Membran Yetişkin farelerin ventromedial Hipotalamus Nöronlar Potansiyel Boya Görüntüleme Glikoz Algılama Çalışması için

Bu prosedürün genel amacı, nöronal aktivitenin bir indeksi olarak membran potansiyeline duyarlı boya kullanarak, yaşlı farelerden alınan ventral medial hipotalamik veya VMH nöronlarında glikoz algılamasını değerlendirmektir. Bu, ilk olarak beynin çıkarılmasından önce anestezi uygulanmış bir farenin beynindeki kanı temizlemek için kardiyak perfüzyon yapılarak gerçekleştirilir. İkinci adım, koronal beyin dilimleri oluşturmak ve VMH'yi incelemektir.

Daha sonra, VMH nöronları ayrışır ve kapak fişleri üzerinde kültürlenir. Son adım, membran potansiyel boyasının varlığında glikoz azaldıkça nöronların floresansını ölçmektir. Sonuç olarak, floresanstaki her nöron değişikliği, glikoz inhibe edilmiş nöronun glikoz değişikliklerine tepkisini ölçmek için kullanılır.

Bu tekniğin elektrofizyoloji gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yetişkin bir fareden alınan nöronları inceleme yeteneğidir. Bu, yetişkinlikte hastalık durumlarını incelememizi sağlar. Bu prosedüre, disseke edilmiş beyni, Vibram ikinci seviyede yavaş hıza ve dokuzuncu seviyede yüksek genliğe ayarlanmış olarak Vibram odasındaki aynaya yerleştirerek başlayın, hipotalamik alana ulaşana kadar 300 ila 500 mikronda dilimler kesin.

Daha sonra kesin VMH bölgesini izole etmek için arkadan öne doğru 100 mikronluk ince dilimler kesin. Bgma eksi 2.30 milimetredeki anatomik değişikliklere çok dikkat edin. Üçüncü ventrikül dorsal ve ventral bölümlere ayrılır. Taç.

Üçüncü ventrikül sigortasının enine kesitleri iki adet 500 mikronluk dilimi kestikten sonra, bu dilimler doğru VMH bölgesini içerecektir. Bu dilimleri kültür ortamı içeren buz üzerinde bir Petri kabına aktarın. Ardından VMH'yi inceleyin.

VMH parçalarını buz üzerindeki mililitre kültür ortamına nazikçe aktarmak için bir pipet kullanın. Bu adımda, VMH'yi içeren kültür ortamını buzdan çıkarın ve oda sıcaklığına alışmaya izin verin. Dört mililitre kültür ortamına mililitre pape başına 20 birim ekleyin, daha sonra karıştırmak için ters çevirin ve 34 santigrat derece su banyosuna koyun Sindirim ortamı artık bulanık olmayana kadar her dakika ters çevirerek kontrol edin ve karıştırın.

Bundan sonra, steril bir şişeye süzün ve dokuyu sindirim ortamına aktarın. Daha sonra, 30 dakika boyunca 34 santigrat derecede 100 RPM'de çalkalayarak dokuyu sindirin. Sindirim sırasında, 80 miligram BSA'yı bir mililitre kültür ortamında çözerek ve konik bir tüpe süzerek% 8 sığır serum albümini içeren bir mililitre ortam hazırlayın.

Dokuyu konik bir tüpte beş mililitre kültür ortamına aktararak ve yavaşça ters çevirerek yıkayın. Daha sonra, altı mililitre kültüre, ortama 30 mikrolitre DNA enzimi ekleyin ve tasyon ortamı yapmak için karıştırın. Daha sonra yıkama ortamını aspire edin ve üç mililitre tasyon ortamı ekleyin.

En büyükten en küçüğe doğru 10 kez hafifçe tritrasyon yapmak için cam pipetleri kullanın ve ardından daha büyük parçaların oturması için dört dakika bekleyin. Ardından, ayrışmış hücre süspansiyonunu içeren üst iki mililitreyi yeni bir konik tüpe aktarmak için ikinci pipeti kullanın. 10 kez iki mililitre tri media tri ekleyin ve üç dakika bekleyin.

En üstteki iki mililitreyi hücre süspansiyonuna aktarmak için üçüncü pipeti kullanın. Bundan sonra, beş kez bir mililitre tri media tri rate ekleyin ve iki dakika bekleyin. Üst iki mililitreyi hücre süspansiyonuna aktarmak için dördüncü pipeti kullanın.

Şimdi ayrışmış hücre süspansiyonunu %8 BSA'nın üzerine koyun ve karıştırmamaya dikkat edin. Daha sonra beş dakika boyunca 1000 RPM santrifüjlendi. Daha sonra otoklavı altıya sekiz milimetre klonlama silindirini her tamamen kuru kapak kızağının ortasına yerleştirin.

Daha sonra peleti 440 mikrolitre ılık büyüme ortamında aspire edin ve yeniden süspanse edin. Daha sonra, klonlama silindirlerini nöronal süspansiyon ile doldurun ve 20 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Klonlama silindirlerini çıkarın ve kalıntıları çok nazikçe yıkayın.

Daha sonra her bir tabağı iki mililitre büyüme ortamı ile doldurun ve herhangi bir tahlil yapılmadan önce hücrelerin en az bir saat iyileşmesine izin verin Bu prosedürde, kayıt solüsyonunu yapın ve pH'ı 7.4'e ayarlayın. Şimdi mavi bir MPD şişesine dört mililitre oda sıcaklığında tampon ekleyin, iyice karıştırın ve mililitre kayıt çözeltisi başına beş mikrolitre boya ekleyin. Bundan sonra, hücreleri iki mililitre 2.5 milimolar glikoz kayıt çözeltisi içinde 34 santigrat derecede boya ile 30 dakika boyunca ışıktan korunarak inkübe edin.

Daha sonra şırınga pompalarını 2.5 veya 0.1 milimolar glikoz kayıt solüsyonu ve füzyon sistemini 2.5 milimolar glukoz kayıt solüsyonu ile doldurun. Hortumu 60 mililitrelik şırıngalardan bir manifolda bağlayın. Manifold çıkış borusu, bir hat içi ısıtıcıya ve daha sonra kapalı bir odaya bağlanan polietilen boruya bağlanmalıdır.

Perfüzyon sistemini çalıştırarak ve gerekirse sert bir cisimle vurarak kabarcıkları temizleyin. Ardından perfüzyon hızını dakikada 0,5 mililitreye ayarlayın ve sistemi kurmak için mümkün olan en kısa süre için minimum ışık kullanın. Daha sonra, yapışık nöronlara sahip 25 milimetrelik bir kapak kızağını kapalı odaya aktarın.

Kapak kaymasının kurumasına izin vermemeye ve hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin. Kaymayı alt parçanın oluklarına hizalayın. Yanlara birkaç damla kayıt solüsyonu yerleştirin ve kapak kızağını yerinde tutmak için üst parçayı nazikçe yerleştirin.

Ardından, hazneyi kayıt solüsyonu ile doldurmak için bir damlalık kullanın ve üstüne 18 milimetrelik bir kapak fişi yerleştirin. Daha küçük kapak kızağını yerinde tutmak için beyaz halkayı yavaşça hazneye yerleştirin. Bundan sonra, kapalı hazneye hava kabarcıklarının girmesini önlemek için beyaz halkayı çok yavaş ve hafifçe bastırın.

2.5 milimolar glikoz kayıt çözeltisi için şırınga pompasını başlatın. Ardından beyaz halkaya bastırın ve kapalı odaya bağlanın. Beyaz halkadaki basıncı yavaşça boşaltın ve bir atık kabına giden boruya bağlayın.

MPD Görüntüleme Merkezi için, düşük parlak alan ışığı kullanan nöronlar. Hücrelerin ışığa maruz kaldığı süreyi en aza indirmeye çalışın ve hazırlama sırasında sıcaklığın, odaklanmanın ve kalıp dengesinin stabilizasyonu için perfüzyon sisteminin 10 dakika çalışmasına izin verin. METAMORPH programını açın ve 10 kat büyütmede nöronların parlak bir alan görüntüsünü alın.

Üç yığın floresan görüntü çekmek ve odağı beş mikron içinde belirlemek için otomatik odaklama işlevini kullanın. 10 dakikalık hazırlama süresinin sonunda odağı bir kez daha kontrol edin, ardından 40 dakika boyunca her 30 saniyede bir floresan görüntüler kaydetmeye başlayın. 10 dakika boyunca 2.5 milimolar glikozda bir taban çizgisi oluşturun.

Daha sonra glikozu 15 dakika azaltın ve son olarak 15 dakika boyunca 2.5 milimolar glikoza geri dönün. Tüm floresan görüntüleri kaydettikten sonra, nöronların parlak alan görüntüsünü alın. Bu şekil, yetişkin bir fareden alınan sağlıklı VMH nöronlarının parlak alan görüntüsünü göstermektedir.

Bu görüntü ayrışmadan 24 saat sonra çekildi ve MPD görüntüleme için kullanıldı. Analiz için kullanılacak veya kullanılmayacak birkaç nöron örneği gösterilmiş olarak işaretlenmiştir. Yeşil ile gösterilen bir GI nöronun temsili MPD floresan izleri ve turuncu hücrelerle gösterilen GI olmayan bir nöronun 10 dakika boyunca 2.5 milimolar glikoz kayıt çözeltisi ile perfüze edilmesi, ardından 15 dakika boyunca 0.1 milimolar G'ye düşme ve 15 dakika boyunca 2.5 milimolar G'ye dönüş.

Bu şekil, floresan MPD görüntüleme kullanılarak tespit edilen azalmış glikoza yanıt olarak geri dönüşümlü olarak depolarize olan yetişkin VMH nöronlarının yüzdesini göstermektedir. Glikoz değişiminin büyüklüğü, bu prosedürü takiben depolarizan nöronların yüzdesi ile pozitif olarak ilişkilidir. Tek hücreli R-T-P-C-R gibi diğer yöntemler, glikoz algılayıcı nöronlar tarafından eksprese edilen spesifik proteinleri tanımlamak için gerçekleştirilebilir.