Name: İn vitro Yerli Proteinlerden Hızlı Amiloid Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Öğrenin, MES tamponu ve yüksek sıcaklık kullanarak yerli proteinleri hızlıca amiloid fibrillere dönüştürme yöntemini. EDC çapraz bağlama ile stabilize çözünür protein oligomerleri oluşturarak hibrit amiloid yapıları elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe AI074809 ve Texas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi Kurumsal Araştırma Hibe Programı'ndan WC'ye verilen hibelerle desteklenmektedir.

1. MES Arabelleğini Hazırlayın
<ol>
	<li>Hem sadece protein amiloid hem de stabilize çözünür protein oligomerlerini hazırlamak için MES tamponu (0.1 M 2- (N-morfolino) etansülfonik asit ve 0.9 M NaCl) kullanın. 1.95 g MES ve 5.27 g NaCl ağırlığında. H2Oekleyin ve pH'ı 4.7'ye ayarlayın. Son hacmi 100 ml'ye kadar tamamlayın. 4º C'de 6 aya kadar saklayın.</li>
</ol>
2. Yalnızca Protein İçeren Amiloidi Doğrudan Doğal Proteinlerden Hazırlayın
<ol>
	<li>Tercih edilen proteini (herhangi bir doğal protein veya peptit) tartın ve MES tamponunda 10 mg / ml'ye kadar sulandırın.</li>
	<li>65 °C'de bir su banyosunda 4 saat inkübe edin. Dönemin sonunda, çözeltide beyaz çökelti görülebilir.</li>
	<li>Numuneyi %10 (h/h) Tris-HCl (1 M, pH 10.5) ile nötralize edin.</li>
	<li>Daha fazla analiz için istenen tampona geçmek için proteini gece boyunca bir diyaliz kasetinde diyaliz edin.</li>
	<li>Doğal proteinin bir kontrol numunesi, ısı çökeltmesi olmadan 2.1, 2.3 ve 2.4 adımları izlenerek hazırlanabilir (adım 2.2).</li>
</ol>
3. Doğal Proteinlerin Stabilize Çözünür Oligomerlerinden Hibrit Amiloid Hazırlayın
<ol>
	<li>Stabilize çözünür protein oligomerleri hazırlayın
	<ol>
		<li>Tercih edilen proteini tartın ve MES tamponunda 10 mg / ml'ye kadar sulandırın. 15 dakika oda sıcaklığında bırakın.</li>
		<li>1-etil-3- [3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorürü (EDC) tartın ve MES tamponunda 20 mg / ml'lik taze bir stok hazırlayın.</li>
		<li>Protein ve EDC çözeltilerini 2: 5 (h / v) oranında karıştırın, yani her 10 mg EDC için 2 mg protein.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.</li>
		<li>Numuneyi %10 (h/h) Tris-HCl (1 M, pH 10.5) ile nötralize edin.</li>
		<li>Daha fazla analiz için istenen tampona geçmek için proteini gece boyunca bir diyaliz kasetinde diyaliz edin.</li>
		<li>Stabilize çözünür protein oligomerini 4 ºC'de 4 haftaya kadar saklayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stabilize edilmiş çözünür protein oligomerinden hibrit amiloidler hazırlayın.
	<ol>
		<li>DNA içeren amiloid hazırlamak için, DNA ve stabilize edilmiş çözünür protein oligomerini 1: 1 oranında (a / a) karıştırın. 4 ºC'de en az 2 saat bekletin. Bu süre zarfında, başlangıç protein konsantrasyonu 0.5 mg / ml veya daha yüksek olduğunda çözeltide çözünmeyen çökelti görülebilir.</li>
		<li>RNA içeren amiloid hazırlamak için, RNA ve stabilize çözünür protein oligomerini 1:1 oranında (a/a) karıştırın. 4 ºC'de en az 2 saat bekletin. Bu süre zarfında, başlangıç protein konsantrasyonu 0.5 mg / ml veya daha yüksek olduğunda çözeltide çözünmeyen çökelti görülebilir.</li>
		<li>Heparin içeren amiloid hazırlamak için, heparin ve stabilize çözünür protein oligomerini 1: 1 oranında (a / a) karıştırın. 4 ºC'de en az 2 saat bekletin. Bu süre zarfında, başlangıç protein konsantrasyonu 0.5 mg / ml veya daha yüksek olduğunda çözeltide çözünmeyen çökelti görülebilir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+proteins+in+fatal+ways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding proteins in fatal ways.</a> Nature. 426, 900-904 (2003).</li>
<li>Schnabel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding%3A+The+dark+side+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein folding: The dark side of proteins.</a> Nature. 464, 828-829 (2010).</li>
<li>Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+and+protection+against+misfolded+or+damaged+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins.</a> Nature. 426, 895-899 (2003).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+functional+amyloid%2C+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366 (2006).</li>
<li>Goldschmidt, L., Teng, P. K., Riek, R., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+amylome%2C+proteins+capable+of+forming+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3487-3492 (2010).</li>
<li>Fowler, D. M., Koulov, A. V., Balch, W. E., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+amyloid+-+from+bacteria+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional amyloid - from bacteria to humans.</a> Trends Biochem. Sci. 32, 217-224 (2007).</li>
<li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Escherichia+coli+Curli+Operons+in+Directing+Amyloid+Fiber+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Escherichia coli Curli Operons in Directing Amyloid Fiber Formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li>
<li>Barnhart, M. M., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curli+Biogenesis+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Curli Biogenesis and Function.</a> Annu. Rev. Microbiol. 60, 131-147 (2006).</li>
<li>Claessen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+n%09olved+in+aerial+hyphae+formation+in+Streptomyces+coelicolor+by+forming+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A n	olved in aerial hyphae formation in Streptomyces coelicolor by forming amyloid-like fibrils.</a> Genes Dev. 17, 1714-1726 (2003).</li>
<li>Maji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Amyloids+As+Natural+Storage+of+Peptide+Hormones+in+Pituitary+Secretory+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional Amyloids As Natural Storage of Peptide Hormones in Pituitary Secretory Granules.</a> Science. 325, 328-332 (2009).</li>
<li>Badtke, M. P., Hammer, N. D., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Amyloids+Signal+Their+Arrival%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Functional Amyloids Signal Their Arrival.</a> Sci. Signal. 2, pe43(2009).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIP1%2FRIP3+Necrosome+Forms+a+Functional+Amyloid+Signaling+Complex+Required+for+Programmed+Necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RIP1/RIP3 Necrosome Forms a Functional Amyloid Signaling Complex Required for Programmed Necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li>
<li>Stefani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+biophysical+features+of+both+oligomer%2Ffibril+and+cell+membrane+in+amyloid+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Biochemical and biophysical features of both oligomer/fibril and cell membrane in amyloid cytotoxicity.</a> FEBS J. 277, 4602-4613 (2010).</li>
<li>Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+classification+of+toxic+amyloid+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural classification of toxic amyloid oligomers.</a> J. Biol. Chem. 283, 29639-29643 (1074).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+with+nucleic+acids+or+glycosaminoglycans+converts+soluble+protein+oligomers+to+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding with nucleic acids or glycosaminoglycans converts soluble protein oligomers to amyloid.</a> J. Biol. Chem. 287, 736-747 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+in+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).</li>
<li>Jiménez, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-DNA+Interaction+at+the+Origin+of+Neurological+Diseases%3A+A+Hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Alzheimer%27s+Dis%22%5BJournal%5D)">Protein-DNA Interaction at the Origin of Neurological Diseases: A Hypothesis.</a> J. Alzheimer's Dis. 22, 375-391 (2010).</li>
<li>Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Mechanism+of+Aggregation+and+Fibril+Formation+from+Bovine+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).</li>
<li>Vetri, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+Serum+Albumin+protofibril-like+aggregates+formation%3A+Solo+but+not+simple+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Bovine Serum Albumin protofibril-like aggregates formation: Solo but not simple mechanism.</a> Arch. Biochem. Biophysics. 508, 13-24 (2011).</li>
<li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li>
<li>McParland, V. J., Kalverda, A. P., Homans, S. W., Radford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+properties+of+an+amyloid+precursor+of+b2-microglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural properties of an amyloid precursor of b2-microglobulin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 9, 326-331 (2002).</li>
<li>Chiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+conditions+for+in+vitro+formation+of+amyloid+protofilaments+and+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3590-3594 (1999).</li>
<li>McParland, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+Unfolded+States+of+b2-Microglobulin+and+Amyloid+Formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro.</a> Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).</li>
<li>Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glimpse+of+a+possible+amyloidogenic+intermediate+of+transthyretin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).</li>
<li>Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+aggregation+kinetics+of+the+repeat+domain+of+a+functional+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Pmel17.+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid.</a> Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid-containing+amyloid+fibrils+potently+induce+type+I+interferon+and+stimulate+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).</li>
<li>Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β.</a> Nat. Immunol. 9, 857(2008).</li>
<li>Masters, S. L., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+amyloid+and+misfolded+protein+aggregates+activate+the+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome.</a> Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).</li>
</ol>

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Burada açıklanan yöntem, hemen hemen her protein veya tercih edilen peptitten in vitro amiloid fibrilleri hazırlamak için hızlı ve esnek bir yol sunar. Birkaç farklı amiloid türü güvenilir bir şekilde hazırlanabilir - yalnızca protein içeren fibriller veya DNA, RNA veya glikozaminoglikanlar içeren hibrit agregatlar. İlgili prosedürler basit, anlaşılırdır ve ileri düzeyde teknik eğitim gerektirmez. Bu yöntemle hazırlanan amiloid oldukça stabildir ve 4 ºC'de güvenle saklanabilir veya -80 ºC'de daha uzun süre dondu...

Proteinler, tüm hücre tiplerinde en bol bulunan biyolojik makromoleküllerdir. Çok çeşitli boyutlarda, yapılarda ve translasyon sonrası modifikasyonlarda ortaya çıkarlar ve doğal formlarında olduklarında çok çeşitli önemli biyolojik işlevleri yerine getirirler. Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve Tip 2 Diyabet1-4 gibi çok sayıda insan patolojik durumunda iki düzineden fazla anormal polipeptit rol oynamıştır. Terminal yanlış katlanmış proteinler, hücre dışı veya hücre içi olarak meydana gelen çözünmeyen kararlı agregatlar olan amiloid fibrilleri olarak birikir.
Bazı hastalıklarda spesifik proteinlerin ima edilmesine rağmen, artan kanıtlar tüm polipeptitlerin amiloid dönüşümünü sağlayan içsel özelliklere sahip olduğu fikrini desteklemektedir. Genom çapında bir dizi araştırması, amiloid eğilimli fragmanların E. coli'den insanlara kadar tüm kodlama peptit segmentlerinin kabaca %15'ini oluşturduğu "amilomu" tanımladı5. Buna göre, son yıllarda çeşitli önemli hücresel süreçlere katılan artan sayıda fonksiyonel amiloid keşfedilmiştir. Örneğin, bakteriler, hayatta kalmaları ve patogenezleri için kritik olan biyofilm ve spor yapıları oluşturmak için amiloidleri bir araya getirir6-9. Peptit hormonları, salınmadan önce memeli salgı granülleri içinde depolama sırasında amiloid birikintileri oluşturur, bu da protein amiloid formunun yararlı biyolojik işlevlere hizmet edebileceğini ima eder6,10,11. Ayrıca, proteinler kritik hücresel sinyalleri iletmek için amiloid fibriller halinde de birleşebilir12,13.
Uzun yıllar boyunca, en çok çalışılan amiloidler, amiloid beta veya prion peptidi gibi insan hastalıklarıyla ilişkili bireysel peptitlerden hazırlanır. Bu peptitler genellikle iyi tanımlanmış bir yapıdan yoksundur ve zamanla çözelti içinde kendiliğinden amiloid oluşturur, bu da çözünmeyen amiloidin öncüsü olarak hizmet eden kısmen yanlış katlanmış bir ara maddenin aracılık ettiği bir süreçtir. Amiloidin öncüsü, doğal peptitlerden(14,15) üretildiğinde nadir ve kararsız olan çözünür protein oligomeri olarak da adlandırılır. Bununla birlikte, daha önce tarif edildiği gibi, prensip olarak hemen hemen her protein, uygun koşullar altında amiloid konformasyonunu benimseyebilir. Son zamanlarda, çeşitli kofaktörlerin16 varlığında kolayca amiloid oluşturan doğal proteinlerin stabilize çözünür oligomerlerini hazırlamak için bir yöntem oluşturduk. Elde edilen amiloid fibriller, terminal protein yanlış katlanma agregatlarının karmaşık doğasını yansıtır17,18. Burada, kofaktör içermeyen protein fibrillerini ve proteinli olmayan bileşenler içeren fibrilleri ifade etmek için hibrit amiloid terimini kullanıyoruz.
Önceden, yüksek sıcaklık, hidrofobik ortam vepH değişimleri 19-23 gibi protein yanlış katlanmasını desteklediği bilinen koşulları uygulayarak in vitro amiloid üretmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, düşük verimlilik, tersine çevrilebilir katlama, büyük parti varyasyonları veya yavaş kinetik gibi çeşitli problemlerle ilişkilidirler. Burada açıklanan yaklaşım tekrarlanabilir, ölçeklendirilmesi kolaydır ve amiloid dönüşümünün zamanlamasını ve durumunu hassas bir şekilde kontrol etmeye izin verir.

<table><tbody><tr><td>2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>1-etil-3 - [3-dimetil-aminopropil] karbodiimid hidroklorür (EDC)</td> <td>Thermo / Pierce</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>Somon sperminden DNA</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Torula mayasından</td><td>RNA Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Domuz bağırsak mukozasından heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Ekipman:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Su banyosu</td><td>Fisher Science</td><td>Isotemp 210</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer diyaliz kaseti</td><td>Thermo / Pierce</td><td>66380</td><td></td></tr></tbody></table>

İn vitro yerli proteinlerden hızlı amiloid Üretimi

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteinler, belirli üç boyutlu kıvrımlarından ortaya çıkan işlevleri yerine getirerek organizmalarda çok önemli görevleri yerine getirirler. Polipeptitlerin doğal yapıları birçok amacı yerine getirmesine rağmen, çoğu proteinin alternatif bir beta tabakası zengin amiloid montajını benimseyebileceği kabul edilmektedir. Çözünmeyen amiloid fibriller başlangıçta birden fazla insan rahatsızlığı ile ilişkilidir, ancak giderek artan bir şekilde çeşitli önemli hücresel süreçlere katılan fonksiyonel oyuncular olarak gösterilmektedirler. Ek olarak, hasta dokularında biriken amiloid, nükleik asitler ve glikozaminoglikanlar (GAG'ler) gibi proteinli olmayan bileşenler içerir. Bu kofaktörler, amiloid oluşumunu kolaylaştırabilir ve bu da farklı tipte çözünmeyen çökeltilerin oluşmasına neden olabilir. Proteinlerin, çözünür amiloid öncüsünün bir ara aşaması yoluyla nasıl yanlış katlandığını anlamamızdan yararlanarak, doğal proteinleri in vitro olarak amiloid fibrillere dönüştürmek için bir yöntem geliştirdik. Bu yaklaşım, amiloidin büyük miktarlarda hazırlanmasına, spesifik proteinlerden üretilen amiloidin özelliklerinin incelenmesine ve dönüşüme eşlik eden yapısal değişikliklerin değerlendirilmesine olanak tanır.

Doğal proteinlerin doğrudan amiloide dönüştürülme yeteneği, MES tamponu içerisinde yüksek sıcaklıkta meydana gelen konformasyonel değişime dayanmaktadır. Çözeltideki çökelme, protein agregasyonunun ve muhtemelen amiloid oluşumunun iyi bir göstergesidir. Öte yandan, çözünür protein oligomerlerin stabilize olmasına izin vermek için, MES tamponunda indüklenen oligomerik konformasyonu sabitlemek amacıyla proteinleri çapraz bağlamak için EDC kullanılır. Sonuç olarak, stabilize edilmiş protein oligomerleri, SDS-PAGE ile ayrışt...

Proteinler ya doğal bir yapıyı benimseyebilir ya da çözünmeyen amiloid'e yanlış katlanabilir. Yanlış katlanma yolunu destekleyen koşullar, farklı tipte amiloid fibrillerin oluşumuna yol açar. Burada açıklanan yöntemler, doğal proteinlerin in vitro olarak amiloid'e hızlı bir şekilde dönüştürülmesine izin verir.

İn vitro Yerli Proteinlerden Hızlı Amiloid Üretimi

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, in vitro olarak herhangi bir proteinden hızlı bir şekilde amiloid fis elde etmektir. Bu, yapının yanlış katlanmasını indüklemek için tercih edilen proteinin MES tamponunda çözülmesiyle elde edilir. Protein daha sonra yüksek sıcaklıkta inkübe edilebilir, bu da diğer kofaktörlerin yokluğunda amiloid oluşumunu destekler.Alternatif olarak, protein, amiloidin öncüsü olan stabilize çözünür protein bağları oluşturmak için EDC ile çapraz bağlanır. Son olarak, protein olmayan kofaktörler, uygun koşullar tarafından kolaylaştırıldığında doğal proteinlerin kolayca amiloid onayına dönüştürülebileceğini gösteren hibrit amiloid oluşumuna izin vermek için stabilize edilmiş çözünür protein oligomerleri ile karıştırılır. Bu yöntem, protein yanlış katlanma hastalıklarında, amiloidin çözünür protein oligomerlerinden ne kadar kesin olarak oluştuğu ve farklı amiloid türlerinin farklı biyolojik ve patolojik işlevlere sahip olup olmadığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Başlamak için, hem protein sadece amiloid hem de stabilize çözünür protein için metin protokolünde açıklandığı gibi MES tamponu hazırlayın. Tüm bağlar daha sonra tercih edilen proteini tartar ve MES tamponunda mililitre başına 10 miligrama kadar sulandırır. Bu gösteride, insan serum albümini veya HSA kullanılır, çözeltiyi dört saat boyunca bir su banyosunda 65 santigrat derecede inkübe edin.Dönemin sonunda, çözeltide beyaz bir çökelti görülebilir. Numuneyi hacim başına %10 hacimle nötralize edin. Bu nedenle, HCL, istenen tampona geçmek için gece boyunca bir diyaliz kasetindeki proteini diyaliz eder.Daha fazla analiz için, bu adımları ısı çökeltme olmadan izleyerek bir doğal protein kontrol numunesi hazırlayın. Stabilize çözünür protein hazırlamak için, tüm bağlar tercih edilen proteini tartar ve mililitre başına 10 miligrama kadar sulandırır. MES tamponunda, protein çözeltisini oda sıcaklığında 15 dakika bekletin.MES tamponunda mililitre EDC başına 20 miligramlık taze bir stok hazırlayın. Protein ve EDC çözeltilerini iki ila beş oranında karıştırın, ardından inkübasyonu takiben iki saat oda sıcaklığında inkübe edin. Numuneyi, tris HCL hacmi başına% 10 hacimle nötralize edin, proteini istenen tampona değiştirmek için gece boyunca bir diyaliz kasetinde diyaliz edin.Daha fazla analiz için. Stabilize edilmiş çözünür proteini tüm bağları dört santigrat derecede dört haftaya kadar saklayın. Bu süspansiyon, hem amiloid içeren DNA'nın hem de amiloid içeren RNA'nın hazırlanması için hibrit amiloidleri hazırlamak için kullanılacaktır.Karıştırın, nükleik asit ve stabilize edilmiş çözünür protein, tüm bağları bire bir oranda. Bu süre zarfında karışımı en az iki saat boyunca dört santigrat derecede bırakın. Çözünmeyen çökelti, ilk protein konsantrasyonu mililitre başına 0.5 miligram veya daha yüksek olduğunda çözelti içinde görülebilir.Amiloid içeren heparini hazırlamak için heparin ve stabilize edilmiş çözünür protein, tüm ligament en az iki saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edilmeden önce bire bir oranda. Nükleik aside benzer şekilde amiloidler içeren çözünebilir çökeltide çözelti içinde görülebilir. İlk protein konsantrasyonu mililitre başına 0.5 miligram veya daha yüksek olduğunda, doğal proteinleri doğrudan amilode dönüştürme yeteneği, yüksek sıcaklıkta meydana gelen onaylayıcı değişikliğe dayanır.MES tamponunda, çözeltideki çökelme, çözünür protein oligomerlerinin stabilize olmasına izin vermek için protein agregasyonunun ve olası amiloid oluşumunun iyi bir göstergesidir. EDC, MES tamponunda indüklenen oligomerik doğrulamayı katılaştırmak için proteinleri çapraz bağlamak için kullanılır. Sonuç olarak, stabilize protein allgası, monomerik doğal protein veya ısı ile indüklenen agregatlardan farklı multimerik proteinlerdir.SDS sayfası stabilize edilmiş çözünür protein ile ayrıldığında, tüm bağlar, hem DNA hem de RNA dahil olmak üzere nükleik asitlere dizi bağımsızlığı tarzında kolayca bağlanabilir. Bu nedenle, stabilize edilmiş çözünür protein, tüm bağlar ve DNA arasındaki doğrudan etkileşimi görselleştirmek için bir jel kaydırma testi gerçekleştirilebilir, bu da DNA'nın bir AROS jeli üzerinde gecikmiş göçüne neden olur. Sitotoksisite, çözünür proteinin arketipik bir karakteridir.Tüm ligamentler stabilize çözünür protein, tüm ligamentler, floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması ile tespit edilebilen doza bağlı olarak indüklenen hücre ölümü. Burada gösterildiği gibi, RP I 8 2 2 6 hücreleri, propidyum iyodür boyaması ile ölçülen tüm ligament kaynaklı ölüm olan çözünür proteine karşı son derece hassastır. Bu videoyu izledikten sonra, in vitro olarak seçtiğiniz herhangi bir proteinden farklı amiloid türlerini nasıl hazırlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.

rapid-generation-of-amyloid-from-native-proteins-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Doğal Proteinlerden In vitro Hızlı Amiloid Üretimi

SDD-YAŞ hücrelerde polimerler gibi amiloid algılama ve karakterizasyonu için yararlı bir tekniktir. Burada, bu tekniğin büyük ölçekli uygulamalarda mükellef kılar bir uyum göstermektedir.

Yarı denatüre Deterjan-Agaroz Jel Elektroforez Amiloid Toplama taraması

Kaynak: Balczon, R., ve diğerleri. Pulmoner Endotel Hücrelerinin Pseudomonas aeruginosa Tarafından Enfeksiyonunu Takiben Sitotoksik Amiloidleri Saptama Yöntemleri. J. Vis. Deneyim (2018)Bu video, Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonunu takiben pulmoner endotel hücrelerinden sitotoksik süpernatant üretme prosedürünü göstermektedir. Bakteriyel efektör proteinlerin konakçı hücre yapısını nasıl bozduğunu ve sitotoksik amiloid oligomerlerinin süpernatana salınmasını nasıl indüklediğini özetlemektedir.

Sıçan Pulmoner Endotel Hücrelerinin Bakteriyel Enfeksiyonunu Takiben Sitotoksik Amiloidlerin Elde Edilmesi

Biz solucan amylopathies yönlerini incelemek için yöntemler...

Bir<em&gt; Caenorhabditis elegans</emAmylopathy Çalışmaları&gt; Model Sistemi

Escherichia coli'de inklüzyon cisimcikleri olarak eksprese edilen rekombinant Shadoo proteininin saflaştırılması için iki aşamalı bir kromatografik yöntem ve ayrıca saflaştırılmış Shadoo'yu amiloid yapılara fibrillemek için bir protokol tanımlanmıştır.

Saflaştırma ve Amiloid fibrillerin kadar yeniden katlama (His)<sub&gt; 6</sub&gt; etiketli Rekombinant Shadoo Protein Eklenmesi Organları olarak ifade<em&gt; E.coli</em

Tıbbi, farmasötik, yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için Kanonik olmayan amino asit analoglarının proteinlere kalıntıya özgü dahil edilmesi için kullanımı kolay, hücresiz bir ekspresyon protokolü sunulmuştur.

Bir Kullanarak Modeli Proteinler içine Kuralsız Amino Asit kalıntı özgü Ortaklığın<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hücre içermeyen Transkripsiyon-çeviri Sistemi

Önceden klinik test için "yetim" ilaçların farmakolojik chaperones tekrarlanabilir, hızlı ve verimli olarak adlandırılan yeni bir sınıf yapmak için bir talep var. Biz uygun hastalar için hem de roman farmakolojik refakatçi uyuşturucu ekran basit, yüksek standart ve çok yönlü hücre kültür tabanlı tahlil geliştirilmiştir.

Vitro Enzim ölçüm Test farmakolojik refakatçi yanıt Fabry ve Pompe hastalığı için

Basit yöntem pulmoner endotel enfeksiyonu takip sitotoksik amyloids üretimini gösteren için Pseudomonas aeruginosatarafından açıklanmıştır.

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Aspergillus flavus büyüme ve aflatoksin üretim mısır çekirdekleri antifungal bir protein ifade içinde analiz etmek için bir iletişim kuralı mevcut burada.  A. flavus GFP ifade etmek zor kullanarak biz izlenen enfeksiyon ve gerçek zamanlı olarak olgun çekirdekleri içinde mantar yayılmasını. Tahlil hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Aspergillus flavus büyüme ve transgenik Mısır ifade α-amilaz inhibitörü Lablab purpureus L. gelen aflatoksin üretim inhibisyonu

Burada verilen farklı dokulardan ve beynin çeşitli bölgelerinden izole mitokondri ile farklı peptidler ve proteinlerin yerli formu, prefibrillar ve olgun amiloid fibrils arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir protokoldür.

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

Burada, insan γ-sekretazı yeniden yapılandıran bir maya sistemini tarif ediyoruz. Bu sistem, aktiviteyi etkileyen mutasyonların tanımlanmasına ve incelenmesine ve γ-sekretaz inhibitörlerinin (GSI'ler) taranmasına izin verir. Ailesel Alzheimer hastalığı mutantlarının fonksiyon kaybı özelliklerini kullanarak, γ-sekretaz modülatörlerini (GSM'ler) taramak mümkündür.

Saccharomyces cerevisiae Amiloid Beta Üretimini Etkileyen Genleri, Mutasyonları ve Kimyasalları γ-Sekretaz ile Taramak için Alzheimer Hastalığı Modelleri

Öğrenin, MES tamponu ve yüksek sıcaklık kullanarak yerli proteinleri hızlıca amiloid fibrillere dönüştürme yöntemini. EDC çapraz bağlama ile stabilize çözünür protein oligomerleri oluşturarak hibrit amiloid yapıları elde edin.

İn vitro Yerli Proteinlerden Hızlı Amiloid Üretimi

Daha fazla video keşfet