Caenorhabditis elegans'ın Çok Hücreli Bir Organizmada Protein Homeostazını İncelemek için Model Sistem Olarak Kullanılması

Genetik olarak izlenebilir metazoan CENO R zarafetindeki aşağıdaki deneylerin genel amacı, protein yanlış katlanmasını organizma, hücreler ve proteinler olmak üzere üç seviyede izlemektir. Mutilite veya termo direnç gibi davranışsal fenotipler, organizma düzeyinde, sıcaklığa duyarlı veya doğal olarak meydana gelen protein homeostazındaki değişikliklerin okumaları olarak işlev görür. Meta kararlı proteinler, protein yanlış katlanması ile ilişkilendirilebilecek protein yanlış lokalizasyonunu takip etmek için kullanılır.

Bir ex vivo kısmi sindirim testi, protein stabilitesini doğrudan izler. Sonuçlar, termo direnç testi, immünofloresan mikroskobu ve batı kan analizine dayalı olarak farklı yetiştirme sıcaklıklarında proteostaz kapasitesindeki değişiklikleri gösterebilir. Bu işlemler laboratuvarımda yüksek lisans öğrencileri tarafından gösterilecektir.

Davranışsal tahlil ish ido tarafından gösterilecek ve Shai immüno boyamayı gösterecek ve ANA flunking ve sheron kısmi sindirimi gösterecektir. Sıcaklık toleransını ölçmek için bu protokole, hayvanları senkronize etmek için hazırlık adımları ve bir hareket testi eşlik eder. Her ikisi de metin protokolünde açıklanmıştır, en az 20 senkronize hayvan içeren kopyaları toplayarak başlayın.

24'te, 450 mikrolitre ısı şoku tamponu içeren iyi oynanan kuyular. Her kuyucuğu dokuz mikrolitre sitoksin ile destekleyin. Şimdi plakayı ısıtılmış bir banyoya aktarın.

Isı şoku, sıcaklık ve süre büyük ölçüde büyüme koşullarına bağlıdır. Özellikle, yetiştirme sıcaklığı, kalıp alımlarını izleyerek hayvanın hayatta kalmasını puanlar. TXR filtreli bir floresan stereoskop kullanarak, kalıbı alan hayvanlar ölüdür.

Kine gibi mevcut yöntemlerin bu tekniğinin ana avantajı, manuel puanlama ile tolerans, hayvan ölümlerinin görsel olarak okunmasının kullanılmasıdır, bu da bu makaleyi çok daha hızlı ve tekrarlanabilir hale getirir. Gerekli aşamada, en az 30 hayvanı M dokuz tampon içeren bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Kısa, düşük hızlı santrifüj adımları uygulayarak hayvanları M dokuz ile birkaç kez yıkayın ve Resus onları M dokuzda askıya alın.

Ardından tüpleri soğuması için birkaç dakika buzun üzerine koyun. Soğuduktan sonra fazla sıvıyı çıkarın ve tüpleri inkübe edin. 500 mikrolitre buz gibi, %4 PARAFORM aldehit.

Kuluçka süresi, incelenen her protein için kalibre edilmeli ve oda sıcaklığında yaklaşık beş ila 30 dakika olmalıdır. Şimdi, sabit hayvanları santrifüjleme ile pH 7.2'de PBS tween ile üç kez yıkayın. Santrifüjlemeler, aksi belirtilmedikçe her zaman 3000 RPM'de bir veya iki dakika boyunca gerçekleştirilir.

Kaputta, süpernatantın çoğunu çıkarın ve peleti bir mililitre ışın merkaptoetanol çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra hayvanları gece boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve ertesi gün kaputta hafifçe sallayın. Hayvanları santrifüjleme ve Resüs ile PBST ile üç kez yıkayın.

Yıkamayı 50 ila 100 mikrolitre PBST ile bitirin ve başka bir santrifüjlemeden sonra bu PBST'nin çoğunu çıkarın. Daha sonra, 100 ila 150 mikrolitre kollajenaz çözeltisi ekleyin ve hayvanları güçlü bir çalkalama ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir termo karıştırıcı veya çalkalama inkübatörü kullanın.

Beş dakika sonra, stereo mikroskop altında periyodik kontroller yapmaya başlayın. Hayvanların beşte biri kırıldığında, tüpü buzun üzerine yerleştirerek reaksiyonu durdurun. Bu adım son derece hassastır.

Tedavinin süresi fiksasyon koşullarına bağlıdır ve suşlar arasında büyük ölçüde değişebilir. Uzun süreli bir kuluçka, hayvanların tamamen bozulmasına neden olabilir. Koşullar her enzim partisinden önce kalibre edilmeli ve bozunma dikkatle izlenmelidir.

Daha sonra, hayvanları PBST'de iki kez yıkayın. Hayvanları santrifüjleme ile toplayın ve PBST'nin çoğunu çıkarın. Daha sonra bir mililitre BA çözeltisi ekleyin, ardından oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe sallanarak inkübasyon yapın, hayvanları santrifüjleme ile toplayın ve 200 mikrolitre bir b'de yeniden süspanse edin, A. Şimdi birincil antikoru ekleyin ve oda sıcaklığında hafifçe sallanma ile bir gece inkübasyona başlayın.

Bu parametrelerin kalibre edilmesi gerekir. Daha sonra, hayvanları santrifüjleme ile yıkayın. Bunları bir mililitre a, b, A içinde tekrar süspanse edin ve oda sıcaklığında 15 dakika ila bir saat arasında hafifçe karıştırarak inkübe edin.

Bu noktada, isteğe bağlı bir floresan boya ilavesi eklenebilir. Daha sonra, bir BA tampon yıkamasını üç kez daha tekrarlayın ve yıkamaları, uygun floresan etiketli ikincil antikor ile 100 mikrolitre bir BA'da bir ila 100 seyreltmede Resus süspanse ederek bitirin. İkincil olanı temizlemek için numuneleri ışıktan korunan oda sıcaklığında birkaç saat sallanarak inkübe edin.

a, b, a ile üç yıkama yapın. Daha sonra hayvanları önce Resüs ile slaytlara monte edin, onları 10 mikrolitre a, a'ya asın ve ardından numunenin bir veya iki mikrolitresini her slayta aktarmak için geniş delikli bir pipet kullanın, eşit hacimde montaj ortamı ekleyin ve slaytı kapatın. Slaytı oje ile nazikçe kapatın.

Slaytlar eksi 20 santigrat derecede uzun süre saklanabilir. Genel olarak, bu protokole yeni olan kişiler, protokolün uzun olması ve verimliliğini etkileyebilecek birçok adım içermesi nedeniyle sorun gidermeyi zorlaştırdığı için mücadele edeceklerdir. Hayvanları yaklaşık 1560 milimetrelik plakalardan bir veya iki mililitre M dokuz tamponuna toplayarak başlayın.

Hayvanlar aşırı kalabalık olmamalıdır. Hayvanları santrifüjleyerek ve tekrar askıya alarak M dokuz tampon ile birkaç kez yıkayın. Son dönüşten sonra, tekrar hayvanları 100 mikrolitre M dokuz tampon içinde askıya alır.

Daha sonra hayvanları hızlı dondurun ve soğutulmuş bir havaneli ve matkap kullanarak numuneyi buz üzerindeyken öğütün. Hayvanların yeterince öğütülüp öğütülmediğini kontrol etmek için sık sık duraklatılır. Hayvanlar tamamen ezildikten sonra, solucan ekstraktının hacmini tahmin edin.

Daha sonra eşit hacimde iki x solucan lizis çözeltisi ekleyin ve numuneyi buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. Ardından, kalıntıları soğutulmuş bir santrifüj döngüsü ile temizleyin ve süpernatanı temiz bir mikro füj tüpüne aktarın. Bir Bradford testinden sonra, numuneyi mililitre başına üç ila 3.5 miligram proteine seyreltin.

Daha sonra bir ila 1200 oranında taze hazırlanmış soğutulmuş kamuflaj tripsin çözeltisini ekleyin. Bu noktada, numuneyi bir saat inkübe edecek şekilde ayarlayın. Kuluçka sırasında, periyodik olarak 20 mikrolitre alikot alın ve bunları hemen SDS tamponu ile karıştırın, ardından 96 santigrat derecede beş dakika izleyin.

Numuneleri çalıştırın ve proteinin nispi stabilitesini belirlemek için bir Batı kan analizi ile takip edin. Bu prosedürü denerken, sindirim örneğine proteaz inhibitörü kokteyli eklememeyi unutmamak önemlidir ve bunun yerine örnekleri hızlı bir şekilde buz üzerinde tutacağız. 45'teki kas şaperonundaki E 781 K ts mutasyonu, miyozin katlanmasını ve birleştirilmesini güçlü bir şekilde etkiler ve bu nedenle hayvan hareketliliğini etkiler.

Bu mutantlar 20 santigrat derecenin üzerindeki sıcaklıklarda büyütüldüğünde, tamamen felç oldular, ancak 15 santigrat derecede değil. 25 santigrat derecede yetiştirilen vahşi tip hayvanlar uzun süreli bir ısı şokuna maruz kaldığında, çoğu hayatta kaldı. Isı şoku tepkisi üzerindeki etkili değiştiricileri izlemek için 15 ila 20 santigrat derecede yükseltildiğinde sadece% 30'u hayatta kalırken, kontrol stresi koşulları vahşi tip hayvanlar için% 70'lik bir hayatta kalma oranına yükseltildi.

Hayvanlar altı saat boyunca 37 santigrat derece ısı şokuna maruz bırakıldı. Yetişkinliğin ilk gününde, sağkalım, cyt portakal alım testi ile test edildi. Ölü hayvanlar beyaz oklarla, canlı hayvanlar ise sarı oklarla gösterilir.

Birkaç meta stabil proteinin lokalizasyonu, spesifik antikorlar kullanılarak görselleştirildi. Örneğin, kısıtlayıcı koşullar altında kas sarkomerine yerine polikristalin düzeneklere lokalize olan paraminler vardır. Benzer şekilde, miyozin TS, kısıtlayıcı sıcaklıkta yüksek derecede sıralı filamentli yapılar yerine düzensiz filamentler oluşturur.

Myo üç ile birlikte eksprese edilen çeşitli TS mutant proteinlerini eksprese eden hayvanlar. GFP, izleme ile tespit edildiği gibi miyo filament organizasyonunda hızlı bir bozulma gösterdi, GFP onayındaki değişiklikler kas hücrelerinin katlanma kapasitesindeki değişiklikleri yansıtabilir. UNC 45 Ts ile birlikte eksprese edilen miyozin ağır zincirinin proteolitik parçalanma paterni, miyozin katlanmasının UNC 45'ten etkilendiği iddiasını destekleyen yabani tip hayvanlardan miyozinin sindirim profili ile karşılaştırıldığında farklı özellikler gösterir.

İşlev kaybı. Bu yöntem, deniz zarafetinde proteostazın düzenlenmesi hakkında fikir verebilse de, farklı model organizmalar gibi diğer sistemlerde de uygulanabilir.