FtsZ Polimerizasyon Tahliller: Basit Protokoller ve Düşünceler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, basit tahliller ve ekipman kullanarak FTSZ, polimerizasyon ve aktiviteyi incelemek için uygun koşulları belirlemektir. Bu, FDSZ'nin polimerize olduğu uygun koşulları bulmak için çeşitli koşullar altında FDSC polimer sedimantasyon deneyleri yapılarak elde edilir. İkinci adım olarak, FDSZ polimerizasyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için ışık saçılma testleri gerçekleştiriyoruz.

Daha sonra, FT SC'nin polimerizasyonla ilişkili g gtpa aktivitesini belirlemek için GTP hidroliz testleri gerçekleştiriyoruz. Sedimantasyon, ışık saçılımı ve GTP hidrolizine dayalı olarak belirli bir bakteri kaynağının FTSC'sinin incelenmesi için hangi koşulların en uygun olduğunu gösteren sonuçlar elde edilir. Burada gösterilen tekniğin herhangi bir laboratuvarda uygulanması kolaydır ve belirli FT a z'nin polimerizasyon yetenekleri hakkında hızlı bir fikir verecektir. Laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan EVA taraması olacağını gösteren diğer proteinlerin varlığında FTAZ ile çalışırken doğru tampon seçiminin özellikle önemli olduğunu bulduk.

Başlamak için, beş mikrolitre 100 milimolar magnezyum klorür ve 12 mikromolar bakteri proteini, FDSC ve/veya SEP F'yi, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi çeşitli pH değerlerine ve bileşimlere sahip seçilen polimerizasyon tamponlarından birine ekleyin. Daha sonra, tüpleri çalkalama işlevine sahip bir inkübatöre yerleştirin ve numuneleri 30 santigrat derece ve 300 RPM'de iki dakika inkübe edin. Tüpler iyice karıştırıldıktan sonra, nihai konsantrasyon iki milimolar olacak şekilde 100 milimolar stok çözeltisinden bir mikrolitre GTP veya GDP karışımı ekleyerek polimerizasyona başlayın.

Ardından numuneleri 20 dakika daha çalkalama inkübatörüne geri koyun. Daha sonra, tüpleri bir TLA 55 rotor veya başka bir şey kullanıyorsanız eşdeğer bir 24.600 Gs kullanarak 20.000 RPM'de 15 dakika boyunca döndürün. Santrifüj bittiğinde, süpernatanları temiz tüplere aktarın ve peletleri daha sonrası için saklayın.

Aktarılan süpernatantlardan 20 mikrolitre alın ve bunları 20 mikrolitre iki kez konsantre numune tamponu ile ayrı bir tüpte karıştırın. Kapakları sabitleyin ve numuneleri 98 santigrat derecede 10 dakika kaynatın. Daha sonra, daha önce bir kenara bırakılan her bir pelet fraksiyonuna 50 mikrolitre iki kez konsantre numune tamponu ekleyin ve numuneleri 98 santigrat derecede 10 dakika kaynatarak polimerleri askıya alın.

Numunelerin kaynaması bittiğinde, peletleri içeren tüplere 50 mikrolitre daha demineralize su ekleyin. Daha sonra, her bir numuneden hem süpernatanlardan hem de peletlerden 10 mikrolitreyi %10'luk bir SDS sayfa jeli üzerine yan yana yükleyin ve jeli 150 voltta çalıştırın. Jel tamamlandığında, jeli çıkarın ve kumasi brilliant blue G two 50 ile boyayın.

Daha sonra jeli görüntüleyin ve ekteki metin protokolünde tarif edildiği gibi sitometri kullanarak proteini nicelleştirin. Önce bir floresan spektrometreyi açın ve termal dalgalanmaları önlemek için lambanın birkaç dakika ısınmasına izin verin. Ayrıca, dolaşan bir su banyosunu açın ve vete odasını sabit bir sıcaklıkta tutmak için su sıcaklığını 30 santigrat dereceye ayarlayın.

Sistem ısınırken, spektrometrenin çalışma parametrelerini tanımlayın. Dedektörün yüksek voltajını 300 volta ve emisyon ve uyarma dalga boylarını dört nanometre yarık genişliğinde 350 nanometreye ayarlayın. Ardından, 3.600 saniye süreli zamana dayalı bir edinme seçerek veri toplama protokolünü programlayın.

Bir santimetre yol uzunluğuna sahip 200 mikrolitrelik bir floresan damarı, bir su banyosunda beş dakika boyunca bir temizleme solüsyonunda zina yaparak dikkatlice temizleyin. Daha sonra, beraberindeki metin protokolünde açıklanan dokuz polimerizasyon tamponunun her biri için, her biri 10 milimolar magnezyum klorür ve 300 mikrolitre için hesaplanan nihai konsantrasyonlar olarak 12 mikromolar FDSE içeren 294 mikrolitre bir ana karışım hazırlayın. Daha sonra karışımları kısaca girdaplayın, ilk polimerizasyon tamponunun 196 mikrolitresini veterinere aktarın.

Spektrometreye yerleştirin ve numunenin sıcaklığını 30 santigrat dereceye çıkarmak için iki dakika inkübe edin. İki dakika sonra veri alımını başlatın ve sinyalin kararlı olduğunu doğrulamak için 90 saniye bekleyin. Sonra dört mikrolitre 100 milimolar GTP veya GSYİH ekleyin.

Örneği karıştırın ve tam bir saat boyunca veri toplamaya devam edin. Listelenen her arabellek için bu adımları yineleyin. Seçilen bir polimerizasyon tamponunda 1.5 mililitre iki milimolar GTP hazırlayın.

Ayrıca aynı tamponda sıfır ila 40 mikromolar aralıkta bir fosfat standart seyreltmesi hazırlayın. Ardından, biyotahlil kitinde açıklandığı gibi malakit yeşili çalışma reaktifini hazırlayın. Daha sonra, her biri 360 mikrolitre toplam hacme sahip dört ana karışım oluşturun: ana karışım biri B subtilis'ten türetilen FDSZ içerir ve ana karışım iki, e coli'den türetilen FDSE içerir.

Ana karışımlar üç ve dört, kontrol olarak kullanılır ve magnezyum klorür yerine EDTA içerir. Daha sonra ana karışımların ve fosfat standartlarının 20 mikrolitrelik pipetini pipetleyin. A-Q-P-C-R 96 kuyulu plakada, her bir ana karışım için 16 kuyu olacak şekilde ve fosfat standartları burada gösterildiği gibi düzenlenmiştir.

180 mikrolitre iki milimolar GTP stoğunu plakanın son şeridine pipetleyin. Ardından plakayı bir PCR makinesine yerleştirin. 40 dakika boyunca 30 santigrat dereceye ayarlanmış tek bir döngüye sahip bir program çalıştırın.

İkinci bir 96 oyuklu plaka pipetinde, malakit yeşili çalışma reaktifinin 20 mikrolitrelik alikotları, A'dan H 10'a kadar olan kuyulara. Daha sonra, deneyden elde edilen polimerizasyon tamponunun 60 mikrolitresinde, A'nın bir ila H sekiz, daha sonra iki milimolar GTP çözeltisinin 20 mikrolitresinde plakanın her bir şeridindeki kuyucuklara doğru olduğunu iddia eder. Çeşitli zaman noktalarında reaksiyonu incelemek için burada gösterildiği gibi önceden belirlenmiş aralıklarla bir tane.

Karışımları 30 dakika sonra karıştırmak için yukarı ve aşağı sıkın, birinci şeritten başlayarak birinci şeritten başlayarak, 20 mikrolitreyi birinci plakanın birinci şeridinden ikinci şeridin birinci şeridine aktarın ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Bu, 30 buçuk dakika sonra 30 dakikalık reaksiyon için malakit yeşili renk gelişiminin başlangıç noktasıdır, 20 mikrolitreyi birinci plakanın ikinci şeridinden ikinci plakanın ikinci şeridine aktarın ve karıştırın. Bu, 20 dakikalık reaksiyon için malakit yeşili renk gelişiminin başlangıç noktasıdır.

Bu adımları, 33 buçuk dakika sonra 20 mikrolitre GTP'de 32. aralıklarla kalan şeritler üç ila yedi olacak şekilde tekrarlayın ve birinci plakadaki sekizinci şeride geçin ve karıştırın. Daha sonra 20 mikrolitreyi ikinci plakadaki sekizinci şeride aktarın ve karıştırın. Bu, sıfır dakika reaksiyonunu temsil eder ve malakit yeşili renk gelişimi için başlangıç zaman noktasıdır.

34 dakika sonra, fosfat standardını içeren birinci plakanın dokuzuncu şeridinden 80 mikrolitreyi ikinci plakanın dokuzuncu şeridine ekleyin ve 34 buçuk dakika sonra karıştırın, birinci plakanın 10. şeridindeki ikinci fosfat standardından 80 mikrolitreyi ikinci plakanın 10. şeridine aktarın ve karıştırın. Daha sonra numunelerdeki tüm hava kabarcıklarını çıkarın ve plakayı oda sıcaklığında 25 buçuk dakika daha inkübe edin. Kuluçka sonrası.

Plakayı, deneyin başlangıcından itibaren 96 dakikadan başlayarak 60 kuyulu bir plaka okuyucuya yerleştirin. Plakayı beş dakika boyunca her 30 saniyede bir 630 nanometrede ölçün, böylece 10 zaman noktası alınır. İlk plaka ölçümü birinci şeride karşılık gelecektir, ikincisi ikinci şeride karşılık gelecektir ve böylece her şerit malakit yeşili renginin gelişmesi için tam olarak aynı zamana sahip olacaktır.

Ardından, fosfat standart kalibrasyon eğrisini kullanarak her numunedeki serbest fosfatı hesaplayın ve verileri zaman içinde fosfat salınımı olarak çizin. Ardından eğrinin doğrusal aralığından F-D-S-Z-G-T-P hidroliz aktivitesini hesaplayın. Burada, numunelerin peletlerindeki SEP F ve FDSZ'nin yüzdesi gösterilmektedir.

FDSZ, pelette arka plan seviyelerinin üzerinde, yalnızca numunede hem SEP F hem de GTP mevcut olduğunda geri kazanıldı. Bu tübüllerde SEPPE ve FDSZ'nin kesin stokiyometrisi bilinmemektedir, ancak bu sonuçlar FDSZ'den daha fazla SEPPE bulunduğunu göstermektedir. FDSZ'nin B subtilis ve e coli'den ışık saçılması, 50 milimolar potasyum klorür tamponunda iki milimolar GTP varlığında birleştirilerek burada gösterilmiştir.

F-D-S-E-B-S, tampon pH'ına bağlı olarak FDSC EC'den 20 ila 40 kat daha yüksek ışık saçılma sinyali verir. İlginç bir şekilde, tampondaki potasyum klorür konsantrasyonunun arttırılması, F-D-S-Z-E-C'nin ışık saçılma sinyalini önemli ölçüde etkilemedi, ancak F-T-S-Z-B-S sinyali, pH 7.5'te yaklaşık 80 kat, pH 6.8'de 30 kat ve 300 milimolar potasyum klorürde pH 6.5'te 45 kat, 50 milimolar potasyum klorürlü tamponlara kıyasla. FDSZ'nin GTP hidroliz aktivitesi, serbest fosfat için kolorimetrik bir test kullanılarak farklı tampon koşulları altında ölçüldü.

FT SZ'nin GTPS aktivitesinin, farklı pH koşullarının her birinde artan potasyum klorür konsantrasyonu ile arttığı bulunmuştur. 50 milimolar potasyum klorürde, 50 milimolar'da F-D-S-Z-B-S filamentlerinin demetlenmesi nedeniyle gtpa aktivitesi azaldı. Potasyum klorür FDSZ EEC, FDSC EEC polimerlerinin daha hızlı sökülmesi nedeniyle F-D-S-Z-B-S'den üç ila altı kat daha yüksek GTPS aktivitesine sahipti.

Son olarak, F-D-S-Z-B-S ve F-D-S-Z-E-C arasındaki GTP hidroliz aktivitesindeki fark, muhtemelen F-D-S-Z-B-S filamentlerinin demetlenmesinin azalması nedeniyle 300 milimolar potasyum klorürde azaltılmıştır. Bu prosedürü takiben, numunedeki fts polimerlerinin yapısıyla ilgili ek soruları yanıtlamak için elektromikroskopi gibi diğer metaller de gerçekleştirilebilir.