Çoklu doymamış yağ asitlerinin Diyet takviyesi Caenorhabditis elegans

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yağ asidi fonksiyonunu ve regülasyonunu incelemek için deniz zarafetinin yağ asidi bileşimini değiştirmek için diyet araçlarını kullanmaktır. Bu, nematod besin kaynağının doymamış yağ asitlerinin varlığında kültürlenmesiyle elde edilir. Daha sonraki deniz zarafeti, yağ asidinin alımına ve solucana dahil edilmesine izin veren takviye edilmiş bakterilerle beslenir.

Lipitler daha sonra deniz zarafetinde değişir. Yağ asidi bileşimi, gaz kromatografisi kütle spektrometresi analizi ile doğrulanır. Son olarak, doymamış yağ asitleri ile beslendikten sonra, solucanlar sterilite için puanlanır.

Değişen yağ asidi bileşiminin gelişim davranışı ve gen ekspresyonundaki değişiklikler yoluyla fizyolojik etkilerini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, deniz zarafeti gelişimi ve fizyolojisi alanlarındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, çünkü yağ asidi bileşimini değiştirmek ve sonuçları izlemek için hem genetik manipülasyonu hem de diyet katkılarını kullanabiliriz. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler dikkatli ve temkinli olmalıdır çünkü doymamış yağ asitlerinin oksijene ve yüksek sıcaklıklara duyarlılığı nedeniyle tutarlı sonuçlar elde etmek zordur.

Bir litre yağ asidi takviyeli ortam hazırlamak için, aşağıdaki bileşenleri bir şişeye ölçün. 800 mililitreye kadar milipor suyu ekleyin ve ortam 55 santigrat derecede soğurken test edilecek her yağ asidi konsantrasyonu için boş bir cam şişe ve uygun dereceli silindirlerle birlikte ortamı otoklavlayın. Yağ asidi sodyum tuzunun çalışma stoğu çözeltisini, cam parçacıklarını tozun içine sokmayacak şekilde cam şişeyi dikkatlice kırarak ve 100 milimolar bir stok çözeltisi yapacak kadar tartarak hazırlayın, gerekli miktarda arıtılmış su ekleyin.

Daha sonra, argon veya nitrojen gazı kullanarak, yağ asidi oksidasyonunu önlemek için çözeltiyi temizleyin. Daha sonra şişeyi kapatın ve yağ asidi, sodyum tuzu çözülürken şişeyi karanlıkta saklayın. Tarım aşağıdaki anda 55 santigrat dereceye kadar soğuduğunda, daha sonra bir alevin yakınında, çözeltiyi steril dereceli bir silindire aktarın.

Bir litreye kadar steril su eklemeden önce, ortamı tekrar şişeye aktarın ve karıştırmaya devam edin. Test edilecek her yağ asidi konsantrasyonu için bir dizi ortamı otoklavlanmış bir şişeye aktarmak için steril dereceli bir silindir kullanın. Daha sonra şişeleri bir karıştırma tabağında sıcak tutun.

Plakalar katılaştıktan sonra plakaları dökmek için steril bir 25 mililitrelik pipet kullanmadan önce uygun konsantrasyonda yağ asidi stok çözeltisini karıştırın, örtün ve karanlıkta iyi incelenmiş bir alanda oda sıcaklığında saklayın. İki gün sonra, plakaları tohumlamak için e coli OP 50 kullanın, ardından bakteri çimi kururken plakaları oda sıcaklığında karanlık bir ortamda inkübe edin. Ravi Hermafroditlerini alkali hipoklorit çözeltisi ile muamele ederek senkronize bir L bir larva popülasyonu hazırlayın.

GR hermafroditlerini yetişkin solucanlar çözülene kadar bu çözeltide hafifçe sallayın. Daha sonra yumurtaları peletlemek için düşük hızda santrifüjleyin. Yumurtaları üç kez yıkamak için M dokuz tampon kullanın.

Daha sonra 15 mililitrelik bir tüpte, beş mililitre M dokuz tamponunda yeniden süspanse edin ve gece boyunca sallayın. L one larvalarını, 0.3 milimolar di homo gammalin asit veya DGLA ile takviye edilmiş OP 50 tohumlu plakalara ekleyin ve üç gün boyunca veya larvalar yetişkin aşamasına ulaşana kadar 20 santigrat derecede inkübe edin. Yetişkin solucanları sterilite açısından puanlamak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın.

Başarılı mikrop kaybı, yumurtadan yoksun berrak bir rahim olarak ortaya çıkacaktır. Alternatif olarak, solucanları bir saat camındaki bir damla M dokuz tamponuna toplayarak puanlayın. Ardından, saat camını doldurmak için mililitre başına 0,2 nanogram bir mililitre dappy solüsyonu kullanın ve yaklaşık beş dakika inkübe edin.

Kuluçkadan sonra, solucanları bir kapak fişi ile kaplamadan önce bir slayt üzerinde bir damla montaj ortamına toplayın, kapak fişini kapatın ve gece boyunca karanlıkta dört santigrat derecede saklayın veya yağ asidi metil esterleri veya fame'ler üretmek için hemen bir floresan mikroskop altında görüntüleyin. Yağ asidi alımını ölçmek için, 500 ila 1000 yetişkin solucanı plakalardan yıkamak ve silikonize etmek için su kullanarak toplayın. 13 x 100 milimetre cam vidalı üst tüpler.

Solucanların yerçekimi ile yerleşmesine izin verin ve ardından mümkün olduğunca fazla suyu çıkarmak için bir cam pipet kullanın. Metanol içine bir mililitre% 2.5 sülfürik asit ekleyin ve tüpleri kaputun altında bir dakika soğuduktan sonra bir saat boyunca 70 derecede bir su banyosunda ısıtın, 1.5 mililitre su ve 0.25 mililitre hekzan ekleyerek çerçeveleri çıkarın. Tüpleri tekrar kapatın ve kuvvetlice çalkalayın.

Daha sonra, heksan'ı sulu çözücüden ayırmak için tüpleri bir masa üstü klinik santrifüjde bir dakika santrifüjleyin. Üst heksan katmanını bir GC şişesi içindeki bir gaz kromatografisine veya GC şişesi ekine aktarın. Gc ile analiz etmek için, fame analizine uygun bir polar kılcal gaz kromatografi kolonuna bir ila iki mikrolitre fame enjekte edin.

Enjektörü dakikada 1,4 mililitre akış hızıyla 250 santigrat dereceye ayarlayın. Fırını bir dakika boyunca tutulan 130 santigrat derecelik bir başlangıç sıcaklığına programlayın. Daha sonra sıcaklığı 190 santigrat dereceye ulaşana kadar dakikada 10 santigrat derece artırın ve ardından dakikada beş santigrat derecede 210 santigrat dereceye kadar tekrar rampalayın ve ardından DGLA alımının gerçekleştiğinden emin olmak için bir dakika daha tutun.

Deniz zarafetinin tanımlanması için otantik standartları kullanarak alev iyonizasyon tespiti veya kütle spektrometresi veya MS tespiti ile çerçeveleri analiz edin. Deniz zarifliği diyetinin yağ asitleri takviyesi, e coli OP 50'nin çeşitli yağ asitlerini zarlarına asimile etme yeteneğini belirlemek için bakteriyel besin kaynağının yağ asitlerini bakteri zarına alma ve dahil etme yeteneği ile sınırlıdır. OP 50, bu şekilde görüldüğü gibi 0.1 milimolar ve 0.3 milimolar sterik asit, sodyum at ve sodyum DGLA konsantrasyonları olmadan takviye edilmeden ortama kaplandı GCMS tarafından yapılan fame analizi, OLEATE ve DGLA dahil olmak üzere doymamış yağ asitlerinin, doymuş yağ asidi sterik asitten daha yüksek seviyelerde OP 50'ye dahil olduğunu göstermektedir.

Ek olarak, yetişkin evre solucanlarında yağ asitleri miktarlarının ölçülmesi, doymuş yağ asitleri ile takviyenin, solucan dokularındaki doymuş yağ asitlerinin nispi miktarı üzerinde hiçbir etkisi olmadığını ortaya koymaktadır. Bununla birlikte, doymamış yağ asitleri ile takviye, birlikte alınan bu yağların nispi miktarlarını arttırdı. Bu veriler, takviye edilmiş yağ asitlerinin nispi birikiminin, diyetteki e coli'deki yağ asitlerinin nispi birikimi ile doğrudan ilişkili olduğunu göstermektedir.

Daha önce gösterdiğimiz gibi, bu grafik deniz zarafetinde DGLA sterilite indüksiyonunun doz tepkisini göstermektedir. Popülasyonun %50'sinin steril olacağı solucan lipidlerindeki DGLA konsantrasyonu yaklaşık %12'dir ve ilginç bir şekilde, DGLA'ya verilen yanıt, solucanlardaki genetik mutasyonlar tarafından değiştirilebilir. İnsüline bağlı büyüme faktörüne bağlı stres yollarının DGLA'nın neden olduğu germ hücresi yıkımını etkileyebileceğine dair yeni bir bulguya dayanmaktadır.

DAF iki insülin IGF reseptöründe veya DAF 16 FOXO transkripsiyon faktöründe zararlı mutasyonlar içeren solucanların diyetini DGLA ile destekledik, her suşta bir sterilite puanlaması, DAF iki mutantının, her iki DGLA konsantrasyonunda vahşi tip solucanlara kıyasla çok az veya hiç indüklenmemiş germ hücresi kaybı ile verimli olduğunu gösterdi. Buna karşılık, DGLA ile inaktif vox O takviyeli solucanlar, 0.15 milimolar yağ asidi içeren plakalarla beslendiğinde, vahşi tipe kıyasla daha yüksek bir steril solucan yüzdesi gösterdi. Bu prosedürü takiben araştırmacılar, gen ekspresyonu çalışmaları, davranışsal tahliller veya gelişimsel veya üreme analizleri gibi takviye edilmiş deniz zarafeti ile çok sayıda tahlil yapabilirler.

Bu tahliller, bu süreçlerde spesifik yağ asitlerinin rollerini ortaya çıkaracaktır. Bu videoyu izledikten sonra, deniz zarafetinin yağ asidi bileşimini değiştirmek için kullanılabilecek yağ asidi takviyeli ortamın tutarlı bir şekilde nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.