Name: FtsZ Polimerizasyon Tahliller: Basit Protokoller ve Düşünceler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Keşfedin FtsZ polimerizasyonunu bakteri hücre bölünmesi araştırmaları için sedimentasyon, ışık saçılımı ve GTP hidroliz analizleri kullanarak. Bu yöntemler antibakteriyel ilaç geliştirme çalışmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Laboratuvarımızdaki çalışmalar, Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nden (DJS'ye) bir VIDI hibesi ile finanse edilmektedir. 
Marc Stuart'a ve üniversitemiz Elektron Mikroskobu Bölümü'ne, transmisyon elektron mikroskobuna yardım ettikleri ve erişim sağladıkları için teşekkür ederiz.

<ol><li>Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitor+of+FtsZ+with+potent+and+selective+anti-staphylococcal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity.</a> Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).</li>
<li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+division%3A+assembly%2C+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).</li>
<li>Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+in+bacterial+cytokinesis%3A+cytoskeleton+and+force+generator+all+in+one%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (4), 504-528 (2010).</li>
<li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).</li>
<li>Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+SepF+binds+to+the+C-terminus+of+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ.</a> PLoS One. 7 (8), e43293(2012).</li>
<li>Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SepF+increases+the+assembly+and+bundling+of+FtsZ+polymers+and+stabilizes+FtsZ+protofilaments+by+binding+along+its+length%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length.</a> J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).</li>
<li>Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+ring+polymers+align+FtsZ+polymers+for+normal+septum+formation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation.</a> EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).</li>
<li>Pacheco-Gomez, R., Roper, D. I., Dafforn, T. R., Rodger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pH+dependence+of+polymerization+and+bundling+by+the+essential+bacterial+cytoskeletal+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The pH dependence of polymerization and bundling by the essential bacterial cytoskeletal protein FtsZ.</a> PLoS One. 6 (6), e19369(2011).</li>
<li>Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+model+for+ionic+%28K%28%2B%29%2FNa%28%2B%29%29+and+pH+dependence+of+GTPase+activity+and+polymerization+of+FtsZ%2C+the+prokaryotic+ortholog+of+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin.</a> J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).</li>
<li>Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Escherichia+coli+cell+division+protein+FtsZ+by+a+low-affinity+interaction+with+monovalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations.</a> FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).</li>
<li>Scheffers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+MinC+on+FtsZ+polymerization+is+pH+dependent+and+can+be+counteracted+by+ZapA%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA.</a> FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+FtsZ+assembly+by+light+scattering+and+determination+of+the+role+of+divalent+metal+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations.</a> J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).</li>
<li>Chen, Y., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+assembly+dynamics+and+subunit+turnover+of+FtsZ+demonstrated+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer.</a> J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).</li>
<li>Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Caulobacter+crescentus+FtsZ+protein+using+dynamic+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering.</a> J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+assembly+of+FtsZ+regulated+by+GTP+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis.</a> EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).</li>
<li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).</li>
<li>Ray, S., Kumar, A., Panda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+regulates+the+interaction+between+MciZ+and+FtsZ%3A+a+possible+role+of+MciZ+in+bacterial+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division.</a> Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).</li>
<li>Rivas, G., Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnesium-induced+linear+self-association+of+the+FtsZ+bacterial+cell+division+protein+monomer.+The+primary+steps+for+FtsZ+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly.</a> J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).</li>
<li>Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+FtsZ+protofilament+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural insights into FtsZ protofilament formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).</li>
<li>Lowe, J., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+bacterial+cell-division+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ.</a> Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).</li>
<li>Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+SOS+cell+division+inhibitor+SulA+and+in+complex+with+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).</li>
<li>Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+dynamics+of+Mycobacterium+tuberculosis+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ.</a> J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).</li>
<li>White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+polymerization+of+Mycobacterium+tuberculosis+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ.</a> J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).</li>
<li>Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+conformational+variability+of+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the conformational variability of FtsZ.</a> J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).</li>
<li>Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li>
<li>Buske, P. J., Levin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+C+terminus+of+bacterial+cytoskeletal+protein+FtsZ+plays+fundamental+role+in+assembly+independent+of+modulatory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins.</a> J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).</li>
<li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+FtsZ+assembly+by+light+scattering+and+determination+of+the+role+of+divalent+metal+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations.</a> J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

FtsZ aktivitesinin ve diğer proteinlerle etkileşiminin hızlı bir şekilde analiz edilmesini sağlayan bir dizi yöntem açıklıyoruz. Işık saçılımı, sedimantasyon ve GTPaz tahlillerinin yanı sıra elektron mikroskobu, FtsZ polimerizasyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mevcut protokollerde bazı iyileştirmeler yaptık, farklı koşulların FtsZ montajı üzerindeki etkisini gösterdik ve FtsZ çalışmalarına dahil edilmesi gereken kontroller öneriyoruz.
FtsZ ve etkileşen proteinleri arasındaki ilişkinin oluşturduğu büyük yapıları FtsZ polimerlerinden ayırt etmek için düşük hızlı santrifüjlemeyi tanıtıyoruz. Bu yöntem, standart sedimantasyon testine göre iki avantaj gösterir. İlk olarak, 24.600 x g'da döndürülmedikleri için pelet fraksiyonunda FtsZ polimerleri tarafından herhangi bir arka plan oluşturulmaz. İkincisi, etkileşen bir protein ile oluşturulan yapıda bulunan FtsZ miktarı jelden hesaplanabilir. Bu yöntemdeki iki kritik adım, inkübasyon süresi ve GTP konsantrasyonudur. Büyük protein yapısını tamamlandığında, ancak tüm GTP hidrolize edildiğinde parçalanmadan önce santrifüjlemek önemlidir. Bu çalışma için en iyi kontrol, FtsZ'nin GSYİH ile polimerizasyonudur. Testin potansiyel bir sınırlaması vardır. FtsZ, SepF ile 24.600 x g'da kolayca döndürülebilen kararlı bir kompleks oluşturur. Başka bir aktivatör veya FtsZ polimerlerini bir araya getiren bir ilaçla sedimantasyon yapılırsa, testin uyarlanması gerekebilir. İnkübasyon süresini değiştirerek veya santrifüjleme hızını artırarak yapılabilir.
Işık saçılımı deneyleri için numunenin uygun şekilde hazırlanması en önemlisidir. Proteinler döndürülerek önceden temizlenmeli ve kullanımdan önce tüm tamponlar filtrelenmelidir. Numunede herhangi bir agrega varsa, bunlar FtsZ polimerlerinden elde edilen kararlı bir sinyali bozacaktır. FtsZ yapılarının elektron mikroskobu ile analizi için bir ızgaranın hazırlanması ana adımdır. Izgara üzerinde numune inkübasyon süresi, az ya da çok sıkıştırılmış polimerler üretme etkisine sahip olacaktır. FtsZB demetleri için inkübasyon süresi, yüksek KCl konsantrasyonunda FtsZEc ve FtsZB'lerden daha kısa olmalıdır. Sonuçları karşılaştırabilmek için her numune için 12 μM'lik bir konsantrasyon kullandık. Bununla birlikte, 50 mM KCl'de FtsZBs için daha düşük bir FtsZ konsantrasyonu kullanılmalıdır, çünkü 12 μM ızgaranın tam doygunluğuna neden olur. Bu, polimerleri oldukça sıkıştırılmış ve tespit edilmesini zorlaştırır. Daha az sıkıştırılmış polimerlerin EM'de tespit edilmesi daha iyidir.
GTPase testi, FtsZ'nin yapılarından ziyade aktiviteyi incelemek için kullanılan tek deneydir. FtsZ polimerlerinde GTP devri içinMg2+ gereklidir. Bu nedenle,Mg2+ yokluğunda FtsZ, GTP'yi hidrolize etmez. Bu nedenle,Mg2+ içermeyen bir numune bu tahlilde doğru kontroldür, ancak FtsZ depolama tamponunda Mg katyonları mevcuttur. Kontrol örneğine 1 mM EDTA eklenerek çıkarılabilirler. Bu tahlildeki kritik adım inkübasyon süresidir. Belirli bir süre sonra FtsZ aktivitesini durdurmak önemlidir. Bu, FtsZ numunesinin 96 oyuklu bir plakadaki malakit yeşili çözeltisine aktarılmasıyla elde edilir. Ancak malakit yeşili renginin gelişimi sürekli bir süreçtir. Bu nedenle ölçümler her numune için aynı anda yapılmalıdır. Her 30 saniyede bir belirlenmiş bir sırayla alınan ölçümlerle iyi planlanmış bir GTP ekleme protokolü kullanarak, her zaman noktası için aynı inkübasyon ve numune işleme süresini elde etmek mümkündür. Bir diğer kritik adım, deney için protein konsantrasyonunun seçilmesidir. Deneyde FtsZEc ve FtsZ Bs için iki farklı konsantrasyonkullandık. GTP hidrolizi, FtsZBs'ye kıyasla FtsZEc için çok daha hızlıdır. FtsZEc'nin seçilen koşullar altında ve 12 μM'de GTPaz aktivitesi sadece maksimum 5 dakika boyunca doğrusaldır ve bu süreden sonra hidroliz hızı platolardır. Bu nedenle, bu koşullar altında gerçekleştirildiğinde deneyden elde edilen verileri yorumlamak zordur. Bu durumda FtsZEc, her iki proteinin aktivitelerini karşılaştırabilmek için FtsZBs'den daha düşük konsantrasyonda kullanılmalıdır. Farklı kaynaklardan gelen FtsZ'lerin GTPaz aktivitesi değişebilir. Bu nedenle, doğru konsantrasyon seçilmelidir. FtsZ polimerizasyonu için konsantrasyon, kritik konsantrasyonun oldukça üzerinde olmalıdır (genel olarak 2.5-10 μM). FtsZ montaj ve demontaj dinamikleri de önemlidir. Bazı proteinler, 50 mM KCl'de FtsZB'ler için gösterildiği gibi, GTP ilavesinden sonra polimerizasyonda önemli bir gecikme gösterir. FtsZ polimerlerinin montaj ve demontaj süresini yaklaşık olarak tahmin etmek için GTPase testinden önce ışık saçılma testinin yapılması yararlıdır. Bundan sonra, inkübasyon zamanı ve protein konsantrasyonu seçilebilir. FtsZ polimerizasyonu için seçilen koşullar çok önemli olduğundan, her yöntemde doğru pH ve KCl konsantrasyonunun kullanılması önemlidir. Bu çalışmada, pH'ı 6.5-7.5 arasında değişen ve KCl konsantrasyonları 0 M ila 300 mM arasında değişen 9 farklı tampon üzerinde çalıştık. FtsZ'leri analiz etmek için en iyi koşulun B. subtilis ve E.coli ve biyolojik aktiviteleri, yüksek bir KCl konsantrasyonu ile birlikte fizyolojik seviyeye (7.5) yakın pH'ta olduğunu fark ettik. Yüksek bir KCl konsantrasyonunda, FtsZ daha yüksek bir GTPaz aktivitesine sahiptir ve elektron mikroskobu ile daha iyi tespit edilebilen polimerler üretir. Ayrıca, fizyolojik pH ve yüksek KCl konsantrasyonunun, FtsZ ve düzenleyici proteinler arasındaki etkileşimin incelenmesi için, çoğunlukla FtsZ düzeneğini incelemek için kullanılan diğer tamponlardan daha iyi olduğunu doğruladık. FtsZB'ler, yüksek KCl konsantrasyonunda çalışıldığında FtsZEc'ye benzer bir aktivite gösterir. Ek olarak, düşük tuz konsantrasyonunda pH'ın etkisi, yüksek tuz konsantrasyonuna sahip tamponlara göre daha belirgindir. FtsZ bazen KCl içermeyen tamponlar kullanıldığında çökelir, sonuç olarak tuzsuz tamponlardan kaçınılmalıdır. Yüksek KCl konsantrasyonlarına sahip tamponlar kullanıldığında FtsZ polimerlerinin çökelmesi düşüktür. Bu, FtsZ ile SepF ve ZapA gibi FtsZ filamentlerini birleştiren proteinler arasındaki etkileşimleri incelerken bir avantaj olabilir, çünkü bu yüksek dereceli yapıların santrifüjleme ile tespit edilmesi kolaydır. Tüm deneylerimizde 10 mM konsantrasyonda MgCl2 kullandık. Nispeten yüksek birMg2+ konsantrasyonunun FtsZ polimerlerini stabilize ettiği ve FtsZ'nin GTPaz aktivitesini azalttığı gösterilmiştir. Tablo 2'de, çeşitli çalışmalardan elde edilen sonuçlar, aksi takdirde aynı tampon koşulları 27 kullanılarak farklıMg2+ konsantrasyonlarında FtsZ polimerizasyonunu ve GTPaz aktivitesini açıklayan özetlenmiştir. Ölçülen serbest sitoplazmikMg2+ konsantrasyonu 0.9mM3'tür. GTP'nin eşdeğer miktardaMg2+ şelatlayacağına dikkat edilmelidir. Bu nedenle, GTPaz deneyleri için optimalMg2+ konsantrasyonu, fizyolojik seviye3'e yakın olan 2-2.5 mM civarındadır. Bununla birlikte, deneylerimizde kullandık MgCl2 kolayca tespit edilebilir bir ışık saçılım sinyali elde etmek ve sedimantasyon testi sırasında FtsZ polimerlerini stabilize etmek için 10 mM konsantrasyonda.
Protokollerimizi model organizmalardan FtsZ'ye uygulamış olsak da E. koli ve B. subtilis, başka herhangi bir organizmadan FtsZ'ye uyarlanabilirler. Fizyolojik pH'ın ve tek değerlikli ve iki değerlikli katyonların konsantrasyonlarının organizmalar arasında farklılık gösterdiğine dikkat edilmelidir. Bu nedenle, FtsZ polimerizasyonu için en uygun koşullar değişebilir. Farklı bakterilerin ikiye katlanma süresi ve büyüme koşullarındaki farklılıklar, FtsZ'nin farklı montaj kinetiğine ve deneylerin optimal koşullarına neden olabilir. Bununla birlikte, protokolümüz, diğer organizmalardan FtsZ'lerle yapılan deneyler için iyi bir başlangıç noktası sağlar. Protokoller, düzenleyici proteinlerle FtsZ'nin incelenmesi veya küçük bileşiklerin ve ilaçların FtsZ üzerindeki etkilerinin incelenmesi için faydalı olmalıdır.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kaynak</td>
			<td>Polimerizasyon [çökelmiş FtsZ'nin %'si]</td>
			<td>GTPase [Pi/FtsZ/dak]</td>
			<td>Mg2+ konsantrasyon [mM]</td>
			<td>FtsZ konsantrasyonu [μM]</td>
			<td>Başvuru</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FtsZEC</td>
			<td>~ %28</td>
			<td>~ 2.1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>Bu çalışma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ %50</td>
			<td>~ 2.4</td>
			<td>10</td>
			<td>12.5</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ %43</td>
			<td>~ 3.5</td>
			<td>5</td>
			<td>12.5</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ %27</td>
			<td>~ 4.6</td>
			<td>2.5</td>
			<td>12.5</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ND</td>
			<td>~ 5.4</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FtsZBs</td>
			<td>~ %30</td>
			<td>~ 0.8</td>
			<td></td>
			<td>12</td>
			<td>Bu çalışma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>~ %52 (DEAE dekstran ile)</td>
			<td>~ 0.5</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ND</td>
			<td>~ 2.25</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>26</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2. Mg2+ 'nın FtsZ polimerizasyonu ve GTPaz üzerindeki etkisi. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, yayınlanan verilerle karşılaştırıldı. Tüm deneyler 50 mM MES/ NaOH, pH=6.5, 50 mM KCl'de gerçekleştirildi.

Esansiyel bakteriyel protein FtsZ bakteriyel hücre bölünmesi makine en iyi karakterize edilmiş bir proteindir. FtsZ tubulin prokaryotik homolog olan ve bir GTP bağlı bir şekilde, in vitro olarak polimerize eder. FtsZ bakteri 1,2 onun korunmuş doğası ve teklik nedeniyle yeni antibiyotik için çok cazip bir hedeftir. Hücre bölünmesi başında, FtsZ diğer hücre bölünmesi proteinlerin montajı için bir yapı iskelesi olarak hizmet midcell bir cytokinetic halka oluşturur. Z-halka oluşumu bölme düzlemi doğru lokalizasyonu için çok önemlidir. FtsZ montajı dinamikleri gibi Minc, SepF, Zapa, UgtP, ve Ezra 2 (bakteri türlerine bağlı olarak) gibi çeşitli aksesuar proteinler tarafından düzenlenir. FtsZ polimerizasyon yoğun in vitro ve protofilaments düz, kavisli protofilaments, filament levha, filaman demetleri ve filament tüpler dahil olmak üzere, pek çok farklı yapılarda incelenmiştir des olmuşturmontaj tampon, nükleotid ve deneyde 3 dahil ek protein bağlı cribed. Caulobacter crescentus elektron cryotomography deneyler Z-halkası geniş 4 donatılacak olmadan nispeten kısa, kesintili tek protofilaments monte edilir olduğunu göstermektedir rağmen in vivo FtsZ protofilaments mimarisi henüz tam olarak anlaşılmış değildir. İn vitro olarak, FtsZ polimerizasyon özellikleri ve düzenleyici proteinleri ile FtsZ etkileşimi reaksiyon tampon bileşimine duyarlıdır. Örneğin, son zamanlarda FtsZ C-terminüsünde SepF için etkileşim sitesi tarif edilen ve bir FtsZ Δ16 arasında C-terminal kesik artık SepF 5 bağlandığını göstermiştir. SepF-FtsZ İşletmeleri etkileşim önceki bir çalışmada, benzer bir FtsZ İşletmeleri Δ16 hala SepF FtsZ üzerinde ikincil bir siteye bağlanan önerdi SepF ile cosedimented kesilmesinden <sup&gt; 6. Bu çalışmalar arasındaki fark, pH 6.5 &#39;te cosedimentation yoktu, oysa FtsZ kesik ile SepF hiçbir cosedimentation vardı, tepkime tampon-at pH 7.5 terkibiydi. Gündoğdu et al. SepF fonksiyonel değildir ve pH 6.5 &#39;de görülen cosedimentation FtsZ Δ16 arasında C-terminal kesik ile SepF çökelmesi yerine etkileşimin neden olması muhtemel olduğunu gösteren, pH 6.5 7 çökeltilerini kaydetti. FtsZ polimerizasyonu pH ve KCl konsantrasyonunun etkisi daha önce incelenmiştir. E. polimerleri pH 6.5 coli FtsZ (FtsZ Ec) daha uzun ve daha bol nötr pH 8,9 oluşmuş daha vardır. Tadros et al. K + bağlayıcı FtsZ Ec polimerizasyonu ile bağlantılı ve FtsZ aktivitesi 10 için çok önemli olduğunu belirterek tek değerli katyonların mevcudiyetinde FtsZ Ec polimerizasyonunu inceledik. PH daha critica olduğuSepF önceki örnek ve FtsZ 11 MINC inhibitör etkisinin pH bağımlılığı ile gösterildiği gibi diğer proteinler ile FtsZ etkileşimi, incelenmiştir l. PH ve tuz konsantrasyonu hem de diğer proteinler ile FtsZ etkileşimini etkileyebilir gibi, bu FtsZ polimerizasyon çalışmaları için doğru koşulları ve kontrolleri seçmek önemlidir. Burada ışık saçılması, elektron mikroskobu, sedimantasyon ve GTPaz deneyleri ile FtsZ polimerizasyonu ve GTPaz aktivitesini incelemek için protokolleri açıklanmıştır. Sağ açılı ışık dağılımı gerçek zamanlı 12 FtsZ polimerizasyon okumak için standart bir yöntemdir. Biz sedimantasyon ve GTPaz tahlil için birkaç iyileştirmeler tanıttı. Biz ışık saçılması ve elektron mikroskobu için numune hazırlamak için nasıl ayrıntılı olarak mevcut. FtsZ polimerizasyonu çalışma literatürde kullanılan çeşitli tamponlar test ve her deney için en iyi şartları tarif edilmiştir. Biz de olmalıdır kontrol eden göstermeken iyi veri elde etmek tanıttı. Bu yöntemler FtsZ polimerizasyon aktivitesi ve basit bir yöntem ve en laboratuvarlarda mevcuttur ekipman kullanılarak başka proteinlerle etkileşim hızlı bir çalışma sağlar. FtsZ polimerizasyonu incelemek için daha sofistike yöntemler var ama genellikle floresan etiketleri 8,13,14 ile daha özel ekipmana erişim ve / veya FtsZ değiştirilmesini gerektirir. Bu yazıda anlatılan basit yöntemler B. FtsZ kullanılarak gösterilmektedir subtilis ve E. coli, en yaygın Gram + ve Gram-model organizmalar. Protokoller başka FtsZ proteine ​​uyarlanabilir. Bu yeni FtsZs, zaman ile ilgili olarak küçük değişiklikler, tampon veya inkübasyon sıcaklığı ile ön deneylere dayalı olarak bir optimum bir sonuç için gerekli olabilir. Burada açıklanan deneyler bu en uygun koşulları bulmakta yardımcı olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>GTP</td><td>Roche</td><td>10106399001</td><td>Bölüm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7</td></tr><tr><td>Kalın Duvar Polikarbonat Tüpler</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td>Bölüm 2</td></tr><tr><td>Optima MAX-XP Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td>Bölüm 2, 3</td></tr><tr><td>Geçmeli Kapaklı Poliallomer Tüp</td><td>Beckman Coulter</td><td>357448</td><td>Bölüm 3</td></tr><tr><td>AIDA Biyo-paket, 1D, 2D, FL</td><td>Işın Testi İzotopenmessger&auml; te GmbH</td><td>15000001</td><td>Bölüm 4</td></tr><tr><td>Lüminesans Görüntü Analiz Cihazı LAS-4000</td><td>Fujifilm</td><td></td><td>Bölüm 4</td></tr><tr><td>Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Lüminesans Spektrometresi</td><td>Spectronic Instruments</td><td></td><td>Bölüm 5</td></tr><tr><td>Floresan Hücre</td><td>Hellma Analytics</td><td>105-250-15-40</td><td>Bölüm 5</td></tr><tr><td>Kare 400 Mesh, Bakır, 100/flakon</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>G400-Cu</td><td>Bölüm 6</td></tr><tr><td>CM120 Elektron Mikroskobu 120 kV'da Çalışıyor</td><td>Philips</td><td></td><td>Bölüm 6</td></tr><tr><td>96 ml x 0.2 ml Plaka</td><td>BIOplastics</td><td>B70501</td><td>Bölüm 7</td></tr><tr><td>Malakit Yeşil Fosfat Test Kiti</td><td>BiyoTest Sistemi</td><td>POMG-25H</td><td>Bölüm 7</td></tr><tr><td>PowerWave HT Mikroplaka Spektrofotometresi</td><td>BioTek</td><td></td><td>Bölüm 7</td></tr></tbody></table>

ftsz polimerizasyon tahliller: basit protokoller ve düşünceler

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

Bakteriyel hücre bölünmesi esnasında, esas teşkil eden protein FtsZ sözde Z-halka oluşturmak için hücre ortasında toplanır. FtsZ in vitro GTP varlığında, uzun lifler halinde polimerize ve polimerizasyon çeşitli aksesuar proteinler tarafından düzenlenir. FtsZ polimerizasyon yaygın ışık saçılımı, sedimantasyon, GTP hidroliz deneyleri ve elektron mikroskopi dahil olmak üzere temel yöntemler kullanılarak in vitro incelenmiştir. Tampon koşullar etkisi de her iki FtsZ polimerizasyon özellikleri ve düzenleyici proteinlerle etkileşime FtsZ yeteneği. Burada, biz FtsZ polimerizasyon çalışmalar için protokol tanımlamak ve model proteinler olarak Escherichia coli ve Bacillus subtilis FtsZ kullanarak koşulları ve denetimleri doğrulamak. Bir düşük hızlı çökelme tahlili FtsZ polimerleri paket ya tubulate proteinlerle FtsZ etkileşimi çalışma sağlayan sokulur. Geliştirilmiş bir GTPaz deney protokolü test edilmesine olanak tarif edilmektedirfosfat saptama tepki olarak renk gelişimi varyasyonu kaldırılması standart enkübasyon süreleri ile 96 oyuklu bir plaka kurulumu, çeşitli koşullar kullanılarak, zaman içinde GTP hidrolizinin. Işık saçılması çalışmaları ve elektron mikroskopisi için numunelerin hazırlanması tarif edilmektedir. Çeşitli tamponlar FtsZ polimerizasyon çalışmalar için uygun tampon ve pH, tuz konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır. KCl yüksek bir konsantrasyonu, deneylerin büyük bir kısmında en iyisidir. Bizim yöntemleri E. değil sadece FtsZ in vitro karakterizasyonu için bir başlangıç ​​noktası sağlar coli ve B. subtilis ama başka bir bakteriden. Bu nedenle, bu buluşun metodları düzenleyici proteinler veya FtsZ polimerizasyonu etkileyen antibakteriyel ilaçların test ile FtsZ etkileşimi çalışmaları için kullanılabilir.

Farklı bakteriyel kaynaklardan FtsZ saflaştırması literatürde tanımlanmıştır ve Tablo 1'de özetlenmiştir.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lütfen çevirmemi istediğiniz kaynak metni sağlayın. Metni gönderdiğiniz anda belirtmiş olduğunuz profesyonel akademik standartlar, bilimsel terminoloji ve JoVE formatına uygun şekilde Türkçe çevirisini gerçekleştireceğim.</td>
			<td>Yöntem</td>
			<td>Modifikasyon</td>
			<td>Elde edilen verim [kültürün L başına mg'ı]&gt;</td>
			<td>Kaynaklar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. subtilis</td>
			<td>1) Amonyum sülfat çöktürme/iyon değişim kromatografisi</td>
			<td>Hayır</td>
			<td>40</td>
			<td>Bu çalışma, 11,15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Afinite kromatografisi</td>
			<td>His-etiketi</td>
			<td>Belirlenemedi</td>
			<td>17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>1) Amonyum sülfat çöktürme/iyon değişim kromatografisi</td>
			<td>hayır</td>
			<td>35</td>
			<td>Bu çalışma, 11,15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Kalsiyum çöktürme, iyon değişim kromatografisi</td>
			<td>Hayır</td>
			<td>40</td>
			<td>18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanococcus jannaschii</td>
			<td>1) Denatüre edici koşullar altında afinite kromatografisi/yeniden katlanma/amonyum sülfat çöktürme/jel filtrasyonu</td>
			<td>His-etiketi</td>
			<td>1.3</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Affinite kromatografisi/ jel filtrasyonu</td>
			<td>His-etiketi</td>
			<td>ND</td>
			<td>20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermotoga maritima</td>
			<td>İyon değişim kromatografisi/jel filtrasyon</td>
			<td>Hayır</td>
			<td>6.7</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td>Affinite kromatografisi/jel filtrasyonu</td>
			<td>Strep-tag, His-tag</td>
			<td>Saptanmadı</td>
			<td>21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis</td>
			<td>1) Afinite/iyon değişim kromatografisi</td>
			<td>hayır</td>
			<td>ND</td>
			<td>22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2) Afinite kromatografisi/ jel filtrasyonu</td>
			<td>hayır</td>
			<td>30</td>
			<td>23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquifex aeolicus</td>
			<td>Affinite kromatografisi/jel filtrasyonu</td>
			<td>His-tag, C-terminal trunkasyonu (331-367)</td>
			<td>ND</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caulobacter crescentus</td>
			<td>İyon değişim kromatografisi/amonyum sülfat çöktürme/jel filtrasyonu</td>
			<td>hayır</td>
			<td>Saptanamadı</td>
			<td>25</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1. Açıklanan FtsZ saflaştırma protokolleri. ND: belirlenmedi.
FtsZ polimerlerinin çöktürülmesi
Başlangıçta, FtsZ polimerlerini çöktürmek için iki farklı hız kullandık. Sadece 350,000 x g hızda tekil FtsZEc polimerlerinin çöktüğünü (Şekil 1), buna karşın 190,000 x g hızda pellet fraksiyonunda yalnızca FtsZBs demetlerinin bulunduğunu saptadık (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, sonraki deneylerimizde 350,000 x g kullanılmıştır. Işık saçılım deneyleri FtsZBs için çok daha yüksek bir saçılım sinyali ortaya koymasına rağmen, 50 mM KCl konsantrasyonunda polimerize olan FtsZEc ve FtsZBs yüzdeleri benzerdir. Bu durum, FtsZBs tarafından oluşturulan ve tekil FtsZEc polimerlerine göre daha fazla ışık saçan demetlerden kaynaklanmaktadır. Hem FtsZEc hem de FtsZBs için 300 mM KCl ile yapılan deneyde, pellet fraksiyonunda yüksek miktarda FtsZ polimeri elde etmek mümkün olmamıştır (Şekil 1). Bunu, FtsZ yapılarının hızlı parçalanması ve filamentlerin demetlenme oranının azalmasının bir kombinasyonuna bağlıyoruz.
FtsZ-SepF tübüllerinin çöktürülmesi
FtsZ'nin belirli aktivatörlerle olan etkileşimini analiz etmek için daha düşük santrifüj hızlarında sedimentasyon analizleri gerçekleştirilebilir. Bu hızda yalnızca büyük FtsZ yapıları çöktürülebilir, örneğin SepF halkaları ve FtsZBs filamentleri tarafından oluşturulan büyük tübüller5 veya FtsZ ve ZapA tarafından oluşturulan demetler. FtsZ ve SepF tarafından oluşturulan tübüller için bu yaklaşımın uygulanabilirliğini göstermek amacıyla daha düşük santrifüj (24.600 x g) kullandık. FtsZ, ancak örnekte hem SepF hem de GTP mevcut olduğunda arka plan seviyelerinin üzerinde çökelekten geri kazanılmıştır (Şekil 2) ve SepF'nin varlığı FtsZ GTPaz aktivitesini etkilemez7; bu da FtsZ'nin SepF varlığında tam aktif olduğunu göstermektedir. SepF ve FtsZ'nin spesifik sedimentasyonu, toplam SepF'nin yaklaşık %45'i ve toplam FtsZ'nin %15'idir (GDP eklendiğinde çöken materyalle karşılaştırıldığında). Bu durum, SepF-FtsZ tübüllerinin FtsZ'den daha fazla SepF içerdiğini göstermektedir. Bunun nedeni, birçok SepF halkasının FtsZ-SepF tübüllerini organize etmesi olabilir5,7. Bu tübüllerdeki SepF-FtsZ'nin kesin stokiyometrisi bilinmemektedir ancak sonuçlarımız FtsZ'den daha fazla SepF bulunduğunu göstermektedir.
FtsZEc ve FtsZBs polimerizasyon ve demetleme özellikleri
FtsZBs ve FtsZEc proteinlerinin farklı tamponlardaki polimerizasyon verimliliğini karakterize etmek için her iki proteini de 90° açılı ışık saçılımı ile analiz ettik. 50 mM KCl konsantrasyonunda, tampon pH'ına bağlı olarak FtsZBs, FtsZEc'den 20-40 kat daha yüksek ışık saçılım sinyali vermiştir (Şekil 3A ve B), bu da Buske et al.26 tarafından elde edilen sonuçları doğrulamaktadır. Tampondaki KCl konsantrasyonunun artırılması, FtsZEc'nin ışık saçılım sinyalini önemli ölçüde etkilemezken (Şekil 3D), 50 mM KCl içeren tamponlarla (Şekil 3A) karşılaştırıldığında 300 mM KCl'de FtsZBs sinyali pH 7,5'te ~80 kat, pH 6,8'de ~30 kat ve pH 6,5'te ~45 kat azalmıştır (Şekil 3C). Her iki protein için de FtsZ polimerlerinin çözünmesi, daha yüksek KCl konsantrasyonunda daha hızlı gerçekleşmektedir (Şekil 3C ve D). Pacheco-Gómez et al. tarafından yapılan çalışmalar, E. coli FtsZ polimerizasyonunun ve demetlenmesinin pH'a bağımlı olduğunu göstermektedir. Söz konusu yazarlar, 50 mM KCl içeren bir tamponda, pH 6,0'da FtsZ polimerizasyonunun ışık saçılım sinyalinin pH 7,0'a kıyasla daha yüksek olduğunu ve FtsZ'nin çözünmesinin daha uzun sürdüğünü tespit etmişlerdir 8. Bu sonuçlar, 50 mM KCl'deki FtsZEc polimerizasyonuna ait verilerimizle (Şekil 3B) uyumlu değildir; ancak Pacheco-Gómez et al. sadece MES kullanırken bizim üç farklı tampon (HEPES, MES ve PIPES) kullandığımız belirtilmelidir. Dolayısıyla, 50 mM KCl'de FtsZ polimerlerinin kinetiğini sadece pH değil, aynı zamanda tampon bileşimi (iyonik şiddet) de etkilemektedir. Bununla birlikte, 300 mM KCl'de ne tampon bileşimi ne de pH, FtsZEc montajını tespit edilebilir düzeyde etkilememiştir.
KCl içermeyen tamponlarda FtsZBs ile yapılan bir ışık saçılım deneyi, proteinin bu koşullar altında çökmesi nedeniyle mümkün olmamıştır. FtsZBs konsantrasyonu 3 µM'ye düşürüldüğünde çökelme meydana gelmemiştir. Ancak 3 µM, hücredeki FtsZ'nin fizyolojik konsantrasyonu değildir. Plastik küvetlerde, pH 7,5'te 12 µM FtsZBs çökelme göstermemiş, ancak pH 6,8 ve 6,5'te KCl yokluğunda FtsZ hala çökelmiştir.
E. coli ve B. subtilis kaynaklı FtsZ yapılarının morfolojileri
FtsZ tarafından oluşturulan yapılar TEM ile incelendi. Düşük tuz konsantrasyonundaki tüm tamponlarda FtsZBs, tüm ızgarayı kaplayan sıkıca paketlenmiş polimerler oluşturdu (Şekil 4A-C). FtsZEc ise düşük tuz konsantrasyonundaki tüm tamponlarda uzun filamentler, kablolar ve demetler oluşturdu (Şekil 4D-F). Ancak, FtsZEc tarafından oluşturulan gözlemlenebilir polimer miktarı, FtsZBs tarafından oluşturulan miktardan daha düşüktü. Yüksek tuzlu tamponlarda FtsZBs, demetler oluşturmayan daha uzun tek zincirli protofilamentler oluşturdu (Şekil 4G-I). FtsZBs protofilamentleri yüksek tuz konsantrasyonunda yapı değiştirirken, FtsZEc düşük tuzlu tamponlardakinden ayırt edilemeyen yapılar oluşturdu (Şekil 4J-L). FtsZEc polimerizasyonu üzerinde gözlemlenebilir bir pH etkisi yoktu; ancak FtsZBs, pH 6,5'te sıkıca paketlenmiş polimerler ve tabakalar şeklinde görülen daha fazla demet oluşturdu (Şekil 4B). Bu sonuçlar, ışık saçılma deneylerimizle ve daha önce yayınlanmış TEM çalışmalarıyla8,11,26 uyumludur.
Yüksek ve düşük KCl konsantrasyonlarında FtsZ'nin GTPaz aktivitesi
FtsZ'nin GTP hidroliz aktivitesi, serbest fosfat için kolorimetrik bir analiz kullanılarak farklı koşullar altında ölçülmüştür. Daha önce bildirildiği üzere15 FtsZ'nin GTPaz aktivitesi, KCl konsantrasyonu arttıkça artmıştır: kullanılan tampona bağlı olarak, 300 mM KCl'de, 50 mM KCl ile karşılaştırıldığında FtsZBs 3-7 kat, FtsZEc ise 1,5-2,5 kat GTPaz aktivitesi artışı göstermiştir. 50 mM KCl'deki düşük GTPaz aktivitesi, FtsZBs filamentlerinin demetlenmesinden kaynaklanmaktadır. 50 mM KCl'de, FtsZEc polimerlerinin daha hızlı sökülmesi nedeniyle FtsZEc, FtsZBs'den 3-6 kat daha yüksek GTPaz aktivitesine sahipti. FtsZBs ve FtsZEc arasındaki GTP hidroliz aktivitesi farkı, muhtemelen FtsZBs filamentlerinin daha az demetlenmesi nedeniyle 300 mM KCl'de azalmıştır (Şekil 5).
<img alt="FtsZ polimerizasyonu, % pelet analizi, sütun grafiği, jel elektroforezi, GTP/GDP etki karşılaştırması." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig1.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1. FtsZ polimerizasyonunun sedimentasyon ile nicelendirilmesi.(A) 12 µM FtsZ, pH 7.5 (siyah sütunlar), 6.8 (gri sütunlar) veya 6.5 (beyaz sütunlar) değerlerinde 2 mM GTP veya GDP varlığında polimerize edilmiştir. Peletlenen protein miktarı, Coomassie ile boyanmış jellerin densitometrik analizi ile belirlenmiştir. GDP, spesifik sedimentasyon için kontrol olarak kullanılmış ve grafikte çizilen değerleri elde etmek için GDP ile sedimente olan FtsZ yüzdesi, GTP ile sedimente olan FtsZ yüzdesinden çıkarılmıştır. Solda: 50 mM KCl'de sedimente olan FtsZ, sağda: 300 mM KCl'de sedimente olan FtsZ. (B) Coomassie ile boyanmış jellerden elde edilen temsili sonuçlar. 50 mM KCl'de FtsZBs (üst jel) ve FtsZEc (alt jel) polimerizasyonu. (S) süpernatant, (P) deneyden elde edilen pelet fraksiyonları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig1highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın</a>.
<img alt="FtsZ ve SepF etkileşim grafiği ve GTP/GDP'nin protein pelet yüzdesi üzerindeki etkisini gösteren jel." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig2.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 2"> 
Şekil 2. SepF/FtsZ tübüllerinin düşük hızda sedimentasyonu. (A) 12 µM FtsZBs, 2 mM GDP (beyaz çubuklar) veya GTP (siyah çubuklar) ile polimerize edilmiştir. Peletlenen protein miktarı, Coomassie ile boyanmış jellerin densitometrik analizi ile belirlenmiştir. x-ekseninin altındaki + ve - işaretleri, reaksiyonda FtsZ ve SepF'nin varlığını veya yokluğunu belirtir. (B) Coomassie ile boyanmış bir jelden elde edilen temsili sonuçlar. SepF varlığında ve yokluğunda FtsZBs polimerizasyonu. Kontrol olarak FtsZ içermeyen SepF kullanılmıştır. Polimerizasyon GTP ve GDP ile gerçekleştirilmiştir. (S) süpernatant, (P) deneyden elde edilen pelet fraksiyonları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig2highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın</a>.
<img alt="KCl konsantrasyonlarına göre FtsZ ışık saçılma grafikleri; 6,5, 6,8, 7,5 pH etkilerini göstermektedir." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig3.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 3"> 
Şekil 3. 12 μM FtsZEc ve 12 μM FtsZBs ışık saçılımı. FtsZ'ler 2 mM GTP varlığında birleştirilmiş ve polimerizasyon 90° açılı ışık saçılımı ile izlenmiştir. pH 7,5, pH 6,8 ve pH 6,5 değerlerinde 50 mM KCl ile FtsZBs (A) ve FtsZEc (B) polimerizasyonu. pH 7,5, pH 6,8 ve pH 6,5 değerlerinde 300 mM KCl ile FtsZBs (C) ve FtsZEc (D) polimerizasyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig3highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın</a>.
<img alt="Değişen pH ve KCl konsantrasyonlarında FtsZ polimerlerinin elektron mikroskopisi; yapısal analiz." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig4.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 4"> 
Şekil 4. Elektron mikroskopisi ile görüntülenen FtsZBs ve FtsZEc polimerlerinin yapıları. (A-L) 2 mM GTP ile polimerize edilmiş 12 µM FtsZBs (A-C ve G-I) ve FtsZEc (D-F) ile (J-L) görüntüleri. (A-C) Sırasıyla 50 mM KCl ve pH 7.5, 6.8 ve 6.5 içeren tampon içindeki FtsZBs. (D-F) Sırasıyla 50 mM KCl ve pH 7.5, 6.8 ve 6.5 içeren tampon içindeki FtsZEc. (G-I) Sırasıyla 300 mM KCl ve pH 7.5, 6.8 ve 6.5 içeren tampon içindeki FtsZBs. (J-L) Sırasıyla 300 mM KCl ve pH 7.5, 6.8 ve 6.5 içeren tampon içindeki FtsZEc. Ölçek çubuğu: 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig4highres.jpg" target="_blank">Daha büyük görüntüyü görmek için buraya tıklayın</a>.
<img alt="GTPaz aktivitesi grafiği; 50mM'e karşı 300mM KCl'de FtsZ'nin sütun grafiği, pH varyasyonları 7,5, 6,8, 6,5." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig5.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 5"> 
Şekil 5. 6 farklı tamponda FtsZ polimerizasyonu sırasında GTP hidrolizi. Tüm deneylerde 2 mM GTP kullanılmıştır. Kontrol olarak MgCl2 içermeyen bir örnek kullanılmıştır. MgCl2 içermeyen FtsZ'nin aktivitesi, MgCl2 varlığındaki FtsZ aktivitesinden çıkarılmıştır. Solda: 50 mM KCl'de FtsZ'nin GTPaz aktivitesi, sağda: 300 mM KCl'de FtsZ'nin GTPaz aktivitesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig5highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın</a>.

FtsZ'nin polimerizasyonu bakteri hücre bölünmesi için gereklidir. Bu raporda, FtsZ polimerizasyon aktivitesini izlemek ve tampon bileşiminin etkisini tartışmak için basit protokolleri detaylandırıyoruz. Protokoller, FtsZ'nin FtsZ polimerizasyonunu etkileyen düzenleyici proteinler veya antibakteriyel ilaçlarla etkileşimini incelemek için kullanılabilir.

FtsZ Polimerizasyon Tahliller: Basit Protokoller ve Düşünceler

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, basit tahliller ve ekipman kullanarak FTSZ, polimerizasyon ve aktiviteyi incelemek için uygun koşulları belirlemektir. Bu, FDSZ'nin polimerize olduğu uygun koşulları bulmak için çeşitli koşullar altında FDSC polimer sedimantasyon deneyleri yapılarak elde edilir. İkinci adım olarak, FDSZ polimerizasyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için ışık saçılma testleri gerçekleştiriyoruz.Daha sonra, FT SC'nin polimerizasyonla ilişkili g gtpa aktivitesini belirlemek için GTP hidroliz testleri gerçekleştiriyoruz. Sedimantasyon, ışık saçılımı ve GTP hidrolizine dayalı olarak belirli bir bakteri kaynağının FTSC'sinin incelenmesi için hangi koşulların en uygun olduğunu gösteren sonuçlar elde edilir. Burada gösterilen tekniğin herhangi bir laboratuvarda uygulanması kolaydır ve belirli FT a z'nin polimerizasyon yetenekleri hakkında hızlı bir fikir verecektir. Laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan EVA taraması olacağını gösteren diğer proteinlerin varlığında FTAZ ile çalışırken doğru tampon seçiminin özellikle önemli olduğunu bulduk.Başlamak için, beş mikrolitre 100 milimolar magnezyum klorür ve 12 mikromolar bakteri proteini, FDSC ve/veya SEP F'yi, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi çeşitli pH değerlerine ve bileşimlere sahip seçilen polimerizasyon tamponlarından birine ekleyin. Daha sonra, tüpleri çalkalama işlevine sahip bir inkübatöre yerleştirin ve numuneleri 30 santigrat derece ve 300 RPM'de iki dakika inkübe edin. Tüpler iyice karıştırıldıktan sonra, nihai konsantrasyon iki milimolar olacak şekilde 100 milimolar stok çözeltisinden bir mikrolitre GTP veya GDP karışımı ekleyerek polimerizasyona başlayın.Ardından numuneleri 20 dakika daha çalkalama inkübatörüne geri koyun. Daha sonra, tüpleri bir TLA 55 rotor veya başka bir şey kullanıyorsanız eşdeğer bir 24.600 Gs kullanarak 20.000 RPM'de 15 dakika boyunca döndürün. Santrifüj bittiğinde, süpernatanları temiz tüplere aktarın ve peletleri daha sonrası için saklayın.Aktarılan süpernatantlardan 20 mikrolitre alın ve bunları 20 mikrolitre iki kez konsantre numune tamponu ile ayrı bir tüpte karıştırın. Kapakları sabitleyin ve numuneleri 98 santigrat derecede 10 dakika kaynatın. Daha sonra, daha önce bir kenara bırakılan her bir pelet fraksiyonuna 50 mikrolitre iki kez konsantre numune tamponu ekleyin ve numuneleri 98 santigrat derecede 10 dakika kaynatarak polimerleri askıya alın.Numunelerin kaynaması bittiğinde, peletleri içeren tüplere 50 mikrolitre daha demineralize su ekleyin. Daha sonra, her bir numuneden hem süpernatanlardan hem de peletlerden 10 mikrolitreyi %10'luk bir SDS sayfa jeli üzerine yan yana yükleyin ve jeli 150 voltta çalıştırın. Jel tamamlandığında, jeli çıkarın ve kumasi brilliant blue G two 50 ile boyayın.Daha sonra jeli görüntüleyin ve ekteki metin protokolünde tarif edildiği gibi sitometri kullanarak proteini nicelleştirin. Önce bir floresan spektrometreyi açın ve termal dalgalanmaları önlemek için lambanın birkaç dakika ısınmasına izin verin. Ayrıca, dolaşan bir su banyosunu açın ve vete odasını sabit bir sıcaklıkta tutmak için su sıcaklığını 30 santigrat dereceye ayarlayın.Sistem ısınırken, spektrometrenin çalışma parametrelerini tanımlayın. Dedektörün yüksek voltajını 300 volta ve emisyon ve uyarma dalga boylarını dört nanometre yarık genişliğinde 350 nanometreye ayarlayın. Ardından, 3.600 saniye süreli zamana dayalı bir edinme seçerek veri toplama protokolünü programlayın.Bir santimetre yol uzunluğuna sahip 200 mikrolitrelik bir floresan damarı, bir su banyosunda beş dakika boyunca bir temizleme solüsyonunda zina yaparak dikkatlice temizleyin. Daha sonra, beraberindeki metin protokolünde açıklanan dokuz polimerizasyon tamponunun her biri için, her biri 10 milimolar magnezyum klorür ve 300 mikrolitre için hesaplanan nihai konsantrasyonlar olarak 12 mikromolar FDSE içeren 294 mikrolitre bir ana karışım hazırlayın. Daha sonra karışımları kısaca girdaplayın, ilk polimerizasyon tamponunun 196 mikrolitresini veterinere aktarın.Spektrometreye yerleştirin ve numunenin sıcaklığını 30 santigrat dereceye çıkarmak için iki dakika inkübe edin. İki dakika sonra veri alımını başlatın ve sinyalin kararlı olduğunu doğrulamak için 90 saniye bekleyin. Sonra dört mikrolitre 100 milimolar GTP veya GSYİH ekleyin.Örneği karıştırın ve tam bir saat boyunca veri toplamaya devam edin. Listelenen her arabellek için bu adımları yineleyin. Seçilen bir polimerizasyon tamponunda 1.5 mililitre iki milimolar GTP hazırlayın.Ayrıca aynı tamponda sıfır ila 40 mikromolar aralıkta bir fosfat standart seyreltmesi hazırlayın. Ardından, biyotahlil kitinde açıklandığı gibi malakit yeşili çalışma reaktifini hazırlayın. Daha sonra, her biri 360 mikrolitre toplam hacme sahip dört ana karışım oluşturun: ana karışım biri B subtilis'ten türetilen FDSZ içerir ve ana karışım iki, e coli'den türetilen FDSE içerir.Ana karışımlar üç ve dört, kontrol olarak kullanılır ve magnezyum klorür yerine EDTA içerir. Daha sonra ana karışımların ve fosfat standartlarının 20 mikrolitrelik pipetini pipetleyin. A-Q-P-C-R 96 kuyulu plakada, her bir ana karışım için 16 kuyu olacak şekilde ve fosfat standartları burada gösterildiği gibi düzenlenmiştir.180 mikrolitre iki milimolar GTP stoğunu plakanın son şeridine pipetleyin. Ardından plakayı bir PCR makinesine yerleştirin. 40 dakika boyunca 30 santigrat dereceye ayarlanmış tek bir döngüye sahip bir program çalıştırın.İkinci bir 96 oyuklu plaka pipetinde, malakit yeşili çalışma reaktifinin 20 mikrolitrelik alikotları, A'dan H 10'a kadar olan kuyulara. Daha sonra, deneyden elde edilen polimerizasyon tamponunun 60 mikrolitresinde, A'nın bir ila H sekiz, daha sonra iki milimolar GTP çözeltisinin 20 mikrolitresinde plakanın her bir şeridindeki kuyucuklara doğru olduğunu iddia eder. Çeşitli zaman noktalarında reaksiyonu incelemek için burada gösterildiği gibi önceden belirlenmiş aralıklarla bir tane.Karışımları 30 dakika sonra karıştırmak için yukarı ve aşağı sıkın, birinci şeritten başlayarak birinci şeritten başlayarak, 20 mikrolitreyi birinci plakanın birinci şeridinden ikinci şeridin birinci şeridine aktarın ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Bu, 30 buçuk dakika sonra 30 dakikalık reaksiyon için malakit yeşili renk gelişiminin başlangıç noktasıdır, 20 mikrolitreyi birinci plakanın ikinci şeridinden ikinci plakanın ikinci şeridine aktarın ve karıştırın. Bu, 20 dakikalık reaksiyon için malakit yeşili renk gelişiminin başlangıç noktasıdır.Bu adımları, 33 buçuk dakika sonra 20 mikrolitre GTP'de 32. aralıklarla kalan şeritler üç ila yedi olacak şekilde tekrarlayın ve birinci plakadaki sekizinci şeride geçin ve karıştırın. Daha sonra 20 mikrolitreyi ikinci plakadaki sekizinci şeride aktarın ve karıştırın. Bu, sıfır dakika reaksiyonunu temsil eder ve malakit yeşili renk gelişimi için başlangıç zaman noktasıdır.34 dakika sonra, fosfat standardını içeren birinci plakanın dokuzuncu şeridinden 80 mikrolitreyi ikinci plakanın dokuzuncu şeridine ekleyin ve 34 buçuk dakika sonra karıştırın, birinci plakanın 10. şeridindeki ikinci fosfat standardından 80 mikrolitreyi ikinci plakanın 10. şeridine aktarın ve karıştırın. Daha sonra numunelerdeki tüm hava kabarcıklarını çıkarın ve plakayı oda sıcaklığında 25 buçuk dakika daha inkübe edin. Kuluçka sonrası.Plakayı, deneyin başlangıcından itibaren 96 dakikadan başlayarak 60 kuyulu bir plaka okuyucuya yerleştirin. Plakayı beş dakika boyunca her 30 saniyede bir 630 nanometrede ölçün, böylece 10 zaman noktası alınır. İlk plaka ölçümü birinci şeride karşılık gelecektir, ikincisi ikinci şeride karşılık gelecektir ve böylece her şerit malakit yeşili renginin gelişmesi için tam olarak aynı zamana sahip olacaktır.Ardından, fosfat standart kalibrasyon eğrisini kullanarak her numunedeki serbest fosfatı hesaplayın ve verileri zaman içinde fosfat salınımı olarak çizin. Ardından eğrinin doğrusal aralığından F-D-S-Z-G-T-P hidroliz aktivitesini hesaplayın. Burada, numunelerin peletlerindeki SEP F ve FDSZ'nin yüzdesi gösterilmektedir.FDSZ, pelette arka plan seviyelerinin üzerinde, yalnızca numunede hem SEP F hem de GTP mevcut olduğunda geri kazanıldı. Bu tübüllerde SEPPE ve FDSZ'nin kesin stokiyometrisi bilinmemektedir, ancak bu sonuçlar FDSZ'den daha fazla SEPPE bulunduğunu göstermektedir. FDSZ'nin B subtilis ve e coli'den ışık saçılması, 50 milimolar potasyum klorür tamponunda iki milimolar GTP varlığında birleştirilerek burada gösterilmiştir.F-D-S-E-B-S, tampon pH'ına bağlı olarak FDSC EC'den 20 ila 40 kat daha yüksek ışık saçılma sinyali verir. İlginç bir şekilde, tampondaki potasyum klorür konsantrasyonunun arttırılması, F-D-S-Z-E-C'nin ışık saçılma sinyalini önemli ölçüde etkilemedi, ancak F-T-S-Z-B-S sinyali, pH 7.5'te yaklaşık 80 kat, pH 6.8'de 30 kat ve 300 milimolar potasyum klorürde pH 6.5'te 45 kat, 50 milimolar potasyum klorürlü tamponlara kıyasla. FDSZ'nin GTP hidroliz aktivitesi, serbest fosfat için kolorimetrik bir test kullanılarak farklı tampon koşulları altında ölçüldü.FT SZ'nin GTPS aktivitesinin, farklı pH koşullarının her birinde artan potasyum klorür konsantrasyonu ile arttığı bulunmuştur. 50 milimolar potasyum klorürde, 50 milimolar'da F-D-S-Z-B-S filamentlerinin demetlenmesi nedeniyle gtpa aktivitesi azaldı. Potasyum klorür FDSZ EEC, FDSC EEC polimerlerinin daha hızlı sökülmesi nedeniyle F-D-S-Z-B-S'den üç ila altı kat daha yüksek GTPS aktivitesine sahipti.Son olarak, F-D-S-Z-B-S ve F-D-S-Z-E-C arasındaki GTP hidroliz aktivitesindeki fark, muhtemelen F-D-S-Z-B-S filamentlerinin demetlenmesinin azalması nedeniyle 300 milimolar potasyum klorürde azaltılmıştır. Bu prosedürü takiben, numunedeki fts polimerlerinin yapısıyla ilgili ek soruları yanıtlamak için elektromikroskopi gibi diğer metaller de gerçekleştirilebilir.

ftsz-polymerization-assays-simple-protocols-and-considerations

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Oligonükleotid çiftli florasan boncuklar kullanarak bir örnek içinde mikroorganizmaların tespiti için çoklama yöntemi açıklar. Bir örnek içindeki tüm organizmalar Amplikon bir panel prob-çiftli boncuk melezleşmiştir. LUMINEX veya Bio-Plex enstrüman, boncuk, boncuk türü ve hibridizasyon sinyali için her bir sorgu için kullanılır.

Oligonükleotid çiftli Floresan Mikroküreler kullanarak Kompleksi Klinik ve Çevre Örneklerinde Bakterilerin Multiplex Algılama

Bir çip üzerinde fotopolimerizasyon tekniği kullanılarak bir polimer mikro oluşumu açıklaması. Atomik kuvvet mikroskobu, temas açısı ölçümleri, X-ışını fotoelektron spektroskopisi ve uçuş ikincil iyon kütle spektrometresi ve hücre bağlanma testinin zaman kullanarak yüksek aktarım yüzey karakterizasyonu da açıklanmıştır.

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

PCR birçok moleküler biyoloji laboratuvarlarında yaygın bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Pek çok geleneksel PCR protokolleri için hızlı bir kılavuzdur burada sağlanan. Her bir reaksiyon benzersiz bir deneyde, bir ürün üretmek için gerekli değişir uygun koşullar olmasıdır. Bir reaksiyonla değişkenlerini anlama büyük ölçüde böylece istenilen sonucu elde etmek şansı artan giderme verimi artıracaktır.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Temel Protokol Plus, Sorun ve Optimizasyon Stratejileri

Burada tarif edilen protokol modifiye nükleosit trifosfat yol açan karmaşık güzergah yolunda çok sayıda engeller açıklamak ve kesintiye uğratmak için amaçlamaktadır. Dolayısıyla, bu protokol bu aktive bina bloklarının sentezini ve pratik uygulamalar için onların durumu hem de kolaylaştırır.

Nükleosid trifosfatlar - sentezinden Biyokimyasal Karakterizasyonu için

Bu iletişim kuralı DNA polimeraz yakın kızılötesi fluorescently etiketli DNA Jel Elektroforez ve jel görüntüleme kullanarak değişiklikleri gözlem yoluyla değiştirilmiş DNA sentezi karakterizasyonu açıklar. Akrilamid jelleri yüksek kararlılık düşsel boyutuna bağlı olarak farklı fiyatlara geçiş kısa nükleik asitler ayrılması için kullanılır.

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

Epigenetik belirteçler beyaz kan hücresi (WBC) DNA metilasyon desenleri nicelik selektib yoluyla subtyping için kullanılır. Bu protokol, WBC diferansiyel sayımlarının hassas ve çok katlı metilasyona özgü hedef nicelemesine olanak sağlayan damlacık üretimi için termoplastik elastomer (TPE) tabanlı mikroakışkan bir cihaz kullanılarak çok katlı damlacık polimeraz zincir reaksiyonu (mdPCR) yöntemi ni sunar.

Hematolojik Tanı için Polimer Damlacık Jeneratör Cihazı ile Metilasyona Özgü Multipleks Damlacık PCR

İyi karakterize edilmiş genetik parçalar, yeni genetik devrelerin tasarımı için gereklidir. Burada, genetik parçaları hızlı bir şekilde karakterize etmek için uygun maliyetli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz. Yöntemimiz, hücresiz lizatları, klonlamayı önlemek için lineer DNA'yı ve verimi artırmak ve reaksiyon hacimlerini azaltmak için akustik sıvı işlemeyi birleştirerek maliyeti ve zamanı azaltır.

Genetik Parçaların Hücresiz Sistemlerle Hızlı Karakterizasyonu

Merkezi olmayan testler için topluluğa dağıtılabilecek merkezi olmayan, düşük maliyetli ve yüksek kapasiteli tanılamaya erişim, küresel sağlık krizleriyle mücadelede kritik öneme sahiptir. Bu makale, taşınabilir bir optik okuyucu ile tespit edilebilen viral RNA dizileri için kağıt tabanlı teşhislerin nasıl oluşturulacağını açıklamaktadır.

Kağıt Tabanlı Toehold Anahtarı Tanılamanın Geliştirilmesi ve Hasta Doğrulaması için Tasarımdan Uygulamaya Çalışma

Oligonükleotid 5′-trifosfatlar, esansiyel biyolojik yollarda her yerde bulunan bileşenlerdir ve biyoteknoloji uygulamalarında artan kullanım görmüştür. Burada, standart otomatik sentez teknikleriyle hazırlanan oligonükleotidlerden başlayarak oligonükleotid 5′-trifosfatların rutin sentezi ve saflaştırılması için teknikleri açıklıyoruz.

Oligonükleotidlerin Kimyasal Trifosforilasyonu

Bu protokol, DNA polimerazlar ve G-dörtlü yapılar gibi engeller arasındaki etkileşimlerin gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlayan floresan mikroskobu tabanlı tek moleküllü DNA replikasyon testini ana hatlarıyla belirtir.

G-Dörtlülerinde DNA Polimeraz Dinamiğinin Tek Moleküllü Floresan Görselleştirmesi

Bu protokol, protein sentezinin doğal ürün/küçük molekül inhibitörlerini belirlemek için optimize edilmiş bir florometrik tarama metodolojisi tanıtmaktadır. Pratikliği, hem ilaç keşif teknikleri lisans eğitimi için hem de tıbbi kimya kampanyalarında uygulanması için uygun hale getirir.

Doğal Kaynaklardan Protein Sentezi İnhibitörlerinin Ön Taraması için Flüoresans Tabanlı Protokol

Keşfedin FtsZ polimerizasyonunu bakteri hücre bölünmesi araştırmaları için sedimentasyon, ışık saçılımı ve GTP hidroliz analizleri kullanarak. Bu yöntemler antibakteriyel ilaç geliştirme çalışmalarına katkı sağlar.

FtsZ Polimerizasyon Tahliller: Basit Protokoller ve Düşünceler

Daha fazla video keşfet