Arabidopsis Kök Gravitropic Müdahale Yüksek çözünürlüklü Zaman lapsed Resim Toplama Masaüstü Tarayıcılar kullanma
25 Ocak 2014
Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen düz yataklı tarayıcı kullanılarak bir yerçekimi uyarana yanıt Arabidopsis fide görüntülerin hızla toplanması için bir işlemi tarif etmektedir. Yöntem aşağı analiz algoritmaları için mükellef yüksek çözünürlüklü görüntüleri, ucuz, yüksek hacimli yakalamak için izin verir.
Bu videonun genel amacı, model bitki operasyonunda kök tropik tepkisinin yüksek çözünürlüklü görüntü yakalaması için tarayıcı tabanlı bir yöntemi göstermektir. Bu protokole başlamak için, belirlenen tohum stoğundan elde edilen tohumlar, şeffaf bir ortam içeren Petri kaplarına ekilir Tohumlar belirlenen süre boyunca çimlendikten sonra, Petri kapları büyüme odasından çıkarılır, tarama için hazırlanır, daha sonra dikey olarak yönlendirilmiş düz yataklı tarayıcılara yerleştirilir. Plakalar daha sonra 90 derece döndürülür ve belirlenen bir süre boyunca taranır.
Görüntüler bilgisayara veya bir veri depolama aygıtına kaydedilir ve daha sonra görüntü işleme için kullanılır. Görüntü elde etmeden önce, iki B taranmış bitki dokusunu içeren ağa plakalarını hazırlayın. İlk olarak, AGA Plakasının kapağında ve yanlarında biriken yoğuşmayı bir silme mendiliyle emdirin.
Ardından, gelecekteki yoğuşmayı önlemek için bol miktarda Triton X 100 uygulayın. Son olarak, kapağı sabitlemek ve havalandırmanın görüntü almaya başlamasına izin vermek için plakayı mikro gözenekli bantla sararak bu işlemi tamamlayın. Görüntüleri istediğiniz konuma kaydetmek için klasörler ayarlayın.
Her klasör adı, taranacak bilgilerle ilgili bir meta veri derlemesinden oluşur. Bu örnekte, benzersiz kimlik yaşı, boyutu ve tohum stoğu, klasör adlarına dahil edilen verilerdi. Bu meta veriler daha sonra kopyalanabilir ve bir klasör adına yapıştırılabilir.
Bu Protokol, görüntüleri toplamak için birden fazla tarayıcının kullanıldığını varsayar ve birden fazla tarayıcıyı tek bir bilgisayara bağlamak için talimatlar sağlar. Bu nedenle, görüntüleri kaydetmek için üç klasör ayarlanmıştır. Bir sonraki adım, zamanlayıcıları belirlenmiş bir toplama süresi için ayarlamaktır.
Bu noktada hala yapılması gereken biraz hazırlık olduğundan, zamanlayıcıları biraz daha fazla süre için ayarladığınızdan emin olun. Ardından, ilk tarayıcıyı açın ve tarama programını görüntüleyin. Giriş sekmesi altında, kaynağı doğru tarayıcıya ayarlayın ve kırpma sekmesi altındaki otomatik tekrarlama açılır kutusunu yok olarak ayarlayın.
Önizleme alanını Maksimum olarak ayarlayın ve önizlemeye basın. İlgilenilen bölgeyi yakalayacak bir kırpma kutusu seçin ve önizleme alanını kırpma kutusu olarak ayarlayın. Ardından görüntüyü tekrar önizleyin.
Toplanan verileri istenen konuma kaydetmek için çıktı sekmesine basın ve her tarayıcıya karşılık gelen önceden yapılmış klasör adlarını bulun. Sonraki tarayıcıyı açın ve görünüm taramasını tekrarlayın. Verilerin kaydedileceği doğru klasörleri seçtiğinizden emin olarak diğer iki tarayıcı için yönergeleri ayarlayın.
Her sekmeyi gözden geçirmek ve tüm tarayıcı ayarlarının istendiği gibi olduğundan emin olmak da önemlidir. Laboratuvarımız, yapılmakta olan görüntü toplama türü için aşağıdaki ayarların en iyi sonucu verdiğini bulmuştur. Ancak, farklı görüntü toplama türleri için başka Ayarlar gerekebilir.
Tüm ayarlar Kontrol edildikten sonra, giriş sekmesini seçin ve otomatik tekrarlama açılır kutusunu üç Tarayıcıda da sürekli olarak ayarlayın. Hazırlanan Plakaları, fideler yatay olarak yönlendirilecek şekilde tarayıcılara yerleştirin ve tarayıcıda stabiliteyi sağlamak için arka planın keçe tarafını geçici olarak plakalara yerleştirin. Bu protokolü bir partnerle gerçekleştiriyorsanız, bir kişinin plakaları 90 derece çevirmesini ve hemen keçe gören arka planı çevirmesini sağlayın, diğer kişi daha sonra tarama düğmesine basar ve her ikisi de arka planı bir bungee kordonu ile tarayıcıya sabitler.
Bu işlemi ikinci ve üçüncü tarayıcılar için tekrarlar. Her görüntünün tamamen taranması yaklaşık iki ila üç dakika sürmelidir Son görüntüler gösterildiği gibi görünecektir. Tümünün düzgün bir şekilde kaydedildiğinden emin olmak için görüntülerin kaydedildiği klasörleri kontrol etmek iyi bir fikirdir.
Tarayıcıları, belirlenen zaman taraması için rahatsız edici olmayacak bir alanda tutmak idealdir. İdeal fenotipik tepkileri sağlamak için tarama alanındaki çevresel koşulları da göz önünde bulundurmak ihtiyatlıdır. Aşağıdaki resimler, bu videoda açıklanan yöntem kullanılarak toplananlara örnektir.
A ve B ile C ve D panelleri, tek bir tarama periyodundan elde edilen ilk ve son görüntülerdir. A ve B taranan alanın tamamını gösterir. C ve D, taranan alanın tek bir plakayı gösteren kırpılmış bir bölgesi olsa da, çeşitli tutarsızlıklar gözlemlenebilir.
Şekil A, çimlenme ve büyüme yörüngesindeki değişimi göstermektedir. Görüntü B, plakaların yoğuşma biriktirebileceğini gösterirken, C ve D görüntüleri, fidelerin sağlam büyümesi ve çalışma boyunca görüntü kalitesi nedeniyle iyi sonuçlar olarak kabul edilir. Bu yazıda özetlenen prosedür, nispeten uygun fiyatlı olmasının yanı sıra yüksek verim ve yüksek çözünürlüklü olması nedeniyle kök görüntüleme dünyasındaki kendi nişine uymaktadır.
Bu yaklaşımın ek bir yararı, belirli bir araştırma grubunun görüntüleme ihtiyaçlarını karşılamak için kolayca özelleştirilebilmesidir. Yöntem ayrıca diğerlerinin görüntülenmesi için de özelleştirilmektedir.
Genel Bakış
Bu protokol, düz yataklı tarayıcılar kullanarak Arabidopsis fidelerinin yerçekimine verdiği tepkinin yüksek çözünürlüklü görüntülerinin yakalanması için bir yöntem sunmaktadır. Bu yaklaşım maliyet etkin olup, ileri analizlere uygun yüksek hacimli görüntü toplamaya olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Bitki biyolojisi
- Görüntü analizi
- Kök tropik yanıtı
Arka Plan
- Arabidopsis, bitki araştırmalarında model organizma olarak kullanılır.
- Köklerin yerçekimine verdiği yanıtların anlaşılması, bitki gelişim çalışmaları için kritik öneme sahiptir.
- Yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri, fenotipik analiz için veri toplama sürecini iyileştirir.
- Yataklı tarayıcılar, yüksek kapasiteli görüntüleme için uygun maliyetli bir çözüm sunar.
Çalışmanın Amacı
- Kök tropik yanıtlarını yakalamak için tarayıcı tabanlı bir yöntemi göstermek.
- Sonraki analizler için görüntü toplama sürecini kolaylaştırmak.
- Araştırma grupları için özelleştirilebilir bir görüntüleme protokolü sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Tohumlar, Petri kaplarındaki şeffaf besiyerlerinde çimlendirilir.
- Plakalar, dikey konumlandırılmış düz yataklı tarayıcılar kullanılarak taranır.
- Verimliliği artırmak için tek bir bilgisayara birden fazla tarayıcı bağlanabilir.
- Görüntüleme ayarları, optimal sonuçlar elde etmek için düzenlenir.
Ana Sonuçlar
- Çekilen görüntüler, çimlenme ve büyüme seyirlerindeki varyasyonları göstermektedir.
- Plakalardaki yoğuşma sorunlarının görüntü kalitesini etkilediği kaydedilmiştir.
- Güçlü fide büyümesini kanıtlayan yüksek kaliteli görüntüler elde edilmiştir.
- Yöntem, yüksek kapasiteli ve özelleştirilebilir görüntülemeye olanak tanır.
Sonuçlar
- Protokol, kök tepkilerinin görüntülenmesi için etkili bir yöntem sunmaktadır.
- Araştırma ortamlarındaki çeşitli görüntüleme ihtiyaçlarına uyarlanabilir.
- Bu yaklaşım, veri toplama sürecinde maliyet ve verimlilik arasında bir denge kurar.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Köklerin gravitropik yanıtının yüksek çözünürlüklü fenotipik görüntülemesi, bitki temelli terapötik keşifler için erken evre hedef doğrulamasında mekanistik risklerin azaltılmasını sağlar. Bu düşük maliyetli, yüksek kapasiteli görüntüleme yaklaşımı, sonraki görüntü analiz hatlarına uygun kantitatif, zaman ayarlı veriler üreterek gen fonksiyonu çalışmalarındaki öngörü güvenilirliğini destekler. Yöntem, translasyonel süreklilik için veri bütünlüğünü korurken, keşif biyolojisindeki ölçeklenebilirlik zorluklarını giderir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Gen fonksiyonunun fenotipik bir çıktısı olarak kök büyüme yörüngelerinin kantitatif ölçümü aracılığıyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Gün başına 4.800 dpi çözünürlükte 216 bireysel yanıtın yüksek verimli yakalanması yoluyla biyolojik risklerin azaltılmasını sağlar.
- Öngörücü Değer: Büyüme yörüngesi varyasyonlarını netleştiren görüntü analizi uygulamaları için yeterli miktarda kaliteli görüntü verisi üreterek portföy seçimine destek olur.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Standartlaştırılmış, tekrarlanabilir bileşik veya genetik tarama iş akışları için valide edilmiş biyolojik sistemler (şeffaf ortamda Arabidopsis fideleri) hazırlar.
- Operasyonel Değer: Uygun maliyetli flatbed tarayıcılar kullanarak her birkaç dakikada bir otomatik zaman ayarlı görüntü alımı ile analiz hazırlığına çözüm sunar.
- Ölçeklenebilirlik Değeri: Özelleştirilebilir protokol tasarımı ve tek bir bilgisayara çoklu tarayıcı bağlantısı sayesinde platformun yeniden kullanımına ve farklı gruplara uyarlanmasına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Değer: Model organizmalarda korunan bir mekanizma olan kök tropik yanıtının fenotipik kantifikasyonundan keşif aşamasına kadar hastalıkla ilgili sistem sürekliliğini sağlar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Bağımsız değişkeni (yerçekimi vektörü yer değiştirmesi) izole ederek ve bağımlı değişkeni (düzeltici büyüme) yüksek zamansal çözünürlükle ölçerek hedef doğrulamadaki belirsizliği azaltır.
- Öngörü Güveni: Çimlenme ve büyüme yörüngesi varyasyonlarının istatistiksel analizine olanak tanıyan kantitatif çıktılar sağlayarak risk ayarlı ilerleme kararlarını destekler.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken evre hedef doğrulama süreçlerindeki devam/dur kararlarına temel oluşturan standartlaştırılmış, kantitatif fenotipik veriler sunarak, hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Yerçekimi vektörü hizasından kaydırılan fide köklerindeki düzeltici büyümenin gözlemlenmesini sağlayarak hipotez testlerini ve yolak netleştirmelerini destekler.
- Tarama: Kontrollü plaka hazırlama (Triton X-100 ve mikropor bant ile yoğunlaşmanın önlenmesi) ve tutarlı görüntü kaydetme protokolleri aracılığıyla analiz standardizasyonu ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Analitik: Büyüme yörüngelerinin ve çimlenme tutarlılığının kantitatif ölçümleri için uygun, 4.800 dpi çözünürlükte zaman ayarlı görüntü veri setleri oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Genetik ve farmakolojik pertürbasyona açık bir model sistemde hastalıkla ilgili fenotipik çıktılar sağlayarak preklinik süreklilikle bağ kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Düşük maliyeti, yüksek verimliliği ve araştırma grupları genelinde özelleştirme kolaylığı sayesinde tek kullanımlık bir teknikten ziyade yeniden kullanılabilir bir görüntüleme kapasitesi olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Gravitropik yanıt fenotiplemesindeki mekanistik belirsizliğin azaltılması yoluyla hedef doğrulama süreçlerinde öngörüsel güvenin artırılması.
- Operasyonel Değer: Otomatik tarama protokolleri ve veri organizasyonu için meta veri odaklı klasör adlandırma yöntemleri aracılığıyla sağlanan standardizasyon, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik.
- Stratejik Değer: Yüksek hacimli ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanılarak erken aşama fenotipik risk azaltımı yoluyla daha iyi devam/durdurma kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç aşama biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Görüntü analizi uygulamalarını destekleyen geniş kapsamlı ve kaliteli görüntü verileri sayesinde mümkün kılınan risk ayarlı önceliklendirme ve ilerleme kararları.
Uygulama Hususları
- Bitki biyolojisi ve Arabidopsis kök görüntüleme için görüntü elde etme protokollerinde bilimsel uzmanlık gereklidir.
- Enstrümantasyon ihtiyaçları arasında 4.800 dpi çözünürlüğe sahip dikey yönlendirilmiş düz yataklı tarayıcılar ve çoklu tarayıcı çalışması için tek bir bilgisayara bağlantı yer almaktadır.
- Ekipler arası standardizasyon, tutarlı plaka hazırlığı (Triton X-100 ve mikropor bant yoluyla yoğuşma kontrolü) ve tekrarlanabilir veri kaydı için meta veri tabanlı klasör adlandırması gerektirir.
- Model sistemler arası adaptasyon hususları, farklı fide boyutları ve büyüme koşulları için tarayıcı yönlendirmesinin ve plaka hazırlığının ayarlanmasını içerir.
- Pratik sınırlamalar arasında plakalardaki yoğuşmanın yönetilmesi ve gravitropik yanıt indüksiyonu için 90 derecelik rotasyon sırasında stabil fide yöneliminin sağlanması yer alır.
