Tek hücreli Yara Şifa sırasında Sitoplazmik Akışı görselleştirme Stentor coeruleus

Bu prosedürün genel amacı, tek bir hücrede yara iyileşmesi sırasında sitoplazma akışını ölçmektir. Bu, hücresel yaralama için bir model sistem olarak kullanılmak üzere önce canlı stent veya SEIU hücrelerinin toplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, hücreleri kesmek için cam aletleri hazırlamaktır.

Daha sonra, stent sarius hücreleri, aynı anda düşük büyütmeli cerrahiye ve yüksek çözünürlüklü görüntülemeye izin veren özelleştirilmiş bir mikroskop kurulumunda kesilir. Son adım, parçacık görüntü velo simetri yazılımı kullanarak sitoplazmik akışın hesaplamalı analizini yapmaktır. Sonuç olarak, sitoplazmanın yüksek çözünürlüklü görüntülemesi, yara iyileşmesi sırasında hücrelerin aktif tepkisini göstermek için kullanılır.

Bu yöntem, çevredeki ortama sızıntıyı önlemek için sitoplazmanın bir kesi bölgesi etrafında jel benzeri hale gelip gelmediği gibi hücresel yara iyileşmesi ile ilgili temel soruları ele almak için kullanılabilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü hücre işleme aleti hazırlama ve kesme adımlarının öğrenilmesi manuel beceri gerektirdiğinden öğrenilmesi zordur. Tartar tarafından tarif edildiği gibi doğal ponstan veya ticari bir tedarikçiden stent veya Sirius hücreleri elde etmeye başlamak için, 300 mililitre modifiye stent veya tartar tariflerinden uyarlanmış ortam ekleyin ve ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi caydırın.

Kültürleri karanlıkta 20 santigrat derecede büyüterek koruyun. Daha sonra, tris asetat fosfat ortamında chlamydomonas Rhine Hardy alg kültürlerini büyütün. Beslenmeden önce standart kültür yöntemlerini kullanarak, klamidomonas hücrelerini nazikçe döndürerek, süpernatanı çıkararak ve modifiye edilmiş stent veya ortamda süspanse ederek yıkayın.

Gerektiğinde haftada iki veya üç kez 30 mililitre stent veya sarius kültürlerini yaklaşık 30 milyon chm hücre ile besleyin. Ameliyat için stent veya hücre toplayın. Başlamak için, hücreler ayrılmaya ve serbestçe yüzmeye başlayana kadar bir pipet ucundan hava köpürterek kültürü nazikçe çalkalayın.

Ardından, hücrelerin kesilmesini önlemek için geniş delikli bir uçla donatılmış bir mililitrelik bir pipet kullanarak yüzme hücrelerini yakalayın. Toplandıktan sonra hücrelerin yerleşmesine izin verin. Ardından, üzerlerindeki ortamı yavaşça pipetleyin ve yeni modifiye stent veya ortam ekleyin.

Stent hücrelerini kesmek için kullanılan cam iğneleri, iki cam karıştırma çubuğunu bol ve ocak üzerinde uçları eriyene kadar tutarak hazırlayın. Ardından, erimiş cam kaynaşana kadar iki çubuğun uçlarını birbirine dokundurun. Kaynaştıktan sonra alevden çıkarın ve bir ila iki saniye soğumaya bırakın.

Ardından temiz bir mola vermek için yavaşça ayırın. İdeal olarak, bu, sonunda ince bir nokta ile yaklaşık bir ila iki santimetre uzunluğunda bir iğne üretecektir. Ortaya çıkan iğne yetersiz ise, ucu cam bele kırın ve çubukları tekrar kullanın.

Daha sonra, bir cam kapak kızağına bastırarak kare Vazelin duvarlı bir oda hazırlamak için Vazelin ile kaplanmış kare bir lastik damga kullanın. Daha sonra Vazelin karesine 100 mikrolitre modifiye stent veya %2 metil selüloz içeren ortam ekleyin. Hazırlanan kapak fişini plastik bir adaptöre yerleştirin ve ardından yıkanmış stent hücrelerini kapak fişine ekleyin.

Son olarak, metil selülozdaki hücreleri, eşit aralıklarla yerleştirilecek ve görüntüleme sırasında odakta olacak şekilde kapak kaymasının yüzeyine yeterince yakın itilecek şekilde düzenleyin. Başlamak için, slaydı ters çevrilmiş mikroskobun sahnesine yerleştirin. Daha sonra diseksiyon mikroskobu gövdesini standından çıkarın ve slaytı üstten düşük büyütme ile görselleştirmek için yerleştirilmesi gereken yaklaşık konumu belirleyin.

Daha sonra, ters çevrilmiş mikroskobun göz merceği ile diseksiyon dürbünü arasına istenen boşluğa sahip bir karton kutu ekleyerek çift katlı bir mikroskop oluşturun. Kolayca çıkarılabilmesi için kutuyu laboratuvar bandı kullanarak yerine bantlayın Deney tamamlandığında, numunenin diseksiyon dürbününü hareket ettirmeye gerek kalmadan görüş alanında ve odakta olacağından emin olun Takıldıktan sonra, diseksiyon dürbününü kutuya karşı tutun ve laboratuvar bandı kullanarak kutunun üzerine bantlayın. Ardından, 20 x hava objektifini yerine koyarak DIC optiği kullanarak ters çevrilmiş mikroskobu kurun.

Ayrıca, mikrocerrahiyi yukarıdan gerçekleştirmek için yeterli alan sağlamak için uzun çalışma mesafeli bir DIC kondansatörü kullandığınızdan emin olun. Daha sonra hücreleri, her şey hazırlanmış ve her iki taraftan odakta olacak şekilde ters mikroskopla odak noktasına getirin. Beş adet 12'ye beş 12 CCD kamera kullanarak saniyede iki görüntü kare hızında görüntü elde etmeye başlayın.

Ardından cam iğneyi kullanarak hücreyi kesin. İlk sitoplazmik akış modelini yakalayın ve yara ve yara iyileşme sürecinin tüm aşamalarını gözlemleyin. Hücre normal görünümüne geri döndüğünde veya bir kez daha aktif motiliteye başladığında edinimi sonlandırın.

Başlamak için, parçacık görüntüsü veloc simetrisini kullanarak sitoplazmik akışı ölçmek için bir MATLAB paketi olan PIV laboratuvarını indirin. Ardından, her video dizisi için TIFF görüntü yığınını MATLAB kılavuzundaki parçacık görüntüsü veloc simetri programına yükleyin. Ham verilerin stent gövdesi dışındaki bölgelerini maskelemek için her görüntü yığını için manuel olarak bir maske oluşturun.

Ardından, PIV lab'ı hızlı Fourier dönüşümü ayarını ve her karedeki pikselleri daha büyük kare piksellere bölecek olan 64 x 64 piksellik bir bölme boyutunu kullanacak şekilde ayarlayın. Ardından, her karedeki pikseller ile yakındaki pikseller arasındaki çapraz korelasyonları hesaplamak için PIV laboratuvarını çalıştırın. Bir sonraki karede, bu, ham verilerle aynı zaman çözünürlüğüne sahip olan, her büküm pikselinde merkezlenmiş zamana bağlı bir akış vektörü verecektir.

Ardından, kesmeden önce ve yara iyileşmesi sırasında stent ile alınan verileri karşılaştırmak için elde edilen vektör alanı çıktısının zaman ortalamalarını hesaplayın. Ayrıca, akış dalgalanmalarını incelemek için akış gücünü ve belirli bir pikseldeki hızın zaman içindeki değişimini incelemek için akış hızlarının histogramlarını hesaplayın. Stent veya hücre ikiye bölünmüş dizileri görüntülerken, ortalama akış hızını hücre dışı sitoplazma kabarcık tabanının enine kesit alanı ile çarparak hücre gövdesine toplam sitoplazma akışını uygun şekilde hesaplayın.

Burada gösterilen, bir cam iğne ile kesilen ve bozulan bir stent veya hücrenin canlı görüntüsüdür. Kesimden sonra, ana hücre gövdesinden önemli miktarda sitoplazma çekilir, ancak hızla hücreye geri akar. Bu prosedürü takiben, stent veya yara iyileşmesi sırasında hangi hücre iskeleti bileşenlerinin sitoplazmik harekete katkıda bulunabileceği gibi ek soruları yanıtlamak için kimyasal inhibitörler eklenebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerimize stent kesmek için aletlerin nasıl hazırlanacağını ve tek dev hücre içindeki kesme ve yara iyileşme süreci sırasında sitoplazmik akışı nasıl görüntüleyeceğimizi iyi anlamış olmalısınız.