Name: Planktonik Hücreler (MBC-P) ve Biyofilm Hücreleri (MBC-B) için Bir Antimikrobiyal Ajanın Minimal Bakterisidal Konsantrasyonunun Oluşturulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-02T20:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Öğrenin planktonik ve biyofilm bakterilerin antimikrobiyal direncini 96 kuyucuklu mikrotiter plaka kullanarak karşılaştırma yöntemini. Bu protokol, her iki durum için minimal bakterisidal konsantrasyonu belirleyerek biyofilm büyümesinin sağladığı artmış direnci gösterir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazar li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz ve Clayton Hall'a bu makalenin editoryal yardımı için teşekkür eder. Bu test ilk olarak Dartmouth'taki Geisel Tıp Fakültesi George O'Toole'un laboratuvarında geliştirilmiştir. Dr. Mah'un laboratuvarındaki araştırmalar, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi ve Kistik Fibrozis Kanada'nın hibeleriyle desteklenmektedir.

1. MBC-B
<ol><li>
Bir biyofilm yetiştirmek (O'Toole 9'danuyarlanmıştır).
	<ol>
<li>37 °C'de zengin bir ortamda 16 saat boyunca vahşi tip ilgi ve mutant suşu kültürünü büyütün.</li>
		<li>Doymuş gece kültürlerini 1:100 antibiyotik direnci tahlilleri için taze ortama seyreltin. P. aeruginosa için standart bir ortam, magnezyum sülfat ve arginin ile desteklenmiş M63 minimal ortadır (bkz. Tablo 1). Bu ortam daha sağlam bir biyofilm oluşumunu uyarır.</li>
		<li>96 kuyulu bir mikrotiter kabına kuyu başına 100 μl seyreltme ekleyin (bkz. Tablo 1). Bu tahliller tipik olarak her suş için üç taraflı olarak yapıldığı için, her suşun 24 kuyusu olmalıdır.</li>
		<li>Mikrotiter plakayı 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Önceden biçimlendirilmiş biyofilmin bir konsantrasyon gradyan antibiyotikine maruz getirilmesi
	<ol>
<li>7 kuyu için 10x seyreltme antibiyotik serisi hazırlayın. Örnek: antibiyotik tobramycin için, kuyulardaki son konsantrasyonlar 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 ve 0.006 mg/ml 5-8'dir. 25 mg/ml'lik bir stoktan 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 ve 0,06 mg/ml'lik 10x seyreltmeler hazırlayın. Buzun üzerinde bırak.</li>
		<li>Harcanan süpernatant (planktonik hücreler içeren) çok kanallı pipet kullanarak çıkarın (bkz. Tablo 1).</li>
		<li>Tüm kuyulara 90 μl M63 (Mg/Arg) ekleyin.</li>
		<li>İstenilen son konsantrasyonları elde etmek için her 10x antibiyotik konsantrasyonunun 10 μl'sini ekleyin. Her çoğaltma ve gerinim için son kuyuya 10 μl su (antibiyotik kontrolü yok) ekleyin.</li>
		<li>Mikrotiter plakayı 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ortamı yenilemek ve canlı hücrelerin birliğine izin vermek.
	<ol>
<li>Harcanan süpernatant (planktonik hücreler içeren) çok kanallı pipet kullanarak çıkarın.</li>
		<li>Tüm kuyulara 115 μl M63 (Mg/Arg) ekleyin.</li>
		<li>Mikrotiter plakayı 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Canlı hücreler için test.
	<ol>
<li>96 kuyulu mikroter plaka başına iki LB agar plakası etiketle.</li>
		<li>Uçları % 100 etanol içine batırarak ve uçları bir Bunsen brülörünün açık alevinden geçirerek çok ürünlü cihazı sterilize edin (bkz. Tablo 1). yinelemek. Uçları hafifçe soğumaya bırakın. Çok yönlü cihazı kullanarak, mikrotiter plakanın her kuyusundan lb agar plakasının yüzeyine planktonik kültürün ~3 μl'yi (tipik olarak uçlarda tutulan miktar) aktarın.</li>
		<li>LB agar plakalarını 37 °C'de 16 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Bakteri üremesi için kesileni gözle tanımlayarak antibiyotiğin minimum bakterisidal konsantrasyonunu belirleyin (Şekil 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. MBC-P
<ol><li>
Bakteri suşlarının hazırlanması
	<ol>
<li>37 °C'de zengin bir ortamda 16 saat boyunca vahşi tip ilgi ve mutant suşu kültürünü büyütün.</li>
		<li>Doymuş gece kültürlerini 1:100 antibiyotik direnci tahlilleri için taze ortama seyreltin. P. aeruginosa için standart bir ortam, magnezyum sülfat ve arginin ile desteklenmiş M63 minimal ortadır (bkz. Tablo 1).</li>
		<li>96 kuyulu bir mikrotiter kabına kuyu başına 90 μl seyreltme ekleyin (bkz. Tablo 1). Bu tahliller tipik olarak her suş için üç taraflı olarak yapıldığı için, her suşun 24 kuyusu olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Planktonik hücreleri antibiyotik konsantrasyon gradyanine maruz kalma
	<ol>
<li>7 kuyu için 10x seyreltme antibiyotik serisi hazırlayın. Örnek: Antibiyotik tobramycin için kuyulardaki son konsantrasyonlar 0.032, 0.016, 0.008, 0.004, 0.002, 0.001 ve 0.0005 mg/ml'dir. 25 mg/ml'lik bir stoktan 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 ve 0,005 mg/ml'lik seyreltmeler hazırlayın. Buzun üzerinde bırak.</li>
		<li>İstenilen son konsantrasyonları elde etmek için her 10x antibiyotik konsantrasyonunun 10 μl'sini ekleyin. Her çoğaltma ve gerinim için son kuyuya 10 μl su (antibiyotik kontrolü yok) ekleyin.</li>
		<li>Mikrotiter plakayı 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Canlı hücreler için test.
	<ol>
<li>96 kuyulu mikroter plaka başına iki LB agar plakası etiketle.</li>
		<li>Uçları % 100 etanol içine batırarak ve uçları bir Bunsen brülörünün açık alevinden geçirerek çok ürünlü cihazı sterilize edin (bkz. Tablo 1). yinelemek. Uçları hafifçe soğumaya bırakın. Çok yönlü cihazı kullanarak, mikrotiter plakanın her kuyusundan lb agar plakasının yüzeyine planktonik kültürün ~3 μl'yi (tipik olarak uçlarda tutulan miktar) aktarın.</li>
		<li>LB agar plakalarını 37 °C'de 16 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Bakteri üremesi için kesileni gözle tanımlayarak antibiyotiğin minimum bakterisidal konsantrasyonunu belirleyin (Şekil 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).</li>
<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).</li>
<li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-specific+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li>
<li>Zhang, L., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Involvement+of+a+Novel+Efflux+System+in+Biofilm-Specific+Resistance+to+Antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics.</a> J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).</li>
<li>Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+tssC1+Links+Type+VI+Secretion+and+Biofilm-specific+Antibiotic+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance.</a> J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).</li>
<li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biofilm-Specific+Antibiotic+Resistance+Gene%2C+ndvB%2C+is+Important+for+Expression+of+Ethanol+Oxidation+Genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+tolerance+of+biofilms+and+persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multidrug tolerance of biofilms and persister cells.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).</li>
<li>Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. 31, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2011).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMerritt%2C+JH+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22">Curr. Protoc. Microbiol</a>. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.1.1-1B.1.17 (2005).</li>
<li>Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamey%2C+BE+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22">Curr. Protoc. Microbiol</a>. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.3.1-1B.3.14 (2005).</li>
</ol>

Yazar, rakip finansal çıkarları olmadığını beyan eder.

Planktonik hücrelerde antibiyotik direnci, hücrelerde kalıcı bir değişiklik (örneğin bir mutasyon) nedeniyle bir antibiyotiğin minimum inhibitör konsantrasyonunda (MIC) bir artış olaraktanımlanır. Bugüne kadar tanımlanan biyofilme özgü direnç veya tolerans mekanizmaları, biyofilmler içindeki vahşi tip genlerin ekspresyonunun sonucudur. Bu nedenle, klasik direnç tanımı biyofilmler için geçerli değildir. Bununla birlikte, başka bir tanım kümesi sunulmuştur: direnç mekanizmaları antibiyotiğin hedefine erişmesini en...

Antibiyotik direnci tahlilleri başlangıçta planktonik (serbest yüzme) bakteri kültürlerinin direncini test etmek için geliştirilmiştir. Birçok bakteriyel enfeksiyon biyofilmleri (yüzeye bağlı hücreler) içerdiğinden, biyofilme özgü antibiyotik direncini test etmek için bir yöntem geliştirmekle ilgileniyorduk. Bununla birlikte, antibiyotik direnci testlerinin çoğu biyofilmlerin direncini ölçmek için uygun değildir. Örneğin, minimum inhibitör konsantrasyonun (MIC) belirlenmesi, planktonik bakteri kültürlerinin antibiyotik direncini belirlemek için altın standarttır 1. Bu test, seyreltilmiş bir planktonik kültürün bir seyreltme antibiyotik serisi ile karıştırılmasını gerektirir.  Planktonik hücrelerin görünür büyümesini engelleyen antibiyotik konsantrasyonu MIC'dir. Bu test büyümenin inhibisyonunu dayandığından, tanım olarak, önceden büyümüş bir biyofilmdeki hücrelerin antibiyotik duyarlılığını incelemeyi gerektiren biyofilm kültürleriyle çalışamaz. Burada açıklanan MBC-B tahlili, büyüme inhibisyonunu ölçmek yerine, bir biyofilmde zaten var olan hücreleri öldüren antibiyotik konsantrasyonunu belirler. Bu nedenle, bu test yerleşik biyofilm enfeksiyonlarının antibiyotik tedavilerini taklit etmeyi ve bakteriyelantibiyotik direncinin vivo daha alakalı bir görünümünü sağlamayı amaçlamaktadır.
Biyofilmler genellikle planktonik kültürlerden daha antibiyotik dirençli olduğundan 2-4 Bir biyofilmin antibiyotik direncini planktonik bir kültürünkiyle doğrudan ilişkilendiren bir yöntem tasarlamak gerekiyordu. Bu nedenle, bu yöntemin bir diğer amacı, planktonik ve biyofilm hücreleri arasındaki antibiyotik direnci seviyesini doğrudan karşılaştırabilmektir. Burada açıklanan MBC-P ve MBC-B tahlilleri bunu mümkün kilmektedir çünkü hücreler benzer koşullar altında kültürlenir. Biyofilme özgü antibiyotik direnci için önemli olan birkaç geni incelemek için bu yöntemi kullandık 5-8 .

<table><tbody><tr><td> 1x&nbsp; M63 </td><td></td><td></td><td> 5x&nbsp olarak hazırlayın; 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 ve 10g (NH4) 2S<O>sub4 1 L suda çözerek M63 stoğu. Bu stoğun otoklavlanmasına gerek yoktur ve oda sıcaklığında saklanabilir. 5x&nbsp seyreltin; stok 1:5, otoklav, soğutun, ardından istediğiniz bileşenleri ekleyin. </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td>Fisher</td><td>P285-500</td><td> </td></tr><tr><td> K2HPO4 </td><td>Balıkçı</td><td>P288-500</td><td> </td></tr><tr><td> (NH4)2SO4 </td><td></td><td>SigmaA5132</td><td> </td></tr><tr><td> Magnezyum sülfat </td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td> 1 mM nihai konsantrasyona ekleyin.&nbsp; Su ve otoklavda 1 M stok olarak hazırlayın. </td></tr><tr><td> Tobramisin </td><td>Sigma</td><td></td><td> 50 mg/m&nbsp; stok. Aliquot ve mağaza -</açıklık>20 derece; C. </td></tr><tr><td> Arginin </td><td>Sigma</td><td>A5131</td><td> % 0.4 nihai konsantrasyona ekleyin.&nbsp; %20 su stoğu olarak hazırlayın ve süzerek sterilize edin. Bu alternatif karbon / enerji kaynağı, glikoz ve kasamino asitlerin yerini alabilir </td></tr><tr><td> 96 oyuklu mikrotitre plakaları </td><td>Corning</td><td>3595</td><td> Steril, düz tabanlı, düşük buharlaşma </td></tr><tr><td> Tranferpette (çok kanallı pipet) </td><td>BrandTech</td><td>2703610</td><td> 8 kanallı, 20-200 &mu; l </td></tr><tr><td> Multing cihaz </td><td>Dan-Kar</td><td>MC48</td><td> 48 uç, 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının &frac12; içine sığar </td></tr></tbody></table>

planktonik hücreler (mbc-p) ve biyofilm hücreleri (mbc-b) için bir antimikrobiyal ajanın minimal bakterisidal konsantrasyonunun oluşturulması

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

Bu protokol, bir biyofilm in vitrooluşturabilen bakteriyel bir suş için planktonik ve biyofilm direnci arasında doğrudan bir karşılaştırma sağlar. Bakteriler 96 kuyulu bir mikroter plakanın kuyularına aşılanır. Planktonik test durumunda, tercih ettiği antimikrobiyal ajanın seri seyreltmeleri bakteriyel süspansiyonlara eklenir. Biyofilm testinde, aşılandıktan sonra, bakteriler belirli bir süre boyunca bir biyofilm oluşturmak için bırakılır. Eklenmemiş hücreler kuyulardan çıkarılır, ortam yenilenir ve tercih edilen antimikrobiyal ajanın seri seyreltmeleri eklenir. Antimikrobiyal ajana maruz kaldıktan sonra, planktonik hücreler büyüme için test edilir. Biyofilm tahlili için, medya antimikrobiyal ajandan yoksun taze medya ile yenilenir ve biyofilm hücreleri iyileşmeye bırakılır. Biyofilm hücre canlılığı iyileşme döneminden sonra test edilir. Antimikrobiyal ajan için MBC-P, planktonik kültürdeki hücreleri öldüren en düşük ilaç konsantrasyonu olarak tanımlanır.  Buna karşılık, bir suş için MBC-B, önceden biçimlendirilmiş biyofilmlerin 24 saat boyunca artan antimikrobiyal ajan konsantrasyonlarına maruz kalarak belirlenir. MBC-B, biyofilmdeki hücreleri öldüren en düşük antimikrobiyal ajan konsantrasyonu olarak tanımlanır.

PA14 vahşi tipinin hassasiyetini PA14 ∆ndvBile karşılaştıran MBC-P ve MBC-B tahlilleri gerçekleştirildi. Antibiyotik olarak tobramycin kullanıldı. Adım 1.4.4 (Şekil 1) ve adım 2.3.4 (Şekil 2) 'ye karşılık gelen sonuçlar sunulmuştur. PA14 ve ∆ndvB üç taraflı olarak MBC-P ve MBC-B testlerine aşılandı. MBC-B protokolünün 1.0-1.4 ve MBC-P protokolünün 2.0-2.3. Hücrelerin solunda tobramycin(μg/ml) konsantrasyonları bel...

Bu protokol, 96 kuyulu bir mikrotiter plaka kullanarak biyofilm in vitro oluşturabilen bakteriyel bir suş için planktonik ve biyofilm direnci arasında doğrudan bir karşılaştırma sağlar. Planktonik veya biyofilm bakterileri, tercih edilen antimikrobiyal ajanın seri seyreltmelerine maruz kalır. Canlılık, agar plakalarındaki büyüme ile test edilir.

Planktonik Hücreler (MBC-P) ve Biyofilm Hücreleri (MBC-B) için Bir Antimikrobiyal Ajanın Minimal Bakterisidal Konsantrasyonunun Oluşturulması

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

Bu prosedür, bir biyofilm oluşturabilen bir bakteri türü için planktonik ve biyofilm direncini doğrudan karşılaştırır. İlk olarak, bir biyofilm oluşturun, ortamı doldurun ve tercih edilen antimikrobiyal ajanın seri seyreltmesini uygulayın. Daha sonra hücrelerin taze, orta derecede iyileşmesine izin verin.Şimdi LB burgu üzerine kaplayarak hücrelerin canlılığını test edin. Sonuç olarak, planktonik ve biyofilm hücrelerinin minimal bakterisidal konsantrasyonunun belirlenmesi, bir biyofilmdeki büyümeden kaynaklanan direnç artışını göstermek için kullanılır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, bitişik kuyuları kirlettikleri veya çok uçlu cihazın uçlarının bakterileri öldürmemek için yeterince soğumasına izin vermedikleri için mücadele edeceklerdir.Kültür, 37 santigrat derecede zengin bir ortamda 16 saat boyunca vahşi tip ve mutant bakteri türü, doymuş gece kültürlerini, magnezyum, sülfat ve arginin ile desteklenmiş M 63, minimal ortam gibi taze bir ortama seyreltir. Sonra Eloqua. Kuyu başına 100 mikrolitre.Her suş için 24 kuyu tahsis ederek, 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. Daha sonra, yedi kuyu için bir seyreltme serisi antibiyotiğin 10 x stok çözeltisini hazırlayın ve buz üzerinde saklayın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, planktonik hücreler içeren harcanan süpernatanı çıkarın.Daha sonra tüm kuyucuklara 90 mikrolitre M 63 ekleyin ve antibiyotik kontrolü için 10 mikrolitre uygun antibiyotik stok solüsyonu ekleyin. Her çoğaltma ve suş için 10 mikrolitre su ekleyin. Mikro titre plakasını 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin.Çok kanallı bir pipet kullanarak, planktonik hücreler içeren harcanan süpernatanı çıkarın. Tüm kuyucuklara 115 mikrolitre M 63 ekleyin ve kültürleri 24 saat boyunca büyütmeye devam edin. 37 santigrat derecede.Her yarım için bir lb burgu plakasını etiketleyin 96. Çok uçlu cihazı sterilize etmek için iyi mikrotitre plakası,% 100 etanole batırın ve tırnakları bir bunsen brülörünün açık alevinden geçirin. Tırnakları hafifçe soğumaya bırakın.Tırnakların uçlarını kullanarak. Planktonik kültürü, mikrotitre plakasının her bir oyuğundan bir LB burgu plakasının yüzeyine aktarın. LB burgu plakalarını 16 saat boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin.Daha sonra, antibiyotik kültürünün minimum bakterisidal konsantrasyonu olarak bakteri büyümesi için kesmeyi, 37 santigrat derecede zengin bir ortamda 16 saat boyunca vahşi tip ve mutant bakteri suşu olarak görsel olarak belirleyin, doymuş gece kültürlerini bir ila 100 oranında seyreltin. 90 mikrolitre bakteri seyreltmesi ekleyin. Şimdi planktonik hücreleri bir antibiyotik konsantrasyon gradyanına maruz bırakmak için.Tobramisin misin gibi bir seyreltme serisi antibiyotiğin 10 x stok çözeltisi ile başlayın. Deneysel tasarıma göre 10 mikrolitre antibiyotik sapı ekleyin. Daha sonra her çoğaltma ve suş için antibiyotiksiz kontrol kuyularına 10 mikrolitre su ekleyin.Canlı hücreleri test etmek için mikrotitre plakasını 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. 96 Kuyulu mikrotitre plakasının her yarısı için bir LB burgu plakasını etiketleyerek başlayın. Çok uçlu cihazı %100 etanol ile alevlendirerek sterilize edin.Bir kez tekrarlayın. Daha sonra çok uçlu cihazı kullanarak, mikrotitre plakasının her bir oyuğundan yaklaşık üç mikrolitre planktonik kültürü bir LB burgu plakasının yüzeyine aktarın. Plakaları 16 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Daha sonra, bakteri üremesi için kesmeyi gözle belirleyerek antibiyotiğin minimum bakterisidal konsantrasyonunu belirleyin. Bu deneyde, PA 14 vahşi tipin duyarlılığını antibiyotik direncinden yoksun bir mutant suşla karşılaştırmak için iki farklı minimal BAKTERİSİT konsantrasyon testi kullanıldı. Gen NDVB.Burada, biyofilm için antibiyotik tobramisinin minimal bakterisidal konsantrasyonları ölçüldü. PA 14 için MBCB, mutant için mililitre başına 12.5 mikrogram ile karşılaştırıldığında mililitre başına 100 mikrogramdır. Buna karşılık, planktonik hücreler için minimal bakterisidal tobramisin konsantrasyonları, hem PA 14 vahşi tip hem de mutant için mililitre başına sekiz mikrogram idi.Bir kez ustalaştıktan sonra, NBCB yaklaşık bir saat içinde yapılabilir ve beş güne bölünebilir.

establishing-minimal-bactericidal-concentration-an-antimicrobial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Güncel tanısal antimikrobiyal duyarlılık testi besin açısından zengin, aerobik koşullarda izolatların planktonik büyüme dayanır. Burada, kistik fibrozis akciğer daha fazla temsilcisi hem aerobik hem de mikroaerofilik şartlarda Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerin antimikrobiyal duyarlılık incelemek için alternatif yapay balgam orta istihdam.

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

Bu video, bakterilere karşı test antibiyotiklerinin Minimum İnhibitör Konsantrasyonunu (MIC) belirlemek için mikrotitre plakası tabanlı bir yöntemi göstermektedir. Bir test antibiyotiğinin seri dilüsyonlarını içeren bir mikrotitre plakasına bakteriyel patojen Pseudomonas aeruginosa'nın bir süspansiyonu ve bakteriler tarafından pyomelanin üretiminin bir inhibitörü eklendikten sonra, oyukların optik yoğunluğu, antibiyotiğin minimum inhibitör konsantrasyonunu ve piyomelanin üretim inhibitörünün...

Bir Antibiyotiğin Minimum İnhibitör Konsantrasyonunu Değerlendirmek için Bir Mikrotitre Plaka Yöntemi

Bakteriyel pyomelanin üretimi, oksidatif strese ve virülansa karşı direncin artmasına neden olur. Pyomelanin üretiminin inhibisyonunu belirlemek ve bakterilerde oksidatif strese duyarlılıkta ortaya çıkan artışı test etmek ve ayrıca antibiyotik minimum inhibitör konsantrasyonunu (MIC) belirlemek için kullanılabilecek teknikleri rapor ediyoruz.

Yöntemler Bakteriyel Pyomelanin Üretim ønhibe ve Oksidatif Stres Duyarlılık içinde tekabül eden artış belirleme

Bu çalışma, biyofilm inhibitörlerini ve bunların Bacillus subtilis çok hücrelilik üzerindeki etkilerini incelemek için tekrarlanabilir metodolojilerin geliştirilmesini sunmaktadır.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

Bu protokol, yüksek verimli 96 kuyulu sabitlenmiş kapak statik biyofilm taraması için kendinden montajlı derin kuyu PCR plakalı cihazları kullanarak biyofilm büyümesi ve biyokütle ölçümleri yapmak için metodoloji sunar.

PCR-Plate Deep Well Microplate Cihazları Kullanılarak Daha Büyük Bakteriyel Biyofilm Biyokütlesinin Oluşturulması

Bu protokol, süt endüstrisinde biyofilmlerin eradikasyonunda organik peroksiasitlerin etkinliğini değerlendirmek için statik ve dinamik yöntemleri birleştiren bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bu yaklaşım, biyofilmleri kontrol etmek için yeni biyolojik veya kimyasal formülasyonların etkinliğini test etmek için de kullanılabilir.

Organik Peroksiasitlerin Süt Biyofilmlerinin Eradikasyonunda Etkinliğinin Statik ve Dinamik Yöntemleri Birleştiren Bir Yaklaşım Kullanılarak Değerlendirilmesi

İn vitro teknikleri kullanarak nanopartiküllerin ve nanoyapılı yüzeylerin antimikrobiyal aktivitelerini değerlendirmek için dört yöntem sunuyoruz. Bu yöntemler, farklı nanopartiküllerin ve nanoyapılı yüzeylerin çok çeşitli mikrobiyal türlerle etkileşimlerini incelemek için uyarlanabilir.

Nanopartiküllerin ve Nanoyapılı Yüzeylerin Antimikrobiyal Aktivitelerinin İn Vitro Olarak Değerlendirilmesi

Bu protokol, pelikül biyofilmi geliştirmek için sağlam bir yöntemi tanımlar. Yöntem, farklı kültür hacimlerine ölçeklenebilir ve çeşitli deneysel hedefler için kolay benimseme sağlar. Yöntemin tasarımı, çeşitli mikobakteri türlerinin biyofilm oluşturma potansiyelinin kalitatif veya kantitatif olarak değerlendirilmesini sağlar.

Antimikrobiyal Direnci İncelemek İçin Bir Model Olarak Mikobakteriyel Biyofilm Yetiştirme

Bu metodoloji, araştırma ve klinik laboratuvarlarda antimikrobiyal duyarlılık testi için kistik fibrozda bir polimikrobiyal biyofilm modelinin oluşturulmasına izin verir. Bu model, bir dizi çıktıda doğru ve güvenilir sonuçlar sağlar.

Kistik Fibrozisde Antimikrobiyalleri Test Etmek İçin Polimikrobiyal Koloni Biyofilm Modelinin Geliştirilmesi

Bu protokol, fitokimyasalların geleneksel biyositlerin bakterisit etkilerini nasıl artırabileceğini değerlendirmek için sistematik bir çerçeve sunar; bakterisit aktivite modellemesi ve kombinatoryal etkileşim testleri kullanarak, mikrobiyal kontrolü iyileştiren ve genel biyosit kullanımını azaltan sinergistik karışımları belirlemeyi amaçlar.

In Vitro Bitki kaynaklı moleküllerin geleneksel biyositler üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi

Öğrenin planktonik ve biyofilm bakterilerin antimikrobiyal direncini 96 kuyucuklu mikrotiter plaka kullanarak karşılaştırma yöntemini. Bu protokol, her iki durum için minimal bakterisidal konsantrasyonu belirleyerek biyofilm büyümesinin sağladığı artmış direnci gösterir.

Planktonik Hücreler (MBC-P) ve Biyofilm Hücreleri (MBC-B) için Bir Antimikrobiyal Ajanın Minimal Bakterisidal Konsantrasyonunun Oluşturulması (Video) | JoVE Journal

Planktonik Hücreler (MBC-P) ve Biyofilm Hücreleri (MBC-B) için Bir Antimikrobiyal Ajanın Minimal Bakterisidal Konsantrasyonunun Oluşturulması

Daha fazla video keşfet