Name: Çoklu doymamış yağ asitlerinin Diyet takviyesi Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ın diyetine çoklu doymamış yağ asitleri takviyesi yaparak lipid bileşimini değiştirme ve metabolik düzenlemeyi inceleme yöntemini. Bu protokol gelişim biyolojisi ve biyokimya araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yazının yararlı yorumlar için temsili sonuçlar Şekil 3 ve Jason Watts ve Chris Webster gösterilen ön deneyler için Chris Webster teşekkür ederim. Bu çalışma için fon JLW için Ulusal Sağlık Enstitüleri (ABD) (R01DK074114) bir hibe sağlanmıştır. Bu çalışmada kullanılan bazı nematod ırkları Araştırma Altyapı Programları NIH Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilmektedir Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlandı.

Çoklu doymamış yağ asitleri, ısı, ışık ve oksijen duyarlıdır. Yağ asidi takviyesi tabak hazırlarken Bu nedenle, bakım alınmalıdır yağ asitleri aşırı ısı ve ışığa maruz kalmayacakları şekilde. % 0.1 Tergitol (NP-40) ihtiva eden NGM ortamı yağlı asit sodyum tuzları, sabit karıştırma ile ilave edilir ve bundan sonra, otoklav ve kısmen soğutulur. Plakalar karanlıkta kurumaya bırakılır. C. tarafından yağ asitlerinin Uptake daha sonra gaz kromatografisi ile takip edilebilir elegans, bu plakalar üzerinde kültürlendi. 1.. Yağ asit vasıta hazırlanması <ol><li> Uygun büyüklükte bir balona medya bileşenleri ölçün. 1 litre başına, 17 g Bacto-agar, 2.5 g tripton, 3 g NaCl, etanol içinde eritildi, 1 ml 5 mg / ml kolesterol ve su içinde eritildi, 10 ml% 10 Tergitol ekleyin. </li><li> Millipore su istenen son hacminin% 80 ekleyin ve farklı sayısına eşittir (boş cam şişe ile birlikte ortam otoklavyağlı asit test edilecek konsantrasyonlar), bunun yanısıra, uygun dereceli silindirler. </li><li> 55 ° C&#39;ye ayarlanmış bir su banyosu içinde Serin medya Ortam, cam şişe açık kırılma güvenlik önlemleri ile ve cam parçacıkları yağ asitleri ile karışmaz sağlanarak, yağlı asit sodyum tuzunun çalışma stok çözeltisi hazırlamak soğurken. 100 mM çalışma stok yapmak için yeterli yağ asidi dışarı tartılır. </li><li> , Saflaştırılmış su ile 100 mM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için yağlı asit çözeltisi getirin. Tam yağlı asit sodyum tuzunu çözerek, tipik olarak yaklaşık 20-30 dakika sürer. Bir atıl gaz ile temas oksidasyonunu engeller, çünkü, argon ya da azot ile birlikte bir yağ asidinin çalışma stok temizleyin. Kapatılır ve ortam soğuyana kadar karanlıkta çalışma stok saklayın. </li><li> (İsteğe bağlı) RNAi ortam istendiği takdirde, ampisilin ölçmek ve burada izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) çözümleri. </li><li> Agar 55 ° soğuduğunda 1 L başına eklemek C: 11 M MgSO 4 ml 1 M CaCI2 1 ml ve fosfat tamponu 25 ml (1 L başına 108.3 g KH 2 PO 4 ve 35.6 g K 2 HPO 4 otoklav). Filtre sterilize ampisilin ve IPTG çözümler RNAi yapım plakaları ise ekleyin. Plakalarının her türlü için, 1 L&#39;lik nihai ortam hacmi getirmek için steril su ekle </li><li> Bir alev yakınında, Otoklavlanmış aktarmak medya ve uygun Mezür boyutta ve daha sonra istenen hacme ılık steril su ekleyin. Geri ilk şişeye aktarmak medya ve karıştırarak karıştırın. </li><li> Bir alev civarında, bir otoklav ile ölçülerek test edilecek konsantrasyonlarının sayısına eşit bir dizi şişe içine transferi ortam ve uygun bir şekilde dereceli silindir boyuttadır. Yağlı asit çalışma stok tamamen çözülene kadar bir su banyosu kullanılarak bir sıvı olarak aliquoted ortamı koruyun. </li><li> Medya dokunmak sıcak, sıcak ama değil kadar bir heyecan plaka ve karıştırın üzerine bir şişe yerleştirin. Yeterince kendinizi bırakın emin olunyağlı asit stok çözeltisi içinde ilave edin ve ortam katılaşmaya başlamadan önce plakalar dökmek süresi. Heyecan plaka sıcaklığı denetimi varsa, 55 ° C&#39;ye ayarlayın </li><li> İstenen nihai konsantrasyon için ortama 100 mM yağlı asit çalışma stokları seyreltin. Stir ortam beyaz çökelti kadar çözelti (yaklaşık 1 dakika) bulunmaktadır. Medya hala sonra biraz bulanık olabilir. </li><li> (İsteğe bağlı) RNAi ortam 2 mM nihai bir konsantrasyona kadar IPTG ml ve 0.1 mg / eklenti ampisilin isteniyorsa. </li><li> 8 60 mm tabak başına ortam ml veya 100 mm plaka başına ortam 25 ml ilave otomatik bir pipet yardımı ile steril bir 25 ml bir pipet kullanılarak ortam dökün. Kalan şişeler için adımlar dökme yağlı asit ilaveli ve plaka tekrar edin. </li><li> Agar katılaşmış sonra, hafif oksidasyondan korumak için, iyi havalandırılan bir çekmece içerisinde oda sıcaklığında bir kutu ya da mağaza ile yağ asidi-takviye plakaları kapsamaktadır. </li><li> Tohum E. coli OP50 plakaları kurutuldu olan iki gün sonra, plakalar üzerine.60 mm tabak için, (37 ° C&#39;de yetiştirilen), bir gece boyunca OP50 kültür pipet 300 ul. RNAi plakalar boşaltılır olsaydı, plakalar dört gün boyunca kurutulduktan sonra, RNAi bakteri 300 ul tohum. Levha kuruma süresi nedeniyle çeşitli laboratuar ortamında nem farklılıklarından ayarlanması gerekebilir. </li><li> Bakteriyel çim kururken, oda sıcaklığında karanlık ortamda inkübe edin. </li></ol> 2. DGLA&#39;nın Suplementasyon tarafından Germ Hücre Destruction Inducing <ol><li> C. 0.3 mM DGLA (20:03 n-6) içeren plakalar üzerinde büyüdü elegans nedeniyle hem larva ve ergin nematod germ hücrelerinin imha steril hale gelir. <ol><li> Alkali hipoklorit çözeltisi ile muamele edilerek gebe çift cinsiyetli L1 larvalarının bir senkronize bir nüfus hazırlayın (10 ml solüsyon için: 5M NaOH, çamaşır suyu 2.5 ml, 7 ml H2O içinde 0.5 ml) eklenmiştir. Yavaşça yetişkin kurt kadar bu çözelti içinde gebe çift cinsiyetli kayas çözülür. Yumurta korunur ve düşük hızlı santrifüjleme ile tane haline edilebilir. </li><li> (3 g KH 2 PO 4, 6 g HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4 H, 2 O L. otoklav sonrası MgSO 4 1 ekleyin 2 Na) M9 tampon maddesi içinde yumurta terkip 3 kez yıkayın. Yeterli oksijen sağlamak için, bir gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde M9 tampon ve kaya 5 ml&#39;lik bir son hacim için 15 ml plastik bir tüp içinde yumurta tekrar süspansiyon. </li><li> L1 larva iki gün RNAi bakteri sonra kaplama OP50, ya da bir gün ile tohumlamadan sonra takviye edilmiş plakalara ilave edilmelidir. Onlar yetişkin aşamasına ulaşana kadar üç gün boyunca 20 ° C&#39;de inkübe solucanlar ya. </li></ol></li><li> Yetişkin solucanlar rahim içinde gelişmekte olan embriyolar görselleştirmek için yeterince yüksek büyütme ile bir diseksiyon mikroskobu kullanarak sterilite için attı olabilir. Başarılı germ hücre kaybı yumurta açık bir rahim boşluğu olarak görünecektir. </li><li> Solucanlar da sabitleme ve nükleik a ile boyanarak attı olabilirgerm hücreleri çekirdeklerin görselleştirme ve gelişen embriyolar kolaylaştırmaktadır cid boya diamindinophenylindole (DAPI). Hızlı bir DAPI leke bir gözlem 9 M9 tampon bir damla halinde solucan toplama ile elde edilir. <ol><li> , 0.2 ng / m 1 ml Sel-cam. DAPI% 95 etanol çözeltisi içinde, yaklaşık 5 dakika boyunca bekletin. </li><li> Bir slaytta Vectashield bir damla içine solucanlar almak ve daha sonra bir lamel ile kaplayın. </li><li> Optimum boyama için karanlık gecede 4 ° C&#39;de mühür lamel ve mağaza, ancak slaytlar de hemen görülebilir. Varlığında veya bir UV lambası ve filtre ile teçhiz edilmiş bir floresans mikroskobu kullanılarak germ hücre çekirdeklerinin olmaması için puan. </li></ol></li></ol> 3. Gaz Kromatografisi ile Yağ Asit Alımı Onaylayan C. Genel olarak yağ asidi bileşimi, elegans daha sonra ayrılır ve gaz Chr kullanılarak nicelendirilir yağlı asit metil esterleri (FAME) üretilmesi ile belirlenebiliromatography 4. <ol><li> Su ile plakalar kapalı yıkamadan ve silanize edilmiş 13 mm x 100 mm cam tüpe Üstü yivli aktarılarak 500-1.000 erişkin solucanlar toplayın. </li><li> Solucanlar yerçekimi tarafından razı olsun, ve sonra bir cam Pasteur pipeti ile mümkün olduğunca çok su çıkarmak. </li><li> Su ile bir kez solucanlar yıkayın ve daha sonra tekrar mümkün olduğu kadar çok suyu çıkarmak. </li><li> Fames bir su banyosu içinde 1 saat boyunca 70 ° C&#39;de% 2.5 1 H 2 ml metanol içinde SO 4 ve daha sonra ısıtma eklenerek oluşturulur. </li><li> Su banyosundan çıkarın ve tüpler, 1 dakika için soğutun. </li><li> 1.5 ml su ve 0.25 ml heksan eklenerek Fames ekstrakte edin. </li><li> Recap tüpler ve şiddetle çalkalanır. </li><li> , Sulu çözücüden ayrılması için heksan maksimum hızda 1 dakika boyunca masa üstü bir klinik santrifüj cihazında santrifüj tüpleri. </li><li> Sulu fazın bir transferi için dikkatli olmak, bir GC şişe içinde bir GC şişe içeriğine heksan (üst katman) aktarın. GC için analysis, heksan içinde FAME 1-2 ul kareleri analizi için uygun olan bir polar kılcal gaz kromatografi sütunu üzerine enjekte edilir. Agilent 7890 GC enjektör 1.4 ml / dk &#39;lık bir akış oranı ile, 250 ° C&#39;de ayarlanır ve GC fırın 1 dakika için tutulan 130 ° C&#39;lik bir başlangıç ​​sıcaklığı için programlanır. Bundan sonra, sıcaklık 10 ° C / dk kadar 190 ° C rampalı edilir ve daha sonra 210 ° C&#39;ye kadar 5 ° C / dk &#39;da yeniden rampalı ve ek 1 dakika tutuldu. </li><li> , DGLA&#39;nın bu uptake oluştu sağlamak C tanımlanması için otantik standartlar kullanılarak alev iyonlaşma algılaması (FID) ya da kütle spektrofotometresi (MS) tespiti ile Fames analiz etmek yağ asitleri elegans. </li></ol>

<ol><li>Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoxygenase+and+leukotriene+pathways%3A+biochemistry%2C+biology%2C+and+roles+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease.</a> Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).</li>
<li>de Lorgeril, M., Salen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+health+effects+of+dietary+saturated+and+omega-6+and+omega-3+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids.</a> BMC Med. 10, 50(2012).</li>
<li>Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+animal+omega-3+fatty+acid+desaturase+by+heterologous+expression+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li>
<li>Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiencies+in+C20+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Cause+Behavioral+and+Developmental+Defects+in+Caenorhabditis+elegans+fat-3+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants.</a> Genetics. 163, 581-589 (2003).</li>
<li>Kahn-Kirby, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Drive+TRPV-Dependent+Sensory+Signaling+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo.</a> Cell. 119, 889-900 (2004).</li>
<li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+unsaturated+fatty+acid+composition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans.</a> PLoS Genet. 2, e108(2006).</li>
<li>Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+response+pathways+protect+germ+cells+from+omega-6+polyunsaturated+fatty+acid-mediated+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).</li>
<li>Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((glp-3+is+required+for+mitosis+and+meiosis+in+the+Caenorhabditis+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line.</a> Genetics. 145, 111-121 (1997).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+manipulation+implicates+lipid+signaling+in+the+regulation+of+germ+cell+maintenance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans.</a> Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).</li>
<li>Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids%3A+II.+A+suggested+mechanism+for+the+formation+of+TBA-reactive+materials+from+prostaglandin-like+endoperoxides%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides.</a> Lipids. 11, 370-379 (1976).</li>
<li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP%283%29-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26, 554-566 (2012).</li>
<li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2FFOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((omega-6+Polyunsaturated+fatty+acids+extend+life+span+through+the+activation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy.</a> Genes Dev. 27, 429-440 (2013).</li>
<li>Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mediator+subunit%2C+MDT-15%2C+integrates+regulation+of+fatty+acid+metabolism+by+NHR-49-dependent+and+-independent+pathways+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans.</a> Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).</li>
<li>Lesa, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+chain+polyunsaturated+fatty+acids+are+required+for+efficient+neurotransmission+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans.</a> J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).</li>
<li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+desaturation+and+the+regulation+of+adiposity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 176, 865-875 (2007).</li>
<li>Goudeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+desaturation+links+germ+cell+loss+to+longevity+through+NHR-80%2FHNF4+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans.</a> PLoS Biol. 9, e1000599(2011).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ARC%2FMediator+subunit+required+for+SREBP+control+of+cholesterol+and+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis.</a> Nature. 442, 700-704 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Burada C takviyesi için bir yöntem tarif Diyet doymamış yağ asitleri ile elegans. Yukarıda belirtildiği gibi, PUFAların en çift bağların reaktif doğası, bu yağ asitleri, ısı ve ışık 11 ile oksidasyona karşı duyarlı olması neden olur, çünkü bakım PUFA takviye plakaları hazırlanmasında alınmalıdır. Oksidasyonu önlemek için, ortam karanlık bir ortamda 55 ° C ve depolar plakalara soğuduktan sonra, sıvı agar ortamına PUFA eklemek için önemlidir. Diğerleri C&#39;ye...

Yağ asitleri temel yapı membran bileşenleri hem de verimli enerji depolama moleküllerdir. Ek olarak, yağ asitleri, lipazlar tarafından hücre zarlarından parçalanabilen ve enzimatik olarak işaret efektör 1 üretilmesi için değiştirilebilir. Doğal olarak oluşan çok-doymamış yağlı asitleri (PUFAlar) iki veya daha fazla cis çift bağ ihtiva edebilir. Omega-3 yağ asitleri ve omega-6 yağ asitleri, yağ asidi metil sonuna göre çift bağların pozisyonlara göre birbirinden ayırt edilmektedir. Sağlıklı beslenme omega-6 ve omega-3 yağ asitleri hem de gerektirir. Ancak, Western diyetler omega-6 yağ asitleri ve omega-3 yağ asitleri zayıf özellikle zengindir. Yüksek bir omega-6 omega-3 yağ asidi oranı, kardiyovasküler ve enflamatuar hastalıkların riski Bununla birlikte, belirli yağ asitlerinin tam yararlı ve zararlı işlevleri de 2 anlaşılmamıştır ile ilişkilidir. Yuvarlak kurt Caenorhabditis elegabir omega-3 desatürazı, çoğu hayvan 3,4 in mevcut olan bir aktivitesi omega-6 ve omega-3 yağ asitleri, bir dizi üretmek için gerekli olan bütün enzimleri sentezler için ns yağlı asit fonksiyonu çalışmalarında yararlıdır. Yağlı asit desatüraz enzimleri eksik olan mutantlar, gelişim ve nörolojik kusurlar 4-6 bir dizi yol açan, özel PUFAların üretilmesi için başarısız. Diyet yağ asitlerinin fizyolojik etkilerini incelemek için, C de mutant ve RNAi yok etme teknikleri kullanarak genetik analizi ile uyumlu bir biyokimyasal analiz geliştirdik elegans. Özel PUFAlar ile takviyesi dökülmesinden önce agar ortamına bir yağlı asit sodyum tuzu çözeltisinin eklenmesi ile elde edilir. Bu, E. tarafından PUFA alımı ile sonuçlanan Bu bakteri membran birikir coli besin kaynağı. C. elegans PUFA içeren bakteri yemek ve bu diyet takviyesi arızalı kurtarmak için yeterlidirPUFA eksikliği mutantlarının ts. En çok yağlı asitlerin takviyesi, ancak, belirli bir omega-6 yağ asitleri, özellikle dihomo-gama linolenik asit (DGLA, 20:03 n-6) C arasında kalıcı bir imha neden yabani tip hayvanlar üzerinde herhangi bir zararlı etkisi yoktur elegans germ hücreleri 7,8. Gaz kromatografisi bakteriyel besin kaynağı (OP50 veya HT115 olarak) hem de nematod takviye yağ asidi alımını izlemek için kullanılır. Medyada deterjan Tergitol (NP-40) &#39;nin ilave edilmesi, tüm plaka ve E ile yağlı asitlerin daha etkin alınması yoluyla yağlı asitlerin dağılımını sağlar: coli ve nematodlar. Biz, doymamış yağ asitleri kolayca bakteri ve C. tarafından alınır bulduk elegans, fakat doymuş yağlı asitlerin alımını çok daha az etkilidir. Bu makalede, yağ asitleri ile agar ortamı tamamlamak için nasıl adım adım tarif, hem de inci yağ asidi alımını izlemek için ne kadar olacakgaz kromatografisi kullanılarak e nematod.

<table><tbody><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td> <td>(etanolde 5 mg / mL)</td></tr> <tr><td>MgSO4</td><td>JT Baker</td><td>2504-01</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>JT Baker</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>JT Baker</td><td>3254-05</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>JT Baker</td><td>3246-05</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dihomogamma linolenat</td><td>NuCHEK</td><td>S-1143</td><td></td></tr><tr><td>Ilık steril Millipore su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Solucanları <td></td><td></td><td></td><td>toplamak için steril su</td></tr><tr><td>DGLA stok çözeltisi için nükleaz içermeyen su</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td>100 mg/ml su (RNAi plakaları için)</td></tr><tr><td>İzopropil-beta-D-tiyogalaktopiranosid (IPTG)</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>12481C100</td><td>1 M suda (RNAi plakaları için)</td></tr><tr><td>HSO4</sub</td><td>>JT Baker</td><td>9681-03</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Hekzan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>diamindinofenilindol (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cam Şişe</td><td>Corning</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Stirbarlı Otoklavlanabilir Cam şişeler</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-800</td><td></td></tr><tr><td>Otoklavlanabilir Cam Dereceli Silindir</td><td>Fisherbrand</td><td>08-557</td><td></td></tr><tr><td>Karıştırma Plakası</td><td>VWR</td><td>97042-642</td><td></td></tr><tr><td>55+ &°C'de su banyosu; C</td><td>Hassas Bilimsel A.Ş.</td><td>66551</td><td></td></tr><tr><td>Vidalı Kapaklı Kahverengi Cam Flakon</td><td>Sun SRI</td><td>200 494</td><td></td></tr><tr><td>Argon gaz tankı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Pipet yardımcısı</td><td>Pipet Yardımı</td><td>P-90297</td><td></td></tr><tr><td>Steril Serolojik Pipetler (25 ml)</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Brülör</td><td>VWR</td><td>89038-534</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica</td><td></td><td></td>TLB3000</tr><tr><td>FAME türevlendirmesi için</td><td>silanize cam tüp</td><td>Thermo Scientific</td><td>STT-13100-S</td></tr><tr><td>PTFE Vidalı kapaklar</td><td>Kimble-Chase</td><td>1493015D</td><td></td></tr><tr><td>Klinik masa üstü santrifüj</td><td>IEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC Sıkma Flakon</td><td>SUN SRi</td><td>200 000</td><td></td></tr><tr><td>GC Flakon Ekleme</td><td>SUN SRi</td><td>200 232</td><td></td></tr><tr><td>GC Flakon kapağı</td><td>SUN SRi</td><td>200 100</td><td></td></tr><tr><td>Gaz Kromatografı</td><td>Agilent</td><td>7890A</td><td></td></tr><tr><td>Kütle Spektrometresi Dedektörü</td><td>Agilent</td><td>5975C</td><td></td></tr><tr><td>Gaz kromatografisi için kolon</td><td>Suppelco</td><td>SP 2380</td><td>30 m x 0,25 mm erimiş silika kılcal kolon</td></tr></tbody></table>

Çoklu doymamış yağ asitlerinin diyet takviyesi<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Yağ asitleri çok sayıda hücre fonksiyonları için gereklidir. Bu membran hidrofobik özünü oluşturan ve çeşitli sinyal yoluna katılabilir, verimli enerji depolama molekülleri karşılık vermektedir. Caenorhabditis elegans omega-6 ve omega-3 yağ asitleri, bir dizi üretmek için gerekli olan bütün enzimleri sentezler. Bu, basit anatomi ve mevcut genetik araçları yelpazesi ile birlikte, bu yağ asidi işlevini incelemek için çekici bir model olun. Diyet yağ asitlerinin fizyolojik etkilere aracılık genetik yollarının araştırılması amacıyla, C takviyesi için bir yöntem geliştirdik Doymamış yağ asitleri ile elegans beslenme. Takviyesi solucanlar yağ asidi bileşimini değiştirmek için etkili bir araç ve aynı zamanda yağlı asit eksikliği olan mutantlar kusurları kurtarmak için kullanılabilir. Önerilen yöntem, yağ acidsodium tuzları ile takviye edilmiş nematod büyüme ortamı, agar (NGM) kullanır. Takviye edilmiş plakalarda yağ asitleri incorpora olmakted sonra C. tarafından alınır, bakteriyel besin kaynağı, zarların içine takviye bakteriler üzerine yem elegans. Biz de desteklenmiş solucanlar meydana yağ asidi kompozisyonundaki değişiklikleri izlemek için bir gaz kromatografisi protokol açıklar. Bu C. büyük ve küçük popülasyonların diyetlerine ek etkili bir yoldur elegans, bu yöntem için bir dizi uygulama için izin verir.

C. takviyesi elegans beslenme bakteriyel zarı içine yağ asidi alımı ve birleştirmek için bakteriyel gıda kaynağının kabiliyeti ile sınırlıdır. E. yeteneğini belirlemek için bu membran içine çeşitli yağ asitleri asimile coli OP50, OP50 hiçbir takviyesi, 0.1 mM ve stearik asit (18:00), sodyum oleat (18:1 n-9), ve sodyum DGLA (20, 0.3 mM konsantrasyonları ile ortamı üzerine kaplanmıştır : 3n-6). Tabaklar karanlıkta 2 gün boyunca oda sıcaklığında kurutuldu ve 3 gün boyunca 20 ° C&#39;de i...

&lt;em&gt; Caenorhabditis elegan &lt;/ em&gt; geliştirme ve fizyolojisi çok-doymamış yağlı asitlerin fonksiyonlarını keşfetmek için uygun bir modeldir. Bu protokol &lt;em&gt; C tamamlayan etkili bir yöntem tarif elegans &lt;/ em&gt; çoklu doymamış yağ asitleri ile diyet.

Çoklu doymamış yağ asitlerinin Diyet takviyesi<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yağ asidi fonksiyonunu ve regülasyonunu incelemek için deniz zarafetinin yağ asidi bileşimini değiştirmek için diyet araçlarını kullanmaktır. Bu, nematod besin kaynağının doymamış yağ asitlerinin varlığında kültürlenmesiyle elde edilir. Daha sonraki deniz zarafeti, yağ asidinin alımına ve solucana dahil edilmesine izin veren takviye edilmiş bakterilerle beslenir.Lipitler daha sonra deniz zarafetinde değişir. Yağ asidi bileşimi, gaz kromatografisi kütle spektrometresi analizi ile doğrulanır. Son olarak, doymamış yağ asitleri ile beslendikten sonra, solucanlar sterilite için puanlanır.Değişen yağ asidi bileşiminin gelişim davranışı ve gen ekspresyonundaki değişiklikler yoluyla fizyolojik etkilerini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, deniz zarafeti gelişimi ve fizyolojisi alanlarındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, çünkü yağ asidi bileşimini değiştirmek ve sonuçları izlemek için hem genetik manipülasyonu hem de diyet katkılarını kullanabiliriz. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler dikkatli ve temkinli olmalıdır çünkü doymamış yağ asitlerinin oksijene ve yüksek sıcaklıklara duyarlılığı nedeniyle tutarlı sonuçlar elde etmek zordur.Bir litre yağ asidi takviyeli ortam hazırlamak için, aşağıdaki bileşenleri bir şişeye ölçün. 800 mililitreye kadar milipor suyu ekleyin ve ortam 55 santigrat derecede soğurken test edilecek her yağ asidi konsantrasyonu için boş bir cam şişe ve uygun dereceli silindirlerle birlikte ortamı otoklavlayın. Yağ asidi sodyum tuzunun çalışma stoğu çözeltisini, cam parçacıklarını tozun içine sokmayacak şekilde cam şişeyi dikkatlice kırarak ve 100 milimolar bir stok çözeltisi yapacak kadar tartarak hazırlayın, gerekli miktarda arıtılmış su ekleyin.Daha sonra, argon veya nitrojen gazı kullanarak, yağ asidi oksidasyonunu önlemek için çözeltiyi temizleyin. Daha sonra şişeyi kapatın ve yağ asidi, sodyum tuzu çözülürken şişeyi karanlıkta saklayın. Tarım aşağıdaki anda 55 santigrat dereceye kadar soğuduğunda, daha sonra bir alevin yakınında, çözeltiyi steril dereceli bir silindire aktarın.Bir litreye kadar steril su eklemeden önce, ortamı tekrar şişeye aktarın ve karıştırmaya devam edin. Test edilecek her yağ asidi konsantrasyonu için bir dizi ortamı otoklavlanmış bir şişeye aktarmak için steril dereceli bir silindir kullanın. Daha sonra şişeleri bir karıştırma tabağında sıcak tutun.Plakalar katılaştıktan sonra plakaları dökmek için steril bir 25 mililitrelik pipet kullanmadan önce uygun konsantrasyonda yağ asidi stok çözeltisini karıştırın, örtün ve karanlıkta iyi incelenmiş bir alanda oda sıcaklığında saklayın. İki gün sonra, plakaları tohumlamak için e coli OP 50 kullanın, ardından bakteri çimi kururken plakaları oda sıcaklığında karanlık bir ortamda inkübe edin. Ravi Hermafroditlerini alkali hipoklorit çözeltisi ile muamele ederek senkronize bir L bir larva popülasyonu hazırlayın.GR hermafroditlerini yetişkin solucanlar çözülene kadar bu çözeltide hafifçe sallayın. Daha sonra yumurtaları peletlemek için düşük hızda santrifüjleyin. Yumurtaları üç kez yıkamak için M dokuz tampon kullanın.Daha sonra 15 mililitrelik bir tüpte, beş mililitre M dokuz tamponunda yeniden süspanse edin ve gece boyunca sallayın. L one larvalarını, 0.3 milimolar di homo gammalin asit veya DGLA ile takviye edilmiş OP 50 tohumlu plakalara ekleyin ve üç gün boyunca veya larvalar yetişkin aşamasına ulaşana kadar 20 santigrat derecede inkübe edin. Yetişkin solucanları sterilite açısından puanlamak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın.Başarılı mikrop kaybı, yumurtadan yoksun berrak bir rahim olarak ortaya çıkacaktır. Alternatif olarak, solucanları bir saat camındaki bir damla M dokuz tamponuna toplayarak puanlayın. Ardından, saat camını doldurmak için mililitre başına 0,2 nanogram bir mililitre dappy solüsyonu kullanın ve yaklaşık beş dakika inkübe edin.Kuluçkadan sonra, solucanları bir kapak fişi ile kaplamadan önce bir slayt üzerinde bir damla montaj ortamına toplayın, kapak fişini kapatın ve gece boyunca karanlıkta dört santigrat derecede saklayın veya yağ asidi metil esterleri veya fame'ler üretmek için hemen bir floresan mikroskop altında görüntüleyin. Yağ asidi alımını ölçmek için, 500 ila 1000 yetişkin solucanı plakalardan yıkamak ve silikonize etmek için su kullanarak toplayın. 13 x 100 milimetre cam vidalı üst tüpler.Solucanların yerçekimi ile yerleşmesine izin verin ve ardından mümkün olduğunca fazla suyu çıkarmak için bir cam pipet kullanın. Metanol içine bir mililitre% 2.5 sülfürik asit ekleyin ve tüpleri kaputun altında bir dakika soğuduktan sonra bir saat boyunca 70 derecede bir su banyosunda ısıtın, 1.5 mililitre su ve 0.25 mililitre hekzan ekleyerek çerçeveleri çıkarın. Tüpleri tekrar kapatın ve kuvvetlice çalkalayın.Daha sonra, heksan'ı sulu çözücüden ayırmak için tüpleri bir masa üstü klinik santrifüjde bir dakika santrifüjleyin. Üst heksan katmanını bir GC şişesi içindeki bir gaz kromatografisine veya GC şişesi ekine aktarın. Gc ile analiz etmek için, fame analizine uygun bir polar kılcal gaz kromatografi kolonuna bir ila iki mikrolitre fame enjekte edin.Enjektörü dakikada 1,4 mililitre akış hızıyla 250 santigrat dereceye ayarlayın. Fırını bir dakika boyunca tutulan 130 santigrat derecelik bir başlangıç sıcaklığına programlayın. Daha sonra sıcaklığı 190 santigrat dereceye ulaşana kadar dakikada 10 santigrat derece artırın ve ardından dakikada beş santigrat derecede 210 santigrat dereceye kadar tekrar rampalayın ve ardından DGLA alımının gerçekleştiğinden emin olmak için bir dakika daha tutun.Deniz zarafetinin tanımlanması için otantik standartları kullanarak alev iyonizasyon tespiti veya kütle spektrometresi veya MS tespiti ile çerçeveleri analiz edin. Deniz zarifliği diyetinin yağ asitleri takviyesi, e coli OP 50'nin çeşitli yağ asitlerini zarlarına asimile etme yeteneğini belirlemek için bakteriyel besin kaynağının yağ asitlerini bakteri zarına alma ve dahil etme yeteneği ile sınırlıdır. OP 50, bu şekilde görüldüğü gibi 0.1 milimolar ve 0.3 milimolar sterik asit, sodyum at ve sodyum DGLA konsantrasyonları olmadan takviye edilmeden ortama kaplandı GCMS tarafından yapılan fame analizi, OLEATE ve DGLA dahil olmak üzere doymamış yağ asitlerinin, doymuş yağ asidi sterik asitten daha yüksek seviyelerde OP 50'ye dahil olduğunu göstermektedir.Ek olarak, yetişkin evre solucanlarında yağ asitleri miktarlarının ölçülmesi, doymuş yağ asitleri ile takviyenin, solucan dokularındaki doymuş yağ asitlerinin nispi miktarı üzerinde hiçbir etkisi olmadığını ortaya koymaktadır. Bununla birlikte, doymamış yağ asitleri ile takviye, birlikte alınan bu yağların nispi miktarlarını arttırdı. Bu veriler, takviye edilmiş yağ asitlerinin nispi birikiminin, diyetteki e coli'deki yağ asitlerinin nispi birikimi ile doğrudan ilişkili olduğunu göstermektedir.Daha önce gösterdiğimiz gibi, bu grafik deniz zarafetinde DGLA sterilite indüksiyonunun doz tepkisini göstermektedir. Popülasyonun %50'sinin steril olacağı solucan lipidlerindeki DGLA konsantrasyonu yaklaşık %12'dir ve ilginç bir şekilde, DGLA'ya verilen yanıt, solucanlardaki genetik mutasyonlar tarafından değiştirilebilir. İnsüline bağlı büyüme faktörüne bağlı stres yollarının DGLA'nın neden olduğu germ hücresi yıkımını etkileyebileceğine dair yeni bir bulguya dayanmaktadır.DAF iki insülin IGF reseptöründe veya DAF 16 FOXO transkripsiyon faktöründe zararlı mutasyonlar içeren solucanların diyetini DGLA ile destekledik, her suşta bir sterilite puanlaması, DAF iki mutantının, her iki DGLA konsantrasyonunda vahşi tip solucanlara kıyasla çok az veya hiç indüklenmemiş germ hücresi kaybı ile verimli olduğunu gösterdi. Buna karşılık, DGLA ile inaktif vox O takviyeli solucanlar, 0.15 milimolar yağ asidi içeren plakalarla beslendiğinde, vahşi tipe kıyasla daha yüksek bir steril solucan yüzdesi gösterdi. Bu prosedürü takiben araştırmacılar, gen ekspresyonu çalışmaları, davranışsal tahliller veya gelişimsel veya üreme analizleri gibi takviye edilmiş deniz zarafeti ile çok sayıda tahlil yapabilirler.Bu tahliller, bu süreçlerde spesifik yağ asitlerinin rollerini ortaya çıkaracaktır. Bu videoyu izledikten sonra, deniz zarafetinin yağ asidi bileşimini değiştirmek için kullanılabilecek yağ asidi takviyeli ortamın tutarlı bir şekilde nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.

dietary-supplementation-polyunsaturated-fatty-acids-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada plaka tabanlı katı diyet kısıtlaması yapmak için bir protokol...

Katı Plaka tabanlı Diyet Kısıtlama Caenorhabditis elegans</em

Biz eğitim için sağlam biyokimyasal ve mikroskobik yöntemler...

Fat Kütle Biyokimyasal ve Yüksek Verimli Mikroskobik Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

Bu yazıda, prostaglandin ve diğer eikozanoidler çıkarma ve analiz için optimize edilmiş bir prosedür...

Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Burada, organizmanın iyi beslenmiş bir beslenme durumundan aç kalmış beslenme durumuna geçmesiyle bakırdan kaçınma davranışındaki ve ortak bir besin kaynağını bulma yeteneğini değerlendirmek için tasarlanmış Caenorhabditis elegans spesifik bir analiz sunuyoruz.

bir<emCaenorhabditis elegans</emBeslenme Durumuna Dayalı Bakır Kaçınma Deneyi

Nil sabit Caenorhabditis elegans boyama kırmızı tarafsız lipid mevduat, nicel ölçüm için bir yöntem ise petrol kırmızı O boyama doku arasında lipid dağıtım nitel değerlendirilmesi kolaylaştırır.

Lipid bolluk ve değerlendirme Lipid dağılımı Nil kırmızı ve O kırmızı petrol boyama tarafından Caenorhabditis elegans miktar

Burada, varyasyon azaltmak, tekrarlanabilirlik geliştirmek ve yorumların kolaylaştırmak amacıyla bir protokol RNA, DNA ve protein aynı örnekten izolasyonu için mevcut.

Kombine nükleotit ve Caenorhabditis elegans Protein çekimi

Proteostatik düşüş, nörodejeneratif hastalıkların başlangıcını kolaylaştıran yaşlanmanın ayırt edici bir özelliğidir. İki farklı Caenorhabditis elegans dokularındaki proteostazları, floresan bir muhabire kaynaşmış poliglutamin tekrarlarının heterolog ifadesiyle ölçülebilir bir şekilde ölçmek için bir protokol özetliyoruz. Bu model proteostazın hızlı in vivo genetik analizine izin verir.

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

Omiks araştırmalarında Caenorhabditis elegans (C. elegans)kullanmak için, karşılaştırmalı analizler için platformlar arasında tek bir numunenin ölçülebileceği büyük solucan popülasyonları oluşturmak için bir yönteme ihtiyaç vardır. Burada, C. elegans popülasyonlarını büyük ölçekli kültür plakalarında (LSCP' ler) kültüre ve nüfus artışını belgelemek için bir yöntem sunulmuştur.

Büyük Ölçekli Karma Aşama Caenorhabditis Elegans Popülasyonlarının Kültürü ve Tahlilleri

Uyarılmış Raman saçılma (SRS) mikroskopisi, spesifik kimyasal moieties'in seçici, etiketsiz görüntülenmesini sağlar ve lipit moleküllerini in vivo olarak görüntülemek için etkili bir şekilde sunulmuştır. Burada, SRS mikroskopi prensibine kısa bir giriş sağlıyoruz ve Caenorhabditis elegans'talipid depolama görüntülemede kullanımı için yöntemleri açıklıyoruz.

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskopisi Kullanılarak Caenorhabditis elegans Lipid Depolama Dinamiklerinin Etiketsiz Görüntülenmesi

Mevcut protokol, Caenorhabditis elegans için sıvı ve plaka üstü kültürlerde lipit takviyesi yöntemlerini, uzunlamasına çalışmalar ve toplu veya birkaç solucan ve solucan dokusundan gen transkripsiyonel analizi ile birlikte tanımlamaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta Uzun Ömürlülük ve Gen Transkripsiyonel Analizi için Lipid Takviyesi

Bu protokol, sıvı kültürdeki bakterilerin klirensinin ölçülmesine dayalı olarak Caenorhabditis elegans besleme hızını ölçmek için bir testi tanımlar.

Bakteriyel Klerensi Ölçerek Caenorhabditis elegans'ta Gıda Alımının Ölçülmesi

Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ın diyetine çoklu doymamış yağ asitleri takviyesi yaparak lipid bileşimini değiştirme ve metabolik düzenlemeyi inceleme yöntemini. Bu protokol gelişim biyolojisi ve biyokimya araştırmalarında kullanılır.

Çoklu doymamış yağ asitlerinin Diyet takviyesi

Daha fazla video keşfet