Name: İndirgeyici Olarak Metillenmiş Proteinler Üzerindeki 13C-Dimetil N-terminal Aminin NMR Rezonanslarını Belirleme Yöntemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Keşfedin, NMR rezonans ataması için lizozim üzerinde indirgeyici metilasyon ve amino peptidaz yöntemlerini. pH seçiciliği ve enzimatik parçalanma ile protein modifikasyonlarını analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüsü Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi'nden R00RR024105 Numaralı Ödül ile desteklenmiştir.

1. Lizozimin İndirgeyici Metilasyonu
<ol>
	<li>pH 7.5'te 500 ml 50 mM sodyum fosfat tamponu hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Tam etiketli numune (FLS), düşük pH'lı kısmen etiketli numune (LpH) ve yüksek pH'lı kısmen etiketli numune (HpH) için üç adet 1 ml'lik mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin.</li>
	<li>10 mg lizozimi tartın ve 5 mg / ml konsantrasyonda sulu bir çözelti oluşturmak için 2 ml sodyum fosfat tamponu içinde çözün. Formaldehitin ışığa maruz kalma nedeniyle bozulmasını önlemek için tüpleri alüminyum folyo ile örtün. Her tüpe 500 μl lizozim çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Taze 1.0 M dimetilamin boran kompleksi (DMAB) ve 13C-formaldehit çözeltileri hazırlayın. 0 °C'de saklayın.</li>
	<li>Tam etiketli numune için 1:10'luk bir molar oran (reaktif amin: formaldehit) kullanın ve kısmen etiketlenmiş numuneler için 1:5 oranı kullanın. Alternatif olarak, oran optimize edilebilir. Örneğin, düşük pH'ta α-13C-dimetilamin zirvesinin baskınlığını görmek için 2:7 oranı gerekliydi.</li>
	<li>FLS'ye 6.1 μl 1.0 M DMAB ekleyin, LpH ve HpH'ye 3.2 μl 1.0 M DMAB ekleyin ve hafifçe girdaplayın. Daha sonra FLS'ye 12.3 μl 1.0 M 13C-formaldehit ve LpH ve HpH'ye 6.1 μl 1.0 M 13C-formaldehit ekleyin. Reaksiyon karışımlarını 4 °C'de 2 saat çalkalayın.</li>
	<li>Önceki adımda olduğu gibi 1.0 M DMAB ve 13C-formaldehitten oluşan başka bir alikot ekleyin ve reaksiyon karışımını toplam 18-24 saatlik bir reaksiyon süresi için gece boyunca 4 °C'de çalkalayın.</li>
	<li>Bir santrifüj filtre (3 kDa moleküler ağırlık kesmesi) kullanarak fazla reaktifleri ve yan ürünleri çıkarmak için numunenin tamponunu pH 7.5'te fosfatla değiştirin.</li>
	<li>Kısmen etiketlenmiş numuneler için, homojen olarak modifiye edilmiş bir protein oluşturmak için numuneleri pH 7.5'te doğal bolluk formaldehit ile indirgeyici olarak metilleyin. Yeni 1,0 M DMAB ve doğal bolluk formaldehit çözeltileri hazırlayın.</li>
	<li>Numune tüplerini folyo ile örtün, LpH ve HpH'ye 6.1 μl DMAB ekleyin ve hafifçe girdaplayın. Ardından 12.3 μl doğal bolluk formaldehit ekleyin. Reaksiyon karışımlarını 4 °C'de 2 saat çalkalayın.</li>
	<li>Önceki adımda olduğu gibi 1.0 M DMAB ve doğal bollukta formaldehitten oluşan başka bir alikot ekleyin ve reaksiyon karışımlarını toplam 18-24 saatlik bir reaksiyon süresi için gece boyunca 4 °C'de çalkalayın. Daha sonra 2.5-2.6 adımlarını kullanarak tampon değişimi yapın ve MS için 50 μg numuneleri -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>
2. Numuneyi NMR Analizi için Hazırlayın
<ol>
	<li>H2O'da pH 8.5'te 2.0 M'lik bir sodyum borat tampon çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Dört adet 15 ml'lik konik tüpe 375 μl 2.0 M sodyum borat tampon çözeltisi ekleyin. Üstleri parafilm yapın ve delikleri açın. Şişeyi bir liyofilizan şişeye yerleştirin ve numuneyi dondurun.</li>
	<li>Dondurulmuş numuneyi kuruması için bir liyofilizatör üzerine yerleştirin. Kuruduğunda çıkarın.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak, her tüpe 15 ml D2O ekleyin ve karıştırın.</li>
	<li>Üç adet 4 ml'lik santrifüj filtreyi (3 kDa moleküler ağırlık kesme) FLS, LpH ve HpH ile etiketleyin. İlgili numuneyi filtre tüplerine (~500 μl) ekleyin. Her tüpe pH 8.5'te 3.0 ml 50 mM sodyum borat tamponu ekleyin. Üçüncü tüp için bir denge tüpü yapın ve 4 °C ve 7.500 rcf'de 35 ° sabit açılı rotorlu bir santrifüj kullanarak numuneleri 500 μl'ye konsantre edin.</li>
	<li>Her filtrenin altındaki tuzağı boşaltın. Numunelere 3.0 ml daha tampon ekleyin ve numuneleri tekrar 500 μl'ye konsantre edin. Adım 2.5 4x'i tekrarlayın.</li>
	<li>Bikinkoninik asit (BCA) protein tahlili36'yı kullanarak, her bir numunenin konsantrasyonunu belirleyin. 150 μM numune yapmak için lizozim numunelerini 50 mM sodyum borat tamponu ile seyreltin.</li>
	<li>530 μl'yi 5 mm'lik bir NMR tüpüne veya 250 μM'yi 5 mm'lik manyetik duyarlılığa uygun bir tüpe aktarın.</li>
	<li>D2O'da 1,2-dikloroetan-13 C2'den oluşan 80 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. Bu stok çözeltisini -80 ° C'de saklayın. 80 μl'de 24 mM'ye seyreltin ve NMR analizinde referans olarak kullanmak için koaksiyel yerleştirme tüpüne aktarın. Örnekleri NMR ile analiz edin. Not: Bir 1D 1 H-13C HSQC çalıştırın ve her rezonans için tepe alanlarını entegre edin. Tam etiketli numune için tepe alanları aynı olmalıdır.</li>
</ol>
3. Lizozimin Aminopeptidaz Bozunması
<ol>
	<li>Ultra saf suda 5 mg / ml'lik bir lizozim çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Temiz, 1 ml'lik bir santrifüj tüpüne 250 μl lizozim çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>25 μl 0.1 M trisin çözeltisi, pH 8.0 ve 6 μl 2.16 μg / ml Aeromonas proteolytica aminopeptidaz çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>37 °C'de 6 saat inkübe edin.</li>
	<li>Aminopeptidazın lizozime 1:50 molar oranı için numuneye 6 μl daha 2.16 μg/ml aminopeptidaz çözeltisi ekleyin. 37 ° C'de 20 saat daha inkübe edin.</li>
	<li>Bir C18 döndürme sütunu kullanarak numunenin 30 μl'sini tuzdan arındırın (üreticinin protokolünü izleyin). MALDI MS analizi için -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>Kalan protein örneğini protokol 2'de açıklandığı gibi NMR için hazırlayın).</li>
</ol>
4. Kütle Spektrometresi için Numune Hazırlayın
<ol>
	<li>Adım 2.3'te ayrılan 50 μg numuneyi kullanarak, tamponu 100 mM amonyum bikarbonat, pH 8.0 ile değiştirin ve 1 ml'lik bir santrifüj filtre (3 kDa moleküler ağırlık kesme) kullanarak yaklaşık 50 μl'ye konsantre edin. Numuneyi 1 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve alüminyum folyoya sarın.</li>
	<li>Disülfid bağlarını azaltmak için 2.0 μl 500 mM ditiyotreitol ekleyin. Çözeltiyi 60 ° C'de 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Tiyol gruplarını alkillemek için 2 μl taze hazırlanmış 500 mM iyodoasetamid ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Folyoyu çıkarın ve reaksiyonu söndürmek için 1.0 μl 500 mM ditiyotreitol çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Proteini sindirmek için 2.0 μg sıralama dereceli tripsin ekleyin. Karışımı 37 °C'de 16-24 saat inkübe edin.</li>
	<li>Sindirimi gidermek için pH 2'den az olana kadar TFA ekleyin. (Formik ve asetik asitler de kullanılabilir)</li>
	<li>Numuneyi bir C18 döndürme kolonunda tuzdan arındırın ve proteini %80 asetonitril / %0.1 TFA'da elüte edin. Numuneyi bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak kurutun.</li>
	<li>MALDI MS analizi için numuneyi 5.0 μl %50 asetonitril/%0.1 TFA'da sulandırın. MALDI hedef plakası üzerinde eşit hacimlerde sulandırılmış numune ve doymuş bir 2,5-dihidroksibenzoik asit matris çözeltisi çözeltisini karıştırın. Not: Peptit tepe noktalarının kimliğini doğrulamak için tandem MS kullanın. Kütle spektrumlarını düzeltin ve analiz edin. Her dimetilamin içeren peptit için, profildeki her izotopun tepe yoğunluğunu ve tepe alanını belirleyin. Daha önce açıklandığı gibi 13C-birleşmesinin yüzdesini hesaplayın34.</li>
</ol>

<ol><li>Bax, A., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+Advances+in+Protein+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological Advances in Protein NMR.</a> Accounts of Chemical Research. 26 (4), 131-138 (1993).</li>
<li>Shimba, N., Yamada, N., Yokoyama, K., Suzuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Labeling+of+Arbitrary+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Labeling of Arbitrary Proteins.</a> Analytical Biochemistry. 301 (1), 123-127 (2002).</li>
<li>Palomares, L., Estrada-Moncada, S., Ramírez, O. Production of Recombinant Proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalomares%2C+L+%22Recombinant+Gene+Expression%22">Recombinant Gene Expression</a>. Balbás, P., Lorence, A. 267, Humana Press. New York City, New York, USA. 15-51 (2004).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Production+and+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein Production and Purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Terwilliger, T. C., Stuart, D., Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+Structural+Genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Lessons from Structural Genomics.</a> Annual Review of Biophysics. 38, 371-383 (2009).</li>
<li>Goto, N. K., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Developments+in+Isotope+Labeling+Strategies+for+Protein+Solution+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">New Developments in Isotope Labeling Strategies for Protein Solution NMR Spectroscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10 (5), 585-592 (2000).</li>
<li>Lian, L., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelling+Approaches+for+Protein+Structural+Studies+by+Solution-State+and+Solid-State+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Nuclear+Magn.+Reson.+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Labelling Approaches for Protein Structural Studies by Solution-State and Solid-State NMR.</a> Progress in Nuclear Magn. Reson. Spectroscopy. 39 (3), 171-190 (2001).</li>
<li>Mason, A., Siarheyeva, A., Haase, W., Lorch, M., van Veen, H., Glaubitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+Acid+Type+Selective+Isotope+Labelling+of+the+Multidrug+ABC+Transporter+LmrA+for+Solid-State+NMR+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Lett%22%5BJournal%5D)">Amino Acid Type Selective Isotope Labelling of the Multidrug ABC Transporter LmrA for Solid-State NMR Studies.</a> Febs Lett. 568 (1-3), 117-121 (2004).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Amino-Acid-Type+Selective+Isotope+Labeling+of+Protein+Expressed+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%3AStructure+Function+and+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Preparation of Amino-Acid-Type Selective Isotope Labeling of Protein Expressed in Pichia pastoris.</a> Proteins:Structure Function and Bioinformatics. 62 (1), 279-287 (2006).</li>
<li>Means, G., Feeney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Alkylation+of+Amino+Groups+in+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Reductive Alkylation of Amino Groups in Proteins.</a> Biochem. 7 (6), 2192 (1968).</li>
<li>Jentoft, J. E., Jentoft, N., Gerken, T. A., Dearborn , D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR-Studies+of+Ribonuclease-A+Methylated+With+Formaldehyde-C-13.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR-Studies of Ribonuclease-A Methylated With Formaldehyde-C-13.</a> J. Biol. Chem. 254 (11), 4366-4370 (1979).</li>
<li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+alkylation+of+lysine+residues+to+alter+crystallization+properties+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Crystallography%2C+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Reductive alkylation of lysine residues to alter crystallization properties of proteins.</a> Macromolecular Crystallography, Pt A. 276 (97), 171-179 (1997).</li>
<li>French, D., Edsall, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Reactions+of+Formaldehyde+with+Amino+Acids+and+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">The Reactions of Formaldehyde with Amino Acids and Proteins.</a> Adv. Protein Chem. 2, 277-335 (1945).</li>
<li>Jentoft, N., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+Proteins+by+Reductive+Methylation+Using+Sodium+Cyanoborohydride%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Labeling of Proteins by Reductive Methylation Using Sodium Cyanoborohydride.</a> J. Biol. Chem. 254 (11), 4359-4365 (1979).</li>
<li>Walter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+Methylation+as+a+Routine+Rescue+Strategy+for+Protein+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Struct%22%5BJournal%5D)">Lysine Methylation as a Routine Rescue Strategy for Protein Crystallization.</a> Struct. 14 (11), 1617-1622 (2006).</li>
<li>Rypniewski, W., Holden, H., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Consequences+of+Reductive+Methylation+of+Lysine+Residues+in+Hen+Egg-White+Lysozyme+-+An+X-ray+Analysis+at+1.8-Angstrom+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Structural Consequences of Reductive Methylation of Lysine Residues in Hen Egg-White Lysozyme - An X-ray Analysis at 1.8-Angstrom Resolution.</a> Biochem. 32 (37), 9851-9858 (1993).</li>
<li>Bokoch, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-specific+regulation+of+the+extracellular+surface+of+a+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Ligand-specific regulation of the extracellular surface of a G-protein-coupled receptor.</a> Nat. 463 (7277), (2010).</li>
<li>Jentoft, J., Gerken, T., Jentoft, N., Dearborn, D. C-13] Methylated Ribonuclease-A - C-13 NMR Studies of the Interaction of Lysine 41 with Active Site. 256 (1), 231-236 (1981).</li>
<li>Sherry, A., Teherani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+Studies+of+C-13-Methylated+Concanavalin+A+-+pH+and+Co2%2B-Induced+Nuclear+Magn.+Reson.+Shifts.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Physical Studies of C-13-Methylated Concanavalin A - pH and Co2+-Induced Nuclear Magn. Reson. Shifts.</a> J. Biol. Chem. 258 (14), 8663-8669 (1983).</li>
<li>Dick, L., Sherry, A., Newkirk, M., Gray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Methylation+and+C-13+NMR+Studies+of+the+Lysyl+Residues+of+fd+Gene+5+Protein+-+Lysines+24%2C+46%2C+and+69+May+be+Involved+in+Nucleic+Acid+Binding.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reductive Methylation and C-13 NMR Studies of the Lysyl Residues of fd Gene 5 Protein - Lysines 24, 46, and 69 May be Involved in Nucleic Acid Binding.</a> J. Biol. Chem. 263 (35), 18864-18872 Forthcoming.</li>
<li>Moore, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-epsilon%2CN-epsilon-dimethyl-lysine+cytochrome+c+as+an+NMR+probe+for+lysine+involvement+in+protein-protein+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">N-epsilon,N-epsilon-dimethyl-lysine cytochrome c as an NMR probe for lysine involvement in protein-protein complex formation.</a> Biochem. J. 332, 439-449 (1998).</li>
<li>Jentoft, J. E., Gerken, T. A., Jentoft, N., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+Active-Site+Lysine+of+Ribonuclease-A+By+C-13+NMR.%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Studies of the Active-Site Lysine of Ribonuclease-A By C-13 NMR.</a> Biophys. J. 25 (2), 56 (1979).</li>
<li>Gerken, T., Jentoft, J., Jentoft, N., Dearborn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Interactions+of+Amino+Groups+in+C-13+Reductively+Methylated+Hen+Egg-White+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Interactions of Amino Groups in C-13 Reductively Methylated Hen Egg-White Lysozyme.</a> J. Biol. Chem. 257 (6), 2894-2900 (1982).</li>
<li>Dick, L. R., Geraldes, C., Sherry, A. D., Gray, C. W., Gray, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR+of+Methylated+Lysines+of+fd+Gene-5+Protein+-+Evidence+for+A+Conformational+Change+Involving+Lysine-24+Upon+Binding+of+A+Negatively+Charged+Lanthanide+Chelate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR of Methylated Lysines of fd Gene-5 Protein - Evidence for A Conformational Change Involving Lysine-24 Upon Binding of A Negatively Charged Lanthanide Chelate.</a> Biochem. 28 (19), 7896-7904 (1989).</li>
<li>Gluck, M., Sweeney, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13-NMR+of+Clostridium-Pasteurianum+Ferredoxin+After+Reductive+Methylation+of+the+Amines+Using+C-13+Formaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">C-13-NMR of Clostridium-Pasteurianum Ferredoxin After Reductive Methylation of the Amines Using C-13 Formaldehyde.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1038 (2), 146-151 (1990).</li>
<li>Jentoft, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Methylation+and+C-13+Nuclear-Magnetic-Resonance+in+Structure-Function+Studies+of+Fc+Fragment+and+Its+Subfragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reductive Methylation and C-13 Nuclear-Magnetic-Resonance in Structure-Function Studies of Fc Fragment and Its Subfragments.</a> Methods in Enzymology. 203, 261-295 (1991).</li>
<li>Sparks, D., Phillips, M., Lundkatz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Conformation+of+Apolipoprotein+A-I+in+Discoidal+and+Spherical+Recombinant+High+Density+Lipoprotein+Particles+-+C-13+NMR+Studies+of+Lysine+Ionization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Conformation of Apolipoprotein A-I in Discoidal and Spherical Recombinant High Density Lipoprotein Particles - C-13 NMR Studies of Lysine Ionization.</a> J. Biol. Chem. 267 (36), 25830-25838 (1992).</li>
<li>Ashfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Modification+of+a+Variant+of+Human+MIP-1+Alpha%2C+Implications+for+Dimer+Structure.%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Chemical Modification of a Variant of Human MIP-1 Alpha, Implications for Dimer Structure.</a> Protein Science. 9 (10), 2047-2053 (2000).</li>
<li>Goux, W., Teherani, J., Sherry, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+Inversion+in+Proteins+-+A+C-13-NMR+Study+of+Proton+Exchange+and+Nitrogen+Inversion+Rates+in+N-Epsilon%2CN-Epsilon%2CN-Alpha%2CN-Alpha-%5BC-13%5DTetramethyllysine%2C+N-Epsilon%2CN-Epsilon%2CN-Alpha%2CN-Alpha%5BC-13%5DTetramethyllysine+Methyl-Ester%2C+and+Reductively+Methylated+Concanavalin-A.%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amine Inversion in Proteins - A C-13-NMR Study of Proton Exchange and Nitrogen Inversion Rates in N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha-[C-13]Tetramethyllysine, N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha[C-13]Tetramethyllysine Methyl-Ester, and Reductively Methylated Concanavalin-A.</a> Biophysical Chemistry. 19 (4), 363-373 (1984).</li>
<li>Sherry, A. D., Keepers, J., James, T. L., Teherani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl+Motions+in+C-13+Methylated+Concanavalin-as+Studied+by+C-13+Magnetic-Resonance+Relaxation+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Methyl Motions in C-13 Methylated Concanavalin-as Studied by C-13 Magnetic-Resonance Relaxation Techniques.</a> Biochemistry. 23 (14), 3181-3185 (1984).</li>
<li>Huque, M., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR+Studies+of+the+Lysine+Side+Chains+of+Calmodulin+and+Its+Proteolytic+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR Studies of the Lysine Side Chains of Calmodulin and Its Proteolytic Fragments.</a> Journal of Protein Chemistry. 12 (6), 695-707 (1993).</li>
<li>Brown, L., Bradbury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-Magnetic-Resonance+Studies+of+Lysine+Residues+of+Ribonuclease-A%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proton-Magnetic-Resonance Studies of Lysine Residues of Ribonuclease-A.</a> Eur. J. Biochem. 54 (1), 219-227 (1975).</li>
<li>Zhang, M., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+Side+Chain+pKa+Values+of+the+Lysine+Residues+in+Calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of the Side Chain pKa Values of the Lysine Residues in Calmodulin.</a> J. Biol. Chem. 268 (30), 22420-22428 (1993).</li>
<li>Macnaughtan, M., Kane, A., Mass Prestegard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrometry+Assisted+Assignment+of+NMR+Resonances+in+Reductively+C-13-Methylated+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Spectrometry Assisted Assignment of NMR Resonances in Reductively C-13-Methylated Proteins.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (50), 17626-17627 (2005).</li>
<li>Cordova, E., Gao, J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncovalent+Polycationic+Coatings+for+Capillaries+in+Capillary+Electrophoresis+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Noncovalent Polycationic Coatings for Capillaries in Capillary Electrophoresis of Proteins.</a> Anal. Chem. 69 (7), 1370-1379 (1997).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Protein+Using+Bicinchoninic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Larda, S. T., Bokoch, M. P., Evanics, F., Prosser, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methylation+strategies+for+characterizing+protein+conformations+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomolec.+NMR%22%5BJournal%5D)">Lysine methylation strategies for characterizing protein conformations by NMR.</a> J. Biomolec. NMR. 54 (2), 199-209 (2012).</li>
<li>Bradbury, J. H., Brown, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Dissociation+Constants+of+Lysine+Residues+of+Lysozyme+by+Proton-Magnetic-Resonance+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of Dissociation Constants of Lysine Residues of Lysozyme by Proton-Magnetic-Resonance Spectroscopy.</a> Eur. J. Biochem. 40 (2), 565-576 (1973).</li>
<li>Frey, S. T., Guilmet, S. L., Egan, R. G., Bennett, A., Soltau, S. R., Holz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+the+Aminopeptidase+from+Aeromonas+proteolytica+on+Mg2%2B%2FAl3%2B+Layered+Double+Hydroxide+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Appl.+Mater.%2C+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Immobilization of the Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica on Mg2+/Al3+ Layered Double Hydroxide Particles.</a> Acs Appl. Mater., & Interfaces. 2 (10), 2828-2832 (2010).</li>
<li>Poncz, L., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Resistance+to+Tryptic+Hydrolysis+of+Peptide-Bonds+Adjacent+to+N-epsilon%2CN-Dimethyllysyl+Residues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Resistance to Tryptic Hydrolysis of Peptide-Bonds Adjacent to N-epsilon,N-Dimethyllysyl Residues.</a> J. Biol. Chem. 258 (3), 1844-1850 (1983).</li>
</ol>

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Bu izotopik etiketleme yöntemini tam olarak kullanmak için indirgeyici olarak 13C-metillenmiş proteinin NMR sinyallerinin atanması gereklidir. Kısmi 13C-birleşme verilerinin korelasyonu yoluyla NMR sinyallerinin atanmasına yardımcı olmak için MS'nin kullanılması umut verici bir tekniktir. Bu tekniğin diğer atama yöntemlerine göre avantajı, yalnızca birincil amino asit dizisine ihtiyaç duyulmasıdır. N-terminal amino asit bir lizin olduğunda MS destekli atama yöntemi sınırlıdır çünkü α-dimeti...

Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, proteinler1 için değerli bir yapı açıklama aracıdır. NMR spektroskopisi, bir proteinin doğal durumundaki çözelti yapısını belirlemek için kullanılabilir. Kararlı manyetik izotopların düşük doğal bolluğunun üstesinden gelmek için, 13C ve 15N'yi ilgilenilen proteine dahil etmek gerekir. Kullanılan en yaygın yöntem, bir bakteri konakçısı2-3'te rekombinant ekspresyondur. Bununla birlikte, bakteriyel konak aşırı ekspresyonunun iki dezavantajı, translasyon sonrası modifikasyonlar üretememesi ve tüm proteinler3-4 için çalışmamasıdır. Bakteriyel ekspresyonu protein üretimi için uygun bir yol olmadığında, bakteriyel olmayan konakçılarda aşırı ekspresyon kullanılabilir, ancak izotopik etiketleme zor ve pahalıdır5. NMR analizi için 13C ve 15N izotoplarının proteinlere dahil edilmesi için alternatif ekspresyon yöntemleri, metil etiketleme6 ve tek 13C, 15N amino asitler7-9 için metabolik öncüleri kullanan seyrek etiketleme tekniklerini içerir. Burada kullanılan seyrek etiketlemeye kimyasal bir yaklaşım, bir protein üzerindeki birincil amino gruplarının - N-terminal α-amin ve lizin, yan zincir ε-aminler - metillendiği, iyi bilinen indirgeyici 13C-metilasyon reaksiyonudur (Şekil 1). Monometilaminler oluşturulduktan sonra, amin, dimetilaminler oluşturmak için daha yüksek pKa değeri nedeniyle kolayca tekrar metilasyona uğrar.
İndirgeyici metilasyon ilk olarak Means ve Feeney10 ile proteinleri kimyasal olarak modifiye etmek için bir yöntem olarak tanıtıldı. Bu reaksiyonun avantajları, geniş uygulanabilirliği ve tamponlu, fizyolojik pH ve düşük sıcaklıklarda hafif reaksiyon koşullarıdır11,12. Formaldehit ve dimetilamin boran kompleksi (DMAB) gibi bir indirgeyici ajanın varlığında, lizin ε-amino grupları ve N-terminal α-amino grubu, dimetillenmiş aminler üretmek için seçici olarak metillenir. Formaldehitin metilen köprülerinin oluşumu yoluyla proteinleri çapraz bağladığı bilinmesine rağmen, bu işlem indirgeyici ajan13,14 tarafından bloke edilir.
İndirgeyici metilasyon, hem NMR hem de x-ışını kristalografisi ile proteinleri incelemek için başarıyla kullanılmıştır. İndirgeyici metilasyon, aksi takdirde inatçı proteinlerin kristalleşmesini kolaylaştırmak için kullanılır15. Tavuk yumurtası akı lizozim, dimetillenmiş formunda kristalize olan ilk proteindi. Metillenmiş ve metillenmemiş lizozim yapılarındaki ağır atomlar arasındaki kök-ortalama kare farkı 0.40 Å16'dır. Bu karşılaştırma, indirgeyici metilasyondan sonra protein yapısının korunabileceğini ve reaksiyonu yapı aydınlatması için uygun bir etiketleme aracı haline getirdiğini göstermektedir.
İndirgeyici metilasyon reaksiyonunda 13C-etiketli formaldehit kullanılarak, 13C-dimetillenmiş amin üretilir. 13C-dimetilamin, protein dinamiklerini, yapısını ve işlevini incelemek için yaygın olarak kullanılan NMR ile tespit edilebilir problardır. NMR ve indirgeyici 13C-metilasyon, β2 adrenerjik reseptör17, ribonükleaz A18, lizozim19, fd geni 5 protein20 ve sitokrom c21 için protein-ligand ve protein-protein etkileşimlerini incelemek için kullanılmıştır. Benzer şekilde, indirgeyici olarak 13C-metillenmiş ribonükleaz A22, lizozim23, fd geni 5 protein24, Clostridium pasteurianum ferredoksin25, IgG26'nın Fc fragmanı, apolipoprotein A-I27 ve MIP-1α28'in yapısal ve fonksiyonel özellikleri incelenmiştir 13C-dimetilamino grubunun dinamikleri, concanavalin A29-30 ve kalmodulin31 üzerinde incelenmiştir.
İndirgeyici 13C-metilasyonu, NMR ile proteinleri incelemek için yaygın olarak kullanılmış olsa da, etiketleme yöntemi her zaman NMR rezonanslarını26 atamanın zorluklarıyla sınırlı kalmıştır. İndirgeyici olarak 13C-metillenmiş proteinler için çoğu atama stratejisi, az sayıda bölgeye,20,28 bilinen yapısal özellikleredayanmaktadır 11,19,23,26,31,32. veya kapsamlı genetik modifikasyonlar33. Bu çalışmaların hiçbiri, piklerin her bir lizin33'ün bölgeye yönelik mutajenezi ile atandığı kalmodulin çalışması dışında, tüm 13C-dimetilamin zirvesini başarılı bir şekilde atamadı. MIP-1α dimer oluşumu çalışmasında, indirgeyici olarak 13C-metillenmiş aminlerin NMR atamasına yardımcı olmak için kütle spektrometresinin (MS) kullanımı ilk olarak rapor edilmiştir28. Matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon uçuş süresi (MALDI-TOF) MS, dimerin arayüzündeki lizini tanımlamak için kullanıldı. İnsan MIP-1α triptik peptitlerinin kısmen metillenmiş lizinleri MS ile tanımlandı ve 2D 1 H-13C HSQC NMR spektrumları28'de gözlenen bozulmamış proteinin mono- ve dimetilamin sinyallerinin görünümü ile ilişkilendirildi. Grubumuz MS'in kullanımını genişletti ve amino asit dizisi34 dışında proteinin yapısı veya özellikleri hakkında önceden bilgi gerektirmeyen bir atama yöntemi sundu. Bu yöntem çoğu protein için geçerlidir. Bunun bir istisnası, bir proteinin bir N-terminal lizine sahip olmasıdır, çünkü N-terminal lizin α- ve ε-13C-dimetilaminlerin MS izotopik profili bağımsız olarak ölçülemez.
Burada, bir N-terminal lizin kalıntısının N-terminal α-dimetilamin ve yan zincir ε-dimetilamin bölgelerini tanımlamak için biri kimyasal diğeri enzimatik olmak üzere iki yöntem sunuyoruz. İlk yöntem Córdova ve arkadaşlarından esinlenmiştir.protein asetilasyonunun seçiciliğini kontrol etmek için pH kullanan,35. Reaksiyon, düşük pH'ta N-terminal α-amini ve yüksek pH'ta yan zincir ε-aminleri tercih eder ve protein α- ve ε-amino gruplarının çalışmalarında kılcal elektroforez35 ile ayırt edilmesini sağlar. İndirgeyici 13C-metilasyon reaksiyonunu kullanarak protein amino gruplarının etiketlenmesini değiştirmek ve MS destekli atama stratejisinin uygulanmasına izin vermek için yüksek ve düşük pH'ın nasıl kullanıldığını gösteriyoruz. N-terminal α- ve ε-13C-dimetilaminleri atamak için ikinci yöntem, rekombinant Aeromonas proteolytica aminopeptidaz kullanılarak N-terminal kalıntılarının seçici olarak uzaklaştırılmasından yararlanır.

<table><tbody><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 ml santrifüj filtre (3k MWCO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC800308 (8pk)</td><td></td></tr><tr><td>Aminopeptidaz</td><td>Creative Biomart</td><td>Aminopeptidaz-86A</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum sülfat</td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Boran-dimetilamin kompleksi</td><td>Sigma</td><td>180238</td><td>Kullanmadan önce taze 1 M çözelti yapın.</td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Sığır pankreas insülini</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>C18 Spin Sütunları</td><td>Thermo Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Döteryum oksit</td><td>Cambridge İzotop Laboratuvarları</td><td>DLM-4-100</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dikloroetan-13C 2</td><td>Sigma</td><td>714321</td><td>-80 ° C'de depolanan 80 mM stok çözeltisi 24 mM'de NMR spektrumlarında referans olarak kullanılır.</td></tr><tr><td>Formaldehit (ağırlıkça %36,5</td>)<td>Sigma</td><td>33220</td><td>Kullanmadan önce taze 1 M solüsyon hazırlayın.</td></tr><tr><td>13C-formaldehit (%99)</td><td>Cambridge İzotop Laboratuvarları</td><td>CLM-806-1</td><td>Kullanmadan önce taze 1 M solüsyon yapın.</td></tr><tr><td>Lizozim (tavuk yumurtası akı)</td><td>Sigma</td><td>L6376</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat (dibazik heptahidrat)</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat (monobazik)</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Trisin</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>700 MHz Varian VNMRS, 5 mm HCN 5922 problu</td><td>Agilent Teknolojiler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İndirgeyici olarak metillenmiş proteinler Üzerindeki 13c-dimetil n-terminal amin'in nmr rezonanslarını belirleme yöntemleri

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, protein yapısı ve dinamik çalışmalar için kanıtlanmış bir tekniktir. NMR ile proteinleri incelemek için, kararlı manyetik izotoplar tipik olarak duyarlılığı artırmak ve sıralı rezonans atamasına izin vermek için metabolik olarak dahil edilir. İndirgeyici 13C-metilasyon, izotop dahil etmenin en yaygın yöntemi olan bakteriyel konakçı aşırı ekspresyonuna uygun olmayan proteinler için alternatif bir etiketleme yöntemidir. İndirgeyici 13C-metilasyon, bir proteinin birincil amino gruplarını (lizin ε-amino grupları ve N-terminal α-amino grubu) 13C-dimetilamino grubuna değiştiren hafif koşullar altında gerçekleştirilen kimyasal bir reaksiyondur. Çoğu proteinin yapısı ve işlevi, modifikasyon tarafından değiştirilmez, bu da onu metabolik etiketlemeye uygun bir alternatif haline getirir. İndirgeyici 13C-metilasyonu seyrek, izotopik etiketler eklediğinden, NMR sinyallerini atamanın geleneksel yöntemleri geçerli değildir. Protein 13C-dimetilamin NMR sinyallerinin atanmasına yardımcı olmak için kütle spektrometresi (MS) kullanan alternatif bir atama yöntemi geliştirilmiştir. Yöntem, her bir birincil amino grubunda kısmi ve farklı miktarlarda 13C-etiketlemesine dayanır. Yöntemin bir sınırlaması, proteinin N-terminal kalıntısı bir lizin olduğunda ortaya çıkar, çünkü Lys1'in α- ve ε-dimetilamino grupları MS ile ayrı ayrı ölçülemez. Bu sınırlamayı aşmak için, hem N-terminal α-amin hem de yan zincir ε-amin ile ilişkili 13C-dimetilaminin NMR rezonansını tanımlamak için iki yöntem açıklanmaktadır. Tavuk yumurtası akı lizoziminin N-terminal α-dimetilamin ve yan zincir ε-dimetilamin, Lys1'in NMR sinyalleri, 1 H-13C heteronükleer tek kuantum tutarlılık spektrumunda tanımlanır.

Redüktif Metilasyon ve pH
Lizozim üzerinde pH ile tetiklenen kemoselektif redüktif 13C-metilasyon reaksiyonu gösterilmiştir. Düşük pH'da reaksiyon, yan zincir ε-aminlerinden ziyade N-terminal α-amini tercih eder; yüksek pH'da ise durum tam tersidir. Çözeltide proteinin amino grupları, pH ile ayarlanabilen serbest amin ve konjuge asit arasındaki dengede bulunur. Bu reaksiyon için optimum pH aralığı, kullanılan indirgeyici ajana bağlıdır. Bu durumda, dimetilamin boran için optim...

İndirgeyici olarak 13C-metillenmiş N-terminal lizinin α- ve ε-dimetilamin nükleer manyetik rezonans sinyallerini atamak için iki yöntem açıklanmıştır. Bir yöntem, indirgeyici metilasyon reaksiyonunun pH ile indüklenen seçiciliğini kullanır ve diğeri, N-terminal lizini seçici olarak uzaklaştırmak için aminopeptidaz kullanır.

İndirgeyici Olarak Metillenmiş Proteinler Üzerindeki 13C-Dimetil N-terminal Amin'in NMR Rezonanslarını Belirleme Yöntemleri

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

Bu prosedürün genel amacı, alfa ve epsilon karbonunu atamaktır. 13 dimetil amin NMR uç terminal lizinin rezonansı, lizozim kalıntısı. Bu, ilk olarak lizozimin düşük ve yüksek pH'ta, alt geometrik miktarda karbon 13 formaldehit ile indirgeyici olarak metillenmesiyle gerçekleştirilir.İkinci adım, formaldehitin metilasyonu tamamlaması için düşük ve yüksek pH numunelerini aşırı doğal bolluk ile indirgeyici bir şekilde metillemektir. Son adım, indirgeyici olarak metillenmiş numuneleri NMR analizi için D iki O tamponuna tampon olarak değiştirmektir. İkinci yöntemde amaca, bir lizozim örneğinin amino peptidaz bozunması ile ulaşılır.İkinci adım, kesilmiş protein numunesinin fazla karbon 13 formaldehit ile indirgeyici bir şekilde metillenmesi ve ardından NMR analizi için tampon değişiminin yapılmasıdır. Sonuç olarak, NMR spektroskopisi, atamalar yapmak için karbon 13 metil rezonansının olmadığını göstermek için kullanılır. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bir proteinin iç lizininin hem alfa hem de SSON dimetil lamine ve ML rezonanslarının açık bir şekilde atanmasına izin vermesidir F-L-S-L-PH ve HPH ile üç mililitrelik mikro santrifüj tüpünü etiketleyin, pH'ın altısında önceden hazırlanmış tampon çözeltisinde üç lizozim örneğini çözün, 7.5 ve 10, mililitre başına beş miligramlık bir nihai konsantrasyon vermek için.Işığa maruz kalma nedeniyle bozulmalarını önlemek için tüpleri alüminyum folyo ile örtün. Bunu takiben, FLS tüpüne önceden hazırlanmış bir molar dimetil amin delme kompleksi çözeltisinden 6.1 mikrolitre ve LPH ve HPH tüplerine aynı çözeltiden 3.2 mikrolitre ekleyin. Karışımları nazikçe girdapladıktan sonra, FLS numunesine önceden hazırlanmış bir molar karbon 13 formaldehit çözeltisinden 12.3 mikrolitre ve L-P-H-N-H-P-H numunelerine 6.1 mikrolitre aynı çözelti ekleyin.Reaksiyon karışımlarını iki saat boyunca dört santigrat derecede çalkalayın. İlgili tüplere aynı DMAB ve karbon 13 formaldehit alikotlarını ekleyerek önceki adımları tekrarlayın. Reaksiyon karışımlarını, çalkaladıktan sonra toplam 18 ila 24 saatlik bir reaksiyon süresi boyunca gece boyunca dört santigrat derecede çalkalayın, fazla reaktifleri ve yan ürünleri çıkarmak için her numunenin tamponunu pH 7.5'te üç mililitre fosfat tamponu ile değiştirin, üç kilodalton moleküler ağırlıkta bir santrifüj filtre kullanarak, numuneleri dört santigrat derecede 35 derece sabit açılı rotorlu bir santrifüj kullanarak 500 mikrolitreye konsantre edin ve 7, 500 RCF.Bunu takiben önceki adımları iki kez tekrarlayın. Kısmen etiketlenmiş numune tüplerini alüminyum folyo ile örtün ve üzerlerine 6.1 mikrolitre taze hazırlanmış bir molar DMAB solüsyonu ekleyin. Numuneler girdaplandıktan sonra, tüplere 12.3 mikrolitre taze hazırlanmış bir molar doğal bolluk formaldehit çözeltisi ekleyin.Reaksiyon karışımlarını iki saat boyunca dört santigrat derecede çalkalayın. Önceki adımda olduğu gibi aynı DMAB ve doğal bolluk formaldehit alikotlarını ekleyin ve reaksiyon karışımlarını, 50 milimolar sodyum fosfat tamponu ile tampon değişimini takiben toplam 18 ila 24 saatlik bir reaksiyon süresi için gece boyunca dört santigrat derecede çalkalayın. Her numunenin 10 mikrolitrelik alikotunu temiz mikro santrifüj tüplerine aktarın ve numuneleri MALDI MS analizi için eksi 20 santigrat derecede saklayın.Daha sonra, dört adet 15 mililitrelik konik tüpe önceden hazırlanmış iki molar sodyum borat tampon çözeltisinden 375 mikrolitre ekleyin. Tüplerin üst kısımlarını para filme alın ve para filmi boyunca delikler açın. Tüpleri liyofilize bir şişeye yerleştirin ve numuneyi dondurun.Numuneler dondurulduktan sonra, numuneyi liyofilizatör pipetinden çıkardıktan sonra kuruması için bir liyofilizatör üzerine bir şişe yerleştirin, her tüpe 15 mililitre D iki O pipetleyin ve bu etiketi takiben, F-L-S-L-P-H ve HPH ile santrifüj filtreler içeren üç adet dört mililitrelik konik tüpü karıştırın. İlgili filtre tüplerine her numuneden yaklaşık 500 mikrolitre ekleyin. Sonra üç mililitre 50 milimolar sodyum at tamponu ekleyin.Her tüpe pH 8.5 ekleyin. Dört santigrat derece ve 7.500 RCF'de 35 derece sabit açılı rotorlu bir santrifüj kullanarak numuneleri 500 mikrolitreye konsantre edin. Her filtrenin altındaki tuzağı boşalttıktan sonra, numunelere üç mililitre daha tampon ekleyin ve bunları 500 mikrolitreye konsantre edin.Bissy asit protein tahlilini kullanarak önceki adımları dört kez tekrarlayın. Her numunenin konsantrasyonunu belirleyin. Lizozim örneklerini 50 milimolar sodyum boşluk tamponu ile seyreltin ve 150 mikromolar nihai konsantrasyon elde edin.Daha sonra, her numunenin 530 mikrolitresini beş milimetrelik bir NMR tüpüne aktarın. Daha sonra, D iki O'da bir iki DI CHLORO etan etiketli 80 milimolar karbon 13 stok çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi D iki O ile 24 milimolara seyreltin ve ardından NMR referansı olarak kullanmak için bir koaksiyel yerleştirme tüpüne aktarın. A 1D proton karbonu çalıştırdıktan sonra, H-S-Q-C-N-M-R her rezonans için tepe alanlarını entegre edin.Ultra saf suda mililitre lizozim çözeltisi başına beş miligram hazırlayın. 250 mikrolitre lizozim solüsyonunu temiz bir mililitre santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra pH sekizde 25 mikrolitre 0.1 molar trik çözeltisi ve mililitre başına iki nokta 16 mikrogramda altı mikrolitre ekleyin.Santrifüj tüpüne bir romanis proteolitik amino peptidaz çözeltisi. Karışımı altı saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 37 santigrat derecede 20 saat daha inkübe etmek için bir ila 50 molar amino peptidaz oranı vermek için numuneye altı mikrolitre amino peptidaz çözeltisi ekleyin.Bunu takiben, bir C 18 döndürme sütunu kullanarak numunenin 30 mikrolitresini TUZDAN ARINDIRIN ve numuneyi %0,1 TFA başına %80 ACEDONITE denemesinde elüte edin, numuneyi eksi 20 santigrat derecede saklayın. Maldi MS analizi için, daha önce tarif edildiği gibi NMR için kalan protein örneğini hazırlayın, Düşük pH'ta lizozim üzerinde pH kaynaklı bir kemo seçici indirgeyici karbon 13 metilasyon reaksiyonu gösterilmiştir. Reaksiyon, uç terminal alfa amini yan zincir epsilon amin yerine tercih eder ve burada NMR spektrumlarında gösterildiği gibi yüksek pH'da bunun tersi de geçerlidir.pH 10'da reaksiyona giren lizozim numunesi için tepe yedi yoktur, bu da bir ila altı arasındaki tepe noktalarının epsilon dimetil amino gruplarına ait olduğunu ve tepe yedi'nin son terminal alfa dimetil amino grubu olduğunu gösterir. Alfa Amin, indirgeyici karbonu tercih etti. Kullanılan karbon 13 formaldehit miktarı iki ila yedi molar orana düşürüldüğünde pH altıda 13 metilasyon gözlendi ve numune, burada gösterildiği gibi doğal bolluk formaldehit ile daha fazla reaksiyona girmedi, düşük pH'daki metilasyon, monometil aminler ve dimetil aminlerin bir karışımıdır.Üç amino grubu karbon 13 dim metilasyonu gösterir, bu da bu grupların karbon gösteren gruplardan daha hızlı reaksiyona girdiğini gösterir. Üç karbonun 13 monometili 13 dimetil amin. Zirve yedi en yüksek yoğunluğa sahiptir ve tepe yedi'nin atamasını doğrulayan N termina alfa dimetil amin grubu olarak atanmıştır.Numunenin kullanılması, N terminal alfa amino grubunun indirgeyici metilasyon hızını değiştirme yeteneği ile yüksek pH'da reaksiyona sokuldu. NMR sakinini atamak için MS destekli yöntem uygulanabilir. pH 10'da indirgeyici olarak karbon 13 metillenmiş lizozim numunesi, tripsin ile sindirildi ve alfa amino grubu indirgeyici olarak karbon 13 metillenmediği için maldi TOF MS ile analiz edildi.Bu koşullar altında, tetra metillenmiş N terminal peptidinin MS izotopik profili, N terminal epsilon dimetil amino grubuna dahil edilen karbon 13 yüzdesini ölçmek için kullanılabilir. DIM metillenmiş N terminal peptidi 6 6 2 etiketli karbon 13, ölçeklendirilmiş bir karbon yüzdesi verdi. 13 %27'nin dahil edilmesiAynı lizozim numunesinin NMR analizi, pik altı için %33'lük bir karbon 13 dahil etme yüzdesi verdi, bu da pik altı'nın son terminal lizin epsilon karbon 13 dimetilamin Maldi olduğunu gösterir, tedavi edilmemiş TOF kütle spektrumları ve amino peptidaz ile muamele edilmiş lizozim numuneleri burada resmedilmiştir.Pozitif bir kontrol olarak kullanılan insülin, doğal formu olan 5731.2'ye kıyasla daha düşük ortalama ana yük oranına geçiş göstermektedir. Tedavi edilen lizozim, lizozim, lizin, valin ve fenilalaninin ilk üç uç terminal kalıntısının kaybına karşılık gelen 14305.8'den 13930.5'e bir kayma gösterir. Burada gösterilenler, kontrollü spektruma kıyasla indirgeyici olarak muamele edilmiş karbon 13 metillenmiş lizozim numunelerinin işlenmemiş ve amino peptidaz ile muamele edilmiş numunenin NMR spektrumlarıdır, amino peptidaz ile muamele edilmiş numunenin spektrumu, altı ve yedi tepe noktaları için yoğunlukta bir azalma gösterir ve yedi A etiketli ek bir tepe Bu verilerden altı ve yedi tepe noktaları lizin olarak çift olarak atanabilir, alfa ve epsilon dimetil amin.Bu prosedürü denemeden önce, proteininizin çözünürlüğünü, çeşitli ph'leri göz önünde bulundurmanız ve protokolü buna göre ayarlamanız önemlidir.

methods-to-identify-nmr-resonances-13c-dimethyl-n-terminal-amine-on

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

İndirgenmiş Metillenmiş Proteinlerde 13C-Dimetil N-terminal Aminin NMR Rezonanslarını Belirleme Yöntemleri

Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi tabanlı nicel Proteomikte için hızlı, ucuz bir stratejidir. Burada, hemen hemen her tür örnek uygulanabilir Redi yaklaşım kullanılarak protein karışımlarının hazırlanması ve analizi için güçlü bir yöntem ortaya koymaktadır.

Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

Memeli beyninin nörokimyası birçok nörolojik ve sistemik hastalıkta değişmiştir. Serebral metabolitlerin karakteristik profilleri, beyin dokusunun ham ekstraktlarına dayalı olarak verimli bir şekilde elde edilebilir. Bu amaçla, metabolit konsantrasyonlarının (metabolomikler) ayrıntılı kantitatif analizini sağlayan yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanılır.

Doku Esansı Yüksek Çözünürlük Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Sıçan Beyin metabolomic Analizi

Burada, Tau proteinini bir vaka çalışması olarak kullanarak, Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR) ile içsel olarak düzensiz bir proteinin çoklu fosforilasyonlarını tanımlamak için bir yöntem açıklıyoruz. Rekombinant Tau, veri toplama ve analizinden önce bir kinaz ile in vitro olarak izotopik olarak zenginleştirilir ve modifiye edilir.

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Supramolecular protein derlemeler atomik çözünürlükte yüksek alaka nedeniyle çok önemli rolleri biyolojik olayları çeşitli yapılardır. Burada, biz bir protokol tarafından magic-açı katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (MAS SSNMR) iplik çözünmez ve kristal makromoleküllerin protein derlemeler üzerinde yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar gerçekleştirmek için mevcut.

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, çoklu biyolojik yolları düzenleyen geniş çaplı bir translasyonel sonrası modifikasyondur. Kütle spektrometresi, modifiye peptid zenginleştirme için biyokimyasal yaklaşımlarla birleştirildiğinde, R-metil-proteomun küresel profilini çıkarmak için en iyi teknolojidir. İnsan hücrelerinde küresel R-metilasyonun yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanan iş akışı burada açıklanmaktadır.

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Bu makalede, ölüm sonrası bozulmayı önleyen endojen peptitleri korumak için ısı inaktivasyonuna dayanan bir örnek hazırlama yöntemi ve ardından izotopik etiketleme artı LC-MS kullanarak göreli nicelik açıklanmaktadır.

Peptidomik Çalışmalar için Aminlerin Indirgeyici Metilasyonunu Kullanarak Numune Hazırlama ve Göreli Nicellik

Doğası gereği düzensiz proteinlerde zayıf ve geçici moleküller arası ve moleküller arası etkileşimleri tespit etmek için paramanyetik gevşeme geliştirme NMR spektroskopisinin uygulanması için bir protokol sunulmaktadır.

İçsel Olarak Düzensiz Proteinlerin Kendi Kendine İlişkilerini Tespit Etmek ve Karakterize Etmek için Paramanyetik Gevşeme Geliştirmesi

Bu protokol, serbest ve proteine bağlı arginin ve metil-argininlerin 1H-NMR spektroskopisi ile hazırlanmasını ve kantitatif ölçümünü açıklamaktadır.

Arginin Metilomunun Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Araştırılması

Burada, çözeltideki protein-glikan etkileşimlerini karakterize etmeyi amaçlayan bir dizi NMR deneyinin elde edilmesini, işlenmesini ve analizini detaylandıran bir protokol sunuyoruz. En yaygın ligand bazlı ve protein bazlı metodolojiler ana hatlarıyla belirtilmiştir ve bu da şüphesiz yapısal glikobiyoloji ve moleküler tanıma çalışmaları alanlarına katkıda bulunmaktadır.

Glikan-Protein Etkileşimlerinin Çözülmesi: Kurtarmaya Nükleer Manyetik Rezonans (NMR)

Cu (I) içeren bir metalokoperon model peptidin NMR çözelti yapısı belirlendi ve numune hazırlama ve 1D ve 2D veri toplamadan üç boyutlu bir yapıya kadar ayrıntılı bir protokol açıklandı.

Peptit-Metal Komplekslerinin Yapı ve Koordinasyon Tayini 1D ve 2D 1H NMR Kullanılarak

Keşfedin, NMR rezonans ataması için lizozim üzerinde indirgeyici metilasyon ve amino peptidaz yöntemlerini. pH seçiciliği ve enzimatik parçalanma ile protein modifikasyonlarını analiz edin.

İndirgeyici Olarak Metillenmiş Proteinler Üzerindeki ¹³C-Dimetil N-terminal Amin'in NMR Rezonanslarını Belirleme Yöntemleri

Daha fazla video keşfet