Planktonik Hücreler (MBC-P) ve Biyofilm Hücreleri (MBC-B) için Bir Antimikrobiyal Ajanın Minimal Bakterisidal Konsantrasyonunun Oluşturulması

Bu prosedür, bir biyofilm oluşturabilen bir bakteri türü için planktonik ve biyofilm direncini doğrudan karşılaştırır. İlk olarak, bir biyofilm oluşturun, ortamı doldurun ve tercih edilen antimikrobiyal ajanın seri seyreltmesini uygulayın. Daha sonra hücrelerin taze, orta derecede iyileşmesine izin verin.

Şimdi LB burgu üzerine kaplayarak hücrelerin canlılığını test edin. Sonuç olarak, planktonik ve biyofilm hücrelerinin minimal bakterisidal konsantrasyonunun belirlenmesi, bir biyofilmdeki büyümeden kaynaklanan direnç artışını göstermek için kullanılır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, bitişik kuyuları kirlettikleri veya çok uçlu cihazın uçlarının bakterileri öldürmemek için yeterince soğumasına izin vermedikleri için mücadele edeceklerdir.

Kültür, 37 santigrat derecede zengin bir ortamda 16 saat boyunca vahşi tip ve mutant bakteri türü, doymuş gece kültürlerini, magnezyum, sülfat ve arginin ile desteklenmiş M 63, minimal ortam gibi taze bir ortama seyreltir. Sonra Eloqua. Kuyu başına 100 mikrolitre.

Her suş için 24 kuyu tahsis ederek, 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. Daha sonra, yedi kuyu için bir seyreltme serisi antibiyotiğin 10 x stok çözeltisini hazırlayın ve buz üzerinde saklayın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, planktonik hücreler içeren harcanan süpernatanı çıkarın.

Daha sonra tüm kuyucuklara 90 mikrolitre M 63 ekleyin ve antibiyotik kontrolü için 10 mikrolitre uygun antibiyotik stok solüsyonu ekleyin. Her çoğaltma ve suş için 10 mikrolitre su ekleyin. Mikro titre plakasını 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, planktonik hücreler içeren harcanan süpernatanı çıkarın. Tüm kuyucuklara 115 mikrolitre M 63 ekleyin ve kültürleri 24 saat boyunca büyütmeye devam edin. 37 santigrat derecede.

Her yarım için bir lb burgu plakasını etiketleyin 96. Çok uçlu cihazı sterilize etmek için iyi mikrotitre plakası,% 100 etanole batırın ve tırnakları bir bunsen brülörünün açık alevinden geçirin. Tırnakları hafifçe soğumaya bırakın.

Tırnakların uçlarını kullanarak. Planktonik kültürü, mikrotitre plakasının her bir oyuğundan bir LB burgu plakasının yüzeyine aktarın. LB burgu plakalarını 16 saat boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin.

Daha sonra, antibiyotik kültürünün minimum bakterisidal konsantrasyonu olarak bakteri büyümesi için kesmeyi, 37 santigrat derecede zengin bir ortamda 16 saat boyunca vahşi tip ve mutant bakteri suşu olarak görsel olarak belirleyin, doymuş gece kültürlerini bir ila 100 oranında seyreltin. 90 mikrolitre bakteri seyreltmesi ekleyin. Şimdi planktonik hücreleri bir antibiyotik konsantrasyon gradyanına maruz bırakmak için.

Tobramisin misin gibi bir seyreltme serisi antibiyotiğin 10 x stok çözeltisi ile başlayın. Deneysel tasarıma göre 10 mikrolitre antibiyotik sapı ekleyin. Daha sonra her çoğaltma ve suş için antibiyotiksiz kontrol kuyularına 10 mikrolitre su ekleyin.

Canlı hücreleri test etmek için mikrotitre plakasını 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. 96 Kuyulu mikrotitre plakasının her yarısı için bir LB burgu plakasını etiketleyerek başlayın. Çok uçlu cihazı %100 etanol ile alevlendirerek sterilize edin.

Bir kez tekrarlayın. Daha sonra çok uçlu cihazı kullanarak, mikrotitre plakasının her bir oyuğundan yaklaşık üç mikrolitre planktonik kültürü bir LB burgu plakasının yüzeyine aktarın. Plakaları 16 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, bakteri üremesi için kesmeyi gözle belirleyerek antibiyotiğin minimum bakterisidal konsantrasyonunu belirleyin. Bu deneyde, PA 14 vahşi tipin duyarlılığını antibiyotik direncinden yoksun bir mutant suşla karşılaştırmak için iki farklı minimal BAKTERİSİT konsantrasyon testi kullanıldı. Gen NDVB.

Burada, biyofilm için antibiyotik tobramisinin minimal bakterisidal konsantrasyonları ölçüldü. PA 14 için MBCB, mutant için mililitre başına 12.5 mikrogram ile karşılaştırıldığında mililitre başına 100 mikrogramdır. Buna karşılık, planktonik hücreler için minimal bakterisidal tobramisin konsantrasyonları, hem PA 14 vahşi tip hem de mutant için mililitre başına sekiz mikrogram idi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, NBCB yaklaşık bir saat içinde yapılabilir ve beş güne bölünebilir.