Için Mikrometrik Sondalar uzaktan manyetik uyarılı

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir bakteriyel biyofilmin yerel fiziksel özelliklerini mikrometrik ölçekte C'de iki farklı ölçümle belirlemektir. Bunu gerçekleştirmek için, büyüyen bir biyofilm içerisine, biyofilmin yapısal özelliklerini bozmadan uzaktan hareket ettirilebilen problar olarak görev yapacak manyetik partiküller yerleştirilir. Ardından, her bir partikül üzerine tanımlanmış bir kuvvet uygulamak için özel manyetik cımbızlar kullanılır.

Biyofilm içerisine yerleştirilen parçacıkların, manyetik çekimle tetiklenen yer değiştirmeleri, yerel viskoelastik parametreleri türetmek ve biyofilmin mekanik özelliklerinin 3D uzamsal dağılımını sağlamak amacıyla video mikroskopi kullanılarak izlenir. E. coli biyofilminin mekanik heterojenliğini gösteren ve hangi biyofilm bileşenlerinin biyofilmin fiziksel özelliklerini desteklediğine dair ipuçları veren sonuçlar elde edilir. Dolayısıyla, bu tekniğin mikroskopi, koloji veya tüm biyovejetasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, malzemenin orijinal yapısını bozmadan mekanik özelliklerin uzamsal dağılımını in situ olarak raporlamasıdır.

Bu protokol için manyetik partikülleri hazırlamak amacıyla, partikülleri yeniden süspande etmek için 2,8 µm partikül içeren stok şişesini vorteksleyin. Ardından, 10 µL partikülü bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Partikülleri yıkamak için 190 µL minimum ortam ekleyip tüpü dairesel hareketlerle çalkalayın, tüpü manyetik numune rafına yerleştirin, bir pelet oluşmasını bekleyin ve süpernatan çözeltiyi aspire edin.

Bu yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın ve boncukları 190 µL minimum besiyerinde yeniden süspande edin. Ardından, partikül konsantrasyonunu mililitre başına yaklaşık 5 milyon boncuk olacak şekilde ayarlamak için, yıkanmış boncuk çözeltisinin 50 µL'sine %0,4 glukoz içeren 950 µL M 63 B one ekleyin. Kanalı hazırlamak için, iki adet 10 cm uzunluğundaki kare borosilikat cam kapileri elmas cam kesici ile keserek sekizer santimetre uzunluğunda iki parça elde edin.

Cam kesiciyi kullanarak bir lamı ortadan ikiye bölün. Ardından, hızlı etkili bir siyanoakrilat yapıştırıcı veya japon yapıştırıcısı kullanarak, iki kapiler parçayı bu diyagramda gösterildiği gibi iki lam parçasına sabitleyin. Birbirinden iki santimetre uzaklıkta ve her iki uçta bir santimetre taşma olacak şekilde, tüm düzeneği ve gerekli tüpleri otoklavlayın.

Kanal bağlantısını tamamlamak için, laminer akış kabininde aşağıdaki steril malzemeleri hazırlayın. Monte edilmiş kanal tüpleri ve konnektörler, iki adet pediatrik balon filtresi veya tuzak. İki adet klemps, M 63 B, %1,4 glukoz ile doldurulmuş 30 mililitrelik şırıngalar ve atık şişesi.

İki kapileri aynı şekilde bağlayın. Tüplerden birini kullanarak, atık şişesini bir kapiler ucuna bağlayın.

Ardından, ara bağlantı olarak lure lock konnektörleri kullanarak, kapiler borunun diğer ucunu ev yapımı kabarcık tuzağına veya tuzak birini tuzak ikiye bağlayın. Daha sonra, 30 mililitrelik M 63 B one şırıngasını tuzak ikiye bağlayın. Sonrasında, düzeneği %0,4 glikoz içeren steril M 63 B one ile doldurun.

Şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin ve şırınga pompasını deneysel hızların yaklaşık beş mililitre/saat üzerinde bir hızda çalıştırın. Gerektiğinde devredeki tüm kabarcıkları dikkatle takip edin ve giderin. Bu prosedürü uygularken devreyi ayırıp yeniden bağlayın.

Hücre-partikül karışımı borulara aktarılmadan önce ve aktarım sırasında hava kabarcıklarının tamamen giderildiğinden emin olun; atık haznesini kapilerlerin üzerine yerleştirmek, biyofilmin sürekli büyümesine yardımcı olacaktır. Besiyerinin sistem içinde 10 ila 15 dakika boyunca akmasına izin verin. Bu sırada, bir mikrosantrifüj tüpünde, 0,5 optik yoğunluktaki bir mililitre bakteriyel süspansiyonu, daha önce hazırlanmış bir mililitre yıkanmış boncuk çözeltisi ile karıştırın.

Akışı kapatın, tüpleri yeniden bağlayın ve ardından klempleri kapatın. Sonra, bir mililitrelik bir şırıngayı bakteri boncuk karışımı ile doldurun ve bunu kapiler içine yerleştirin. Ev yapımı kabarcık tuzağından sonra, düzeneği mikroskoba taşıyın.

Kılcal boruyu mikroskop tablasına yerleştirin ve atık kabını biraz daha yüksek bir seviyeye konumlandırın. Şırınga pompasını mikroskobun yanındaki tezgaha koyun. Bakterilerin çökmesi ve kılcal boru yüzeyine tutunması için düzeneği 15 ila 20 dakika bekletin.

Bakteriler kapilere tutunduktan sonra, kıskaçları açın, şırınga pompasındaki akış hızını ayarlayın ve akışı başlatın. 24 ila 48 saatlik süreçte kapiler yüzeyinde bir biyofilm gelişecektir; kapiler taban düzlemine odaklanın ve örnek görüntülerinin zaman atlamalı kaydına başlayın. Genellikle dakikada iki görüntüden oluşan bir kazanım sıklığı, biyofilm büyümesini raporlamak için yeterli olacaktır.

Bu film, hücre-partikül karışımının enjekte edilmesinden hemen sonraki biyofilm başlangıç aşamasını göstermektedir. Kılcal kanal görüntülemesinde frekans saniyede bir görüntüdür ve film saniyede 10 kare hızında oynatılmaktadır. Dört saatlik büyümenin ardından, partiküller yüzeyden kademeli olarak ayrılarak biyofilm hacmine dağılmıştır.

Mavi oklar kopma olaylarını işaretlemiştir. Burada, görüntüleme sıklığı dakikada iki görüntü şeklindedir ve video saniyede 15 kare hızında oynatılmaktadır. 20 saatlik büyümeden sonra, bir odak düzleminde düzgün şekilde dağılmış bir düzine partikül izlenebilir.

Bu video, kılcal boru tabanının 20 mikrometre üzerinde, orta planda çekilmiştir. Dakikada iki görüntü alınmıştır. Video, saniyede 15 kare hızında oynatılmaktadır.

Manyetik partiküllerle ekilen biyofilm manuel olarak büyüdüğünde, manyetik cımbızı mikroskop tablasına vidalayın. Gözlem bölgesinde uygun manyetik alan gradyanlarının oluştuğundan emin olmak için, cımbızların kırmızıyla gösterilen ölçüm bölgesinin Y ekseni boyunca cımbızın sol ve sağ kutuplarının kenarlarından 300 micrometers uzaklıkta olduğu bu diyagramda gösterildiği gibi yerleştirildiğinden emin olun. Kapilarinin alt kısmı, cımbızın alt kısmının 200 micrometers altına yerleştirilir.

Bu adımı gerçekleştirmek için, sol el manyetik kutubun kenarını ve kapiler borunun sol kenarını bir araya getirmek amacıyla mikroskop tablasının XY hareket kontrolünü kullanın. Aynı gözlem alanında, cımbızların sol el mikro manipülatörünün x kadranını kullanarak kutbun konumunu kapiler borunun kenarından 300 micrometers uzaklığa ayarlayın. Aynı işlemi sağ taraf için de tekrarlayın.

Ardından, cımbız konumunu kapiler tüpün altına göre Z ekseni boyunca ayarlayın. İlk olarak, kutupların alt kısmını kapiler tüpün alt kısmıyla hizalayın ve kutupları 200 micrometers yukarı kaydırın.

Mikromanipülatörün Z kadranını kullanarak, fonksiyon jeneratörü parametrelerini 24 saniye sıfır sinyali ve 16 saniye dört amper olacak şekilde ayarlayın. Tetiklemeli doğru akımı, 20 saniye sonra parlak alan ışık kapatıcısına (shutter) gönderin.

Sinyal senkronizasyonu için cımbızı, güç amplifikatörü aracılığıyla fonksiyon jeneratörüne bağlayın. Uzamsal olarak dağılmış sürünme eğrileri elde etmek için kutupların seri olarak doğru şekilde bağlanmasına dikkat edin. Uzamsal bir başlangıç noktası belirleyin ve Z ekseninin başlangıç noktasını kılcal borunun iç tabanına ayarlayın.

Mikroskobun Z kontrol konumunu not edin. Ardından, sırasıyla kapiler kenarı ve kutup parçası kenarı tarafından tanımlanan x ve Y eksenlerinin kesişim noktasını belirleyin. Burası analiz başlangıç noktasıdır.

Koordinatları not edin. Bundan sonraki tüm koordinatlar bu başlangıç noktasına göre alınacaktır. Biyofilm büyüdükten sonra, ince odak ayar düğmesini kullanarak, ilk düzlemin kapiler tabanının dört ila yedi mikrometre üzerinde yer alacağı şekilde kapilerin dikey konumunu ayarlayın.

Bu kesit, uzaysal referans noktasının sol üst köşede bulunduğu biyofilm kesitine karşılık gelir. Ardından akım jeneratörünü açın ve görüntüleme dizisini manuel olarak başlatın. 42. olaylar dizisini başlatmak için, burada elde edilen görüntü akışı belirli bir düzleme ve XY alanına karşılık gelir.

Sekans yakalandıktan sonra, yeni alanın videosunu çekmek için kapileri hareket ettirin. Verileri analiz etmek için gerekli tüm videoları elde edene kadar bu işlemi tekrarlamaya devam edin. Tüm partiküllerde elde edilen tüm yığınlar için görüntüleri Image J veya eşdeğer bir partikül takip yazılımında açın.

Parçacık yer değiştirmelerini takip ederek görüntüleri metin dosyalarına dönüştürün. Ardından, bir veri işleme yazılımı kullanarak yer değiştirme eğrilerini çizin ve yer değiştirme eğrilerini, malzemenin toplam kompliyansının JFT'sinin burada gösterilen kompliyans formülüne göre zamanın bir fonksiyonu olarak hesaplandığı kompliyans eğrilerine dönüştürün. Bu formül, daha önce belirlendiği üzere, viskoelastik ve sıkıştırılamaz ortama gömülü olan veya kırmızıların tarihsel bir parçacığı için uygulanan stres ile malzeme gerinimi arasındaki ilişkiyi tanımlamaktadır. Sürünme kompliyans eğrisinin viskoelastik malzemeler için genel Burgers modeline uydurulmasıyla, biyofilmin viskoelastik özelliklerinin uzamsal dağılımını sağlamak için J zero J one at the zero at the one prime viskoelastik parametrelerini türetin. Sürünme eğrileri, bir biyofilmin yaklaşık 200 by 200 by 40 cubic micrometers boyutundaki mikro hacminde farklı derinliklerden toplanmıştır. Tipik sonuçlar burada gösterilmektedir.

Elastik kompliyans olan J sıfır değerleri, derinlik boyunca Z ekseni ve biyofilmin lateral boyutu boyunca y ekseninin bir fonksiyonu olarak verilmiştir. Her bir nokta, sürünme eğrisi analizinin bir J sıfır değeri sağladığı bir boncuğa karşılık gelmektedir. Veriler, lokal kompliyansın biyofilmin derinliği boyunca neredeyse üç büyüklük mertebesinde değiştiğini ortaya koymaktadır.

Ayrıca, tüm biyofilm yüksekliklerinde güçlü bir lateral heterojenlik meydana gelmiştir. Veriler ayrıca, geniş yayılımlı ve asimetrik bir şekil sergileyen kompliyans değerlerinin dağılımını da sunmaktadır. Bu sonuçların daha önce diğer biyolojik polimerler üzerinde elde edilen sonuçlarla karşılaştırılması, biyofilmin mekanik özelliklerinin yüksek derecede çapraz bağlı polimer jeller tarafından desteklendiğini göstermektedir.

C'de biyofilm yerel özelliklerinin iki ölçümü, burada görülebileceği gibi, daha düşük akış hızı gibi farklı çevresel koşullar altında da gerçekleştirilmiştir. Saatte 0,1 mililitre hızda büyütülen bir biyofilmin kompliyans değerleri hâlâ oldukça heterojen bir mekanik profil sergilemektedir. Ancak, saatte bir mililitre hızda büyütülen biyofilmde gözlemlenen biyofilm sertliğinin belirgin Z derinliği bağımlılığı ortadan kalkmıştır.

Bu sonuçlar, dış koşulların biyofilm organizasyonu üzerindeki önemli etkisini göstermektedir. Videoyu izledikten sonra, tam kontrollü büyüme koşulları altında biyofilm enstitüsünün viskozite özelliklerinin nasıl haritalandırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.