Bağışıklık Sağlam İnsan MUC1 Transgenik Farelerde İnvaziv Geçici Hücre Mesane Karsinomu indüksiyon: immünoterapi Kalkınma İçin Bir Model

Aşağıdaki deneyin genel amacı, mesane kanserinde tümörle ilişkili bir antijeni hedef alan bir sitotoksik T lenfosit yanıtını etkili bir şekilde indüklemektir. Bu, insan tümörü ile ilişkili antijen mach one'ı eksprese eden farelerde mesane kanserini indükleyerek elde edilir. Daha sonra, farelere bir peptit aşısı enjekte edilir ve bir mach spesifik sitotoksik T lenfosit yanıtı oluşturulur.

Daha sonra serum tümörü ve dalak izole edilir ve dokular sırasıyla sitokinler, antijenler ve immün yanıt açısından analiz edilir. Western blot multipleks, florometrik mikroboncuk, immünoassay immünohistokimyası ve canlı nokta analizinin kullanılması, mesane kanserine karşı bir peptit aşısının etkinliğini test etmemizi sağlar. Merhaba, ben Dr.Gregory Wetz, Sacramento, California'daki California Üniversitesi Davis Sağlık Sistemi'nde araştırma bilimcisiyim.

Bu tekniğin ksenogreftler gibi mevcut yöntemlere kıyasla en büyük avantajı, ksenogreftlerin immün sistemi baskılanmış konakçılara ihtiyaç duymasıdır, oysa modelimiz, peptit aşısının hedefi olan insan tümörü ile ilişkili bir antijeni ifade eden immün sağlam bir transgenik fare kullanır. Teknikleri benimle birlikte göstermek, hepsi araştırma bilimcisi olan Daniel V ve Doktorlar Chaga ve Audrey Gutierrez ve Dr.Michael de Gregorio'nun laboratuvarı ve uc Davis Sağlık Sistemi olacak. Mesane kanserini indüklemek için ilk doz N butil, N dört hidroksi, butil NİTROZAMİN veya OHBBN dozunu uygulamadan önce, tam kan ve kan pıhtılaşma tüplerini toplamak için her farede submandibular kanama yapın ve kanın pıhtılaşması için 30 dakika bekleyin.

Paslanmaz çelik 20 gauge gavaj iğneleri kullanarak sekiz haftadan başlayarak, OHVBN'yi 12 hafta boyunca haftada beş gün oral olarak uygulayın. 20. haftada, liyofilize peptit aşısının her bir şişesini sulandırmak için 600 mikrolitre% 0.9 steril salin kullanın ve çözeltiyi salin kullanarak altı kez 0.5 inç 27 gauge iğneden çekerek iyice yeniden süspanse edin. Konsantrasyonu, son O-H-B-B-N dozundan sonra istenen doz 100 mikrolitrelik bir hacimde verilecek şekilde ayarlayın ve son O-H-B-B-N dozundan sekiz hafta sonra 100 mikrolitre aşı enjekte etmek için 25 gauge iğne kullanarak aşıyı sekiz haftalık bir döngü boyunca haftalık olarak uygulayın.

Tüm fareleri karbondioksit asfiksiasyonu ile ötenazi yaptıktan sonra, her fareyi bir diseksiyon tahtasına yerleştirin ve dört uzvu da sabitleyin. Daha sonra, forseps ve makas kullanarak, üst karın bölgesinde yatay bir kesi yapın. Makası epidermal tabaka ile karın duvarı arasındaki kesiye sokun ve forseps yardımıyla cildi alttaki dokudan nazikçe ayırın.

Orta ekseni takip eden yatay kesiden farenin ön ucuna doğru dikey bir kesi yapın. Daha sonra cildi göğüs kafesinden ayırın ve bir mililitrelik bir şırınga ve 22 gauge bir iğne kullanarak kalbi delin ve forseps ve makas kullanarak pürüzsüz ve sabit bir çekme ile kan toplayın. Epidermal tabakanın geri kalanını biyolojik bir güvenlik kabini içinde kesin ve soyun.

Karın duvarını ve peritonu kesin ve aseptik olarak. İmmünohistokimya veya IHC için mesane tümörünü ve IHC için Western blot'u çıkarın. Mesane tümörü örneğini bir doku kasetine yerleştirin ve gece boyunca soğutulmuş forminde sabitleyin.

Oda sıcaklığında, hücre canlılığı analizi için dalağı toplayın ve multipleks floro metrik mikrop immünolojik testini gerçekleştirmek için bir yalan noktası toplayın. Önceden ıslatmak için 200 mikrolitre tahlil tamponu kullanın. Filtrenin tamamen ıslanmasını sağlayan 96 kuyulu filtre alt plakası.

Daha sonra, filtreyi nazikçe boşaltmak için 96 kuyulu bir plaka vakum cihazı kullanın ve çok kanallı bir pipet kullanarak plakanın altını kanla kurutmak için kağıt havlu kullanın, boşluklar ve standartlar için atanan kuyucuklara 25 mikrolitre serum matrisi pipetleyin ve pipetleyin 25 mikrolitre tahlil tamponu kontroller ve bilinmeyenler için atanan kuyucuklara. Daha sonra, boş standartlardan, kontrollerden ve bilinmeyenlerden 25 mikrolitreyi ilgili atanan kuyucuklara pipetleyin. Boncuk karışımını 20 saniye boyunca girdaplayın ve boncukları bir rezervuara aktarın.

Daha sonra her birine 25 mikrolitre boncuk karışımı pipetleyin. Plakayı ışıktan korumak için iyice örtün ve plakayı oda sıcaklığında iki saat boyunca 500 RPM'de bir çalkalayıcı üzerinde sallayın, plakayı boşaltın ve boşaltmadan ve kurulamadan önce iki kez yıkamak için 200 mikrolitre PBST kullanın. Tespit antikoru çözeltisini hazırlamak için, gerekli miktarda% 0.1 PBST ve tespit antikorunu 15 mililitrelik bir tüpte birleştirin ve 10 saniye boyunca girdap yapın.

Daha sonra her birine 25 mikrolitre pipetleyin. Plakayı oda sıcaklığında bir saat boyunca 500 RPM'de çalkalayın. Daha sonra plakayı 200 mikrolitre% 0.1 PBST ile boşaltın ve yıkayın, iki kez boşaltın ve kurulayın, her birine 25 mikrolitre taze hazırlanmış strep, AVID ve FICO eryn veya SAPE pipeti kurulayın, plakayı plaka çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 500 RPM'de 30 dakika inkübe edin.

Süzün ve PBST ile iki kez yıkayın. Boncukları askıya almak için, her bir oyuğa 100 mikrolitre% 0.1 PBST ekleyin ve en az iki dakika boyunca 500 RPM'de çalkalayın. Biyolojik güvenlik kabinindeki plakayı okumak ve analiz etmek için Luminex LX 200 makinesini kullanın.

Fare dalaklarını 100 mikrometre naylon doku eleklerinden geçirerek steril Petri kaplarında beş mililitre steril PBS'ye işleyin. PLE aytes'i steril 15 mililitrelik tüplerde üç mililitre lenfosit ayırma ortamı üzerine katmanlayın. Tüpleri 600 GS'de 15 dakika santrifüjleyin.

Lenfositleri kırmızı kan hücrelerinden ayırmak için, gradyanın üzerindeki katmanlı lenfositleri 1.5 mililitrelik vidalı kapaklı santrifüj tüplerinde yeni steril 15 mililitrelik tüplere aktarın. Lenfositlerin seri seyreltilmesini yapmak için countin canlılık reaktifi kullanın. Sonra ilham perisi üzerinde analiz edin.

Plakayı üreticinin protokolüne göre hazırlayarak müttefik spot plaka için numunelerin ve koşulların bir plaka haritasını hazırlayın ve her birine 100 mikrolitre orta peptit veya karıştırma peptit pipetleyin. 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. ALI nokta testi için üreticinin protokolünü takip edin ve geliştirilen Aly nokta plakasını analiz etmek için diseksiyon mikroskobunu kullanın.

Her bir kuyucuktaki her bir analite karşılık gelen renkli noktaların sayısını sayarak sonuçları ölçün. Lekeler, kimyasal kanserojen ile transgenik fare model indüksiyonumuzdaki her bir oyukta nokta oluşturan hücrelerin sayısına karşılık gelir. O-H-B-B-N, bu şekilde gösterildiği gibi insanlarda mesane kanserine benzer olan bazı skuamöz hücreli karsinom veya SCC ile ağırlıklı olarak geçiş hücreli karsinom veya TCC'nin yüksek oranda mesane kanseri vakalarına neden oldu.

O-H-B-B-N indüksiyonundan sekiz hafta sonra, hem mach one, transgenik veya TG hem de vahşi tip fareler için mesane kanseri insidans oranı %67 idi. Hematin ve eozin boyama, hem TCC'lerin hem de SCC'lerin varlığını doğruladı ve TCC'ler iki ila bir oranında baskındı. Bunlar arasında, düşük ve yüksek dereceli non-invaziv ve yüksek dereceli invaziv tümörler arasında bir dizi gözlemledik. Tüm Mach bir mesane kanseri örnekleri, IHC tarafından mach one ekspresyonu için pozitifti.

Model geliştirme sırasında, inflamatuar sitokinlerin serum seviyeleri sekiz ila 28 hafta arasında seri olarak izlendi. İnflamatuar sitokin düzeylerinin indüksiyondan çalışmanın sonuna kadar zaman içinde arttığını gözlemledik. Bu sitokin paterni, akciğer kanseri modelimizde daha önce gözlemlediğimize çok benzer, bu da artan inflamatuar sitokin seviyelerinin tümör gelişimi ile ilişkili olabileceğini kuvvetle düşündürmektedir.

Peptit aşısına karşı bir serum sitokin yanıtını değerlendirmek için, 15 aşılanmış ve 14 plasebo ile tedavi edilmiş mach bir TG faresine ötenazi yapıldı ve çalışmanın sonunda kan alındı. Son aşı tedavisinden 24 saat sonra. Multipleks analiz, aşı grubunda TNF, alfa interferon gama, IL, iki IL 12 ve IL 17'nin serum sitokin seviyelerinde artış olduğunu göstermektedir.

Plasebo grubu ile karşılaştırıldığında, aşı ile tedavi edilen farelerde TNF, alfa, interferon, gama ve IL 17 seviyeleri anlamlı olarak daha yüksekti. Bu sonuçlar, peptit aşısına karşı TH bir, TH iki immün yanıtı değerlendirmek için peptit aşısına karşı bir inci polarize sitokin yanıtı önermektedir. SP sitleri interferon gama IL ile değerlendirildi dört ALI spotu, burada gösterilen ALI spot plakalarının canlı lenfositlerle tohumlanmasından sonra izole lenfositlerin canlılık açısından bir değerlendirmesidir, bu deneydeki sonuçlar açık ve spesifik interferon gama tepkisiydi peptit, bu da peptit aşısına karşı TH bir bağışıklık tepkisini doğrular Geliştirildikten sonra.

Bu teknik, kanser immünolojisi alanındaki araştırmacıların, ileri mesane kanserinin klinik öncesi bir modelini kullanarak yeni immünoterapötikleri keşfetmelerinin yolunu açtı.