birikmesini ve hücreler içinde toplanmayı önleyen bir durumdur6. Yanlış katlanmış proteinlerin birikiminin, ısı şoku faktörü (HSF-1) gibi strese bağlı transkripsiyon faktörlerini aktive eden ve sito-koruyucu stres tepkilerinin6,8 aktivasyonu ile sonuçlanan sinyal olduğu düşünülmektedir.
Metazoanlardaki proteostaz ağlarının işlevlerine ilişkin anlayışımız çoğunlukla in vitro sulandırma çalışmalarından ve doku kültürü hücreleri ve tek hücreli organizmalarla yapılan gözlemlerdentüretilmiştir 9. Örneğin, protein hasarını önleyen ve çözen moleküler şaperonlar üzerine yapılan araştırmalar, şaperon aracılı protein katlanması, ayrışması ve translokasyon10-13 mekanizmalarının biyokimyasal ve hücre biyolojik çalışmalarına odaklanmıştır. Buna karşılık, "normal" büyüme koşulları altında ve strese yanıt olarak metazoanların farklı hücre ve dokularındaki çeşitli proteostaz bileşenlerinin entegre işlevi hakkında yalnızca sınırlı bilgi mevcuttur11. C. elegans'ta, hücresel protein kalite kontrolünün, sıcaklığı algılayan iki nörondaki mutasyonların ısı şoku tepkisinin aktivasyonunu engelleyebileceğini ve termotoleransı azaltabileceğini gösteren deneylerde yansıtıldığı gibi, hücre özerk olmayan bir şekilde de düzenlenebileceğinin keşfi, çok hücreli organizmada proteostaz regülasyonunun incelenmesi ihtiyacını göstermiştir14-17. Bununla birlikte, eksik olan şey, çeşitli moleküler şaperon aileleri gibi proteostaz ağlarının sağlam bir metazoanın dokularında nasıl işlev gördüğüne ve bu ağların gelişim ve yaşlanma sırasında ne kadar dinamik olduğuna dair uyumlu bir resimdir. Bu amaca ulaşmak için, çok hücreli bir organizmadaki farklı hücrelerin gelişim ve yaşlanma sürecinde proteostatik kapasitesini belirlemek için canlı hayvanlarda proteom bakımını izlemek için güvenilir sensörlere ihtiyaç vardır.
Belirli bir proteinin hücresel proteostaz sensörü olarak işlev görmesi için, hücredeki ilgisiz proteinlerin katlanmasına yalnızca minimum düzeyde müdahale ederken, hücresel katlanma ortamındaki değişikliklere yanıt vermesi gerekir. Canlı bir organizmada hücresel proteostazın sürdürülmesini ve geri kazanılmasını araştırmak için, katlanma sensörlerine bağlı iki tamamlayıcı yaklaşım benimsenebilir. Birincisi, ateşböceği lusiferaz18-20 veya bir degron21-24 ile etiketlenmiş GFP gibi proteostaz makinelerine bağlı olduğu bilinen deneysel olarak tanımlanmış yarı kararlı proteinlere dayanan tasarlanmış katlama sensörlerine dayanır. İkinci yaklaşımda, hücresel ortamdaki artımlı değişikliklere yanıt veren sıcaklığa duyarlı (ts) veya yaşa bağlı agregasyon proteinleri gibi endojen yarı kararlı proteinler izlenir25-27. Tasarlanmış katlama sensörleri temel bir biyolojik işleve hizmet etmez, ancak GFP etiketli proteinler gibi güçlü raporlama tahlilleri ile tespit edilebilir olma avantajını sunar ve birçok farklı hücresel ve hayvan modelinde kullanılabilir18. Bununla birlikte, tek bir yabancı proteinin eklenmesi katlanma ortamını27 etkileyebileceğinden, bu tür polipeptitler hücresel proteostaz mekanizmasını aşırı yükleyebilir. Alternatif olarak, rapor verdikleri hücreye özgü olmayan tasarlanmış katlama sensörleri, hücrenin proteostaz kapasitesindeki değişikliklerden etkilenmeyebilir. Örneğin, bir GFP etiketli proteazom raportör substratı, bir fenotip tespit edilmeden önce proteazomun ~%90'ının inhibe edilmesini gerektiriyordu23. Buna karşılık, hücrenin proteostaz makinelerine dayanan endojen yarı kararlı proteinler, hücresel duyarlılık aralığında olma avantajını sunar. Bununla birlikte, bu tür proteinlerin yanlış katlanmasıyla ilişkili fonksiyon kaybı, hücresel fonksiyonu ve organizma canlılığını da etkileyebilir. Burada, endojen C. elegans katlama sensörlerinin kullanımına odaklanacağız.
C. elegans, hem gelişim hem de yaşlanma çalışmaları için birçok korunmuş biyolojik yolu kullanan ve hücre biyolojisi, biyokimyasal ve genetik yaklaşımların bir kombinasyonunu kullanarak hücredeki protein katlanmasını takip etmek için kullanılabilen iyi kurulmuş bir metazoan modelidir. Yarı kararlı proteinleri, fenotiplerindeki, lokalizasyonlarındaki ve stabilitelerindeki değişiklikleri izleyerek proteostatik kapasite probları olarak kullandık. Ayrıca, çeşitli protein fonksiyonları, basit davranışsal analizlerle incelenebilir. Benzer şekilde, proteinlerin önemli ölçüde yanlış lokalizasyonu, hücresel protein kalite kontrol ağları hücresel taleplere uyum sağlayamadığında ortaya çıkar. Proteinler, floresan etiketli proteinler kullanılarak veya immün boyama yoluyla canlı hayvanların hücrelerinde kolayca görselleştirilebilir. Son olarak, ex vivo yöntemler kullanılarak, protein ekspresyonunu ve stabilitesini izlemek mümkündür. Bu, davranışsal ve fizyolojik değişikliklerin hızlı ve basit bir şekilde taranmasına izin verirken, protein lokalizasyonu ve stabilitesinin derinlemesine analizi ile birleştiğinde proteostaz değiştiricilerinin izlenmesine olanak tanır. Bu farklı yöntemleri birleştirerek, bir hücrenin protein katlama ortamının geniş bir görünümü elde edilebilir. Gerçekten de, bu strateji C. elegans, maya, doku kültürü ve bakterilerde proteostaz bozulmasını izlemek için başarıyla kullanılmıştır15,25-35.

<table><tbody><tr><td>Antikor staning ve fiakstion</td><td>paraformaldehit</td><td>Merc</td><td>8187151000</td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz</td><td>Sigma</td><td>C5138-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merc</td><td>8034560100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -ME</td><td>Sigma</td><td>8057400250</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Di Cam</td><td>000-40-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Kısmi sindirim&nbsp;</td><td>Chymotrypsin</td><td>Sigma</td><td>C4129-250MG</td></tr><tr><td>Termo-direnç</td><td>SYTOX Turuncu</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Amaresco</td><td>0433-250G</td><td></td></tr><tr><td>EKİPMAN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M165 FC floresan stereoskop</td><td>Leica</td><td></td><td>TXR filtresi</td></tr><tr><td>EXi Mavi Floresan Mikroskopi Kamerası</td><td>QImaging</td><td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>ConfoCor 3/510 META konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pelet tokmakları</td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Pelet Havaneli Akülü Motor</td><td>Kontes</td><td>K749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17 Mikrosantrifüj Serisi</td><td>Termo</td><td>75002455</td><td>Soğutmalı, , 230 V 50/60 Hz, ClickSeal Biyomuhafaza Kapaklı 24x 1.5/2.0 ml rotor içerir</td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans'ın Çok hücreli bir organizmada protein homeostazını İncelemek için model sistem olarak kullanılması

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Proteinlerin katlanması ve birleştirilmesi, protein fonksiyonu, hücrenin uzun vadeli sağlığı ve organizmanın uzun ömürlülüğü için gereklidir. Tarihsel olarak, protein katlanmasının işlevi ve düzenlenmesi in vitro, izole doku kültürü hücrelerinde ve tek hücreli organizmalarda incelenmiştir. Son çalışmalar, protein homeostazı (proteostaz), metabolizma, gelişim, yaşlanma ve sıcaklık algılama arasındaki bağlantıları ortaya çıkarmıştır. Bu bulgular, metazoan organizma Caenorhabditis elegans modelinde protein katlanmasını izlemek için yeni araçların geliştirilmesine yol açmıştır. Laboratuvarımızda, protein yanlış katlanmasını izlemek için katlanma ortamının sensörleri olarak sıcaklığa duyarlı veya doğal olarak oluşan yarı kararlı proteinleri kullanarak davranışsal analizleri, görüntülemeyi ve biyokimyasal yaklaşımları birleştiriyoruz. Spesifik bir proteinin yanlış katlanması ile ilişkili davranışsal tahliller, protein katlanması için basit ve güçlü bir okuma sağlayarak, katlanmayı modüle eden genlerin ve koşulların hızlı bir şekilde taranmasına olanak tanır. Benzer şekilde, bu tür yanlış katlanma, hücrede protein yanlış lokalizasyonu ile ilişkilendirilebilir. Bu nedenle, protein lokalizasyonunun izlenmesi, farklı dokularda, gelişimin çeşitli aşamalarında ve değişen koşullar karşısında meydana gelen hücresel katlanma kapasitesindeki değişiklikleri vurgulayabilir. Son olarak, ex vivo biyokimyasal araçları kullanarak, protein stabilitesini ve konformasyonunu doğrudan izleyebiliriz. Böylece, davranışsal tahlilleri, görüntüleme ve biyokimyasal teknikleri birleştirerek, sırasıyla organizmanın, hücrenin ve proteinin çözünürlüğünde protein yanlış katlanmasını izleyebiliyoruz.

Bozulmuş bir katlanma ortamı, proteinlerin hatalı katlanmasına ve agregasyonuna yol açabilir. Proteinlerin hatalı katlanması, konformasyonel değişikliklerle ilişkilidir ve protein fonksiyon kaybıyla sonuçlanır. Bütün hayvanlarda, spesifik hücrelerde ve protein ekstraktlarında protein katlanmasını ve fonksiyonunu izlemek için tamamlayıcı yaklaşımlar kullanıyoruz. Bilinen bir destabilize edici mutasyonla ilişkili güçlü davranışsal ve hücresel fenotiplere dayalı olarak seçilen uygun bir katlanma sensörü, protein katlanma or...

Protein homeostazı, stres ve yaşlanma arasındaki ilişkiyi incelemek için, genetik olarak izlenebilir metazoan Caenorhabditis elegans'ı model sistem olarak kullanarak, protein disfonksiyonunu, hücredeki protein lokalizasyonunu ve organizma, hücresel ve protein seviyelerinde protein stabilitesini takip ederek protein katlanmasındaki değişiklikleri izledik.

Caenorhabditis elegans'ın Çok Hücreli Bir Organizmada Protein Homeostazını İncelemek için Model Sistem Olarak Kullanılması

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Genetik olarak izlenebilir metazoan CENO R zarafetindeki aşağıdaki deneylerin genel amacı, protein yanlış katlanmasını organizma, hücreler ve proteinler olmak üzere üç seviyede izlemektir. Mutilite veya termo direnç gibi davranışsal fenotipler, organizma düzeyinde, sıcaklığa duyarlı veya doğal olarak meydana gelen protein homeostazındaki değişikliklerin okumaları olarak işlev görür. Meta kararlı proteinler, protein yanlış katlanması ile ilişkilendirilebilecek protein yanlış lokalizasyonunu takip etmek için kullanılır.Bir ex vivo kısmi sindirim testi, protein stabilitesini doğrudan izler. Sonuçlar, termo direnç testi, immünofloresan mikroskobu ve batı kan analizine dayalı olarak farklı yetiştirme sıcaklıklarında proteostaz kapasitesindeki değişiklikleri gösterebilir. Bu işlemler laboratuvarımda yüksek lisans öğrencileri tarafından gösterilecektir.Davranışsal tahlil ish ido tarafından gösterilecek ve Shai immüno boyamayı gösterecek ve ANA flunking ve sheron kısmi sindirimi gösterecektir. Sıcaklık toleransını ölçmek için bu protokole, hayvanları senkronize etmek için hazırlık adımları ve bir hareket testi eşlik eder. Her ikisi de metin protokolünde açıklanmıştır, en az 20 senkronize h

using-caenorhabditis-elegans-as-model-system-to-study-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Biz solucan amylopathies yönlerini incelemek için yöntemler...

Bir<em&gt; Caenorhabditis elegans</emAmylopathy Çalışmaları&gt; Model Sistemi

Biz embriyonik C. büyük ölçekli kültür için burada bir revize protokol açıklar hücreleri elegans. Embriyonik C. elegans Bu yöntemi kullanarak, in vitro olarak kültürlenmiş hücreler, bir hücre özel bir şekilde genlerin ekspresyonunu ayırt ve özetlemek için görünür. Doğrudan hücrelere erişimi ya da diğer dokulardan özel hücre tiplerinin izolasyonu gerektiren C teknikleri uygulanabilir kültür hücreleri elegans.

Kültürleme Embriyonik için bir yöntem<em&gt; C. elegans</em&gt; Hücreler

Burada, mikrobiyal etkileşim çalışmaya çok yönlü ana model olarak Caenorhabditis elegans Yuvarlak solucanlar mevcut.

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

Bu çalışmada, sinaptik boyut ve lokalizasyon, kas Morfoloji ve marochondrial şekil nicel ölçümler serbestçe kullanılabilir görüntü işleme araçları kullanarak C. elegans özetliyor. Bu yaklaşım, C. elegans 'da gelecekteki çalışmaların, genetik mutasyonların bir sonucu olarak doku ve organel yapısal değişikliklerin kapsamını nicel olarak karşılaştırmasına olanak sağlar.

Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar

Burada, biz transgenik Caenorhabditis elegans hatları yeşil floresan protein ifade canlı nöronal hücrelerin belirli grupların basit yalıtım için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, belirli nöronlara odaklanan ex vivo çalışmaların çeşitli sağlar ve daha kısa vadeli kültür için hücreleri yalıtmak için kapasitesine sahiptir.

Roundworm Caenorhabditis elegans belirli neuron nüfus yalıtım

Burada, nematod C. elegans hücresel proteotoksik stres yanıtları floresan transkripsiyonel muhabirlerin aktivasyonunu ölçerek ve fizyolojik strese duyarlılık belirterek karakterize.

C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri

Proteostatik düşüş, nörodejeneratif hastalıkların başlangıcını kolaylaştıran yaşlanmanın ayırt edici bir özelliğidir. İki farklı Caenorhabditis elegans dokularındaki proteostazları, floresan bir muhabire kaynaşmış poliglutamin tekrarlarının heterolog ifadesiyle ölçülebilir bir şekilde ölçmek için bir protokol özetliyoruz. Bu model proteostazın hızlı in vivo genetik analizine izin verir.

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

Vibrio cholerae: Bakteriyel Patogenez Eğitim Modeli Organizma - Röportaj

Medaka ve zebrafish omurgalı genomu fonksiyonları genetik diseksiyon için tamamlayıcı niteliktedir. Bu protokol, Medaka embriyolara başarılı mikroenjeksiyon, bir laboratuvarda Medaka ve zebrafish kullanarak embriyolojik ve genetik analiz için önemli bir tekniktir için kilit noktaları vurgulamaktadır.

Model Genetik Organizma olarak kullanmak için Medaka Embriyolar, Mikroenjeksiyon

Keşfedin Caenorhabditis elegans kullanarak protein homeostazı, stres ve yaşlanma arasındaki ilişkiyi. Davranışsal fenotipler, immünofloresan mikroskopi ve Western blot analizi ile protein katlanma bozukluklarını izleyin.

Caenorhabditis elegans'ın Çok Hücreli Bir Organizmada Protein Homeostazını İncelemek için Model Sistem Olarak Kullanılması

Daha fazla video keşfet