Yetişkin Kemirgen Beyin konvansiyonel ve konvansiyonel olmayan Bölgelerinden Nöral Kök Hücreler Büyüyen

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yetişkin kemirgen beyninin farklı bölgelerinden nöral kök hücre kültürleri oluşturmaktır. Bu, nöral kök hücrelerin varlığını ve potansiyelini incelemek için ilgilenilen bir bölgeden doku toplanarak elde edilir. İkinci adım olarak, dokuyu tek katmanlı bir kültür olarak kaplamak için bir hücre süspansiyonuna işleyin.

Daha sonra, nöral kök hücreleri seçici olarak çoğaltmak için tanımlanmış kültür koşullarını kullanın ve kendi kendini yenileme potansiyellerini doğrulayın. İn vitro sonuçlar, nöral kök hücrelerin farklılaşma potansiyellerine ve çeşitli faktörlerin kendilerini yenilemelerini ve kaderlerini nasıl etkileyebileceğine bağlı olarak çok güçlü olduğunu gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, endojen nöro kök hücrelerin nerede bulunduğu ve bunların nasıl manipüle edileceği gibi sinirbilim ve rejeneratif tıp alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniği ilk olarak sinyal azaltma yollarını keşfettiğimizde düşündük. Bu, hem varsayılan endojen nöros kök hücrelerini tanımlamamıza hem de sayılarını düzenlememize izin verdi. Bu yüzden bu bilgiyi, beynin farklı bölgelerinden bu hücrelerin sağlam kültürlerini oluşturmak için uyguladık.

Özelliklerini inceleyin ve şu soruyu sorun, bunlar gerçekten kök hücreler mi? Uygun kültür kabı hazırlığı, planlanan diseksiyondan iki gün önce bulaşıkları mililitre başına 75 mikrogram poli L ornitin ile kaplayın. Daha sonra plakaları ertesi gün gece boyunca inkübe edin, poli L ornitini aspire edin ve her bir kuyuyu yıkama başına beş dakika boyunca üç mililitre PBS ile iki kez yıkayın.

Plakalar daha sonra üç haftaya kadar bir inkübatörde saklanabilir Son yıkamayı çıkardıktan sonra, nazikçe pipetleme ile PBS'de bir ila 250 oranında seyreltilmiş lif ekleyin. Çözeltiyi aşırı derecede ajite etmemeye dikkat edin. Daha sonra diseksiyon gününde plakaları gece boyunca inkübe edin.

Fibronektini aspire edin ve bulaşıkları PBS ile iki kez yıkayın. Son PBS yıkaması ile plakaları inkübatöre geri koyun ve ayrışan doku için bekleyin. Kullanılmayan plakalar inkübatörde bir haftaya kadar saklanabilir, ancak kurumasına izin vermeyin ve çalkalamayın.

Bu protokolün gösterimi üç yetişkin sıçana ölçeklendirilmiştir. İlk olarak, ilk fareye ötenazi yapmadan önce beyin kesit bloğunu buz üzerinde soğuttuğunuzdan emin olun. Daha sonra beş mililitre N, iki orta ve temel FGF içeren buz üzerinde 15 mililitrelik konik bir tüp hazırlayın.

Beyni ötenazi uygulanmış bir sıçandan çıkardıktan sonra, beyni buz gibi soğuk PBS içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra beyni, herhangi bir saç veya kan kalıntısı olmadan ikinci bir PBS kabına aktarın. Şimdi beyni soğutulmuş kesit bloğuna yerleştirin ve hücrelerin üretileceği ilgili bölgeye yakın bir yerde bloğa yeni bir temiz tıraş bıçağı yerleştirin.

Ardından, ikinci bir temiz tıraş bıçağı yerleştirin. İlk tıraş bıçağına üç milimetre sarsıntı. Bıçakları, ilgilenilen bölümü yanlarına alarak bloktan dikkatlice kaldırın.

PBS'ye daldırarak bıçağın üzerindeki bölümü yüzdürün. Şimdi beş numaralı forseps kullanarak ilgilendiğiniz alanı hasat edin. Bu örnekte, bölüm ön komissürü içerir. Emin.

Bölümü, bazik FGF ile beş mililitre N iki ortam içeren 15 mililitrelik konik tüpe toplayın. Ardından çözeltinin hacmini bir ila iki mililitreye düşürün. Daha sonra, bir hücre kültürü davlumbazında, bir mililitrelik pipet ucunu koninin dibine batırın ve dokuyu mekanik olarak ayırmak için yaklaşık 20 çözelti akışı kullanın.

Çözelti homojen hale geldiğinde tasyonu durdurun ve birkaç dakika bekletin, böylece daha büyük ilişkisiz dokular dibe çöker. Şimdi homojen süpernatanı herhangi bir doku parçası olmadan 8.5 mililitre takviye edilmiş ve iki ortam içeren konik bir tüpe aktarın. Tüp içeriğini karıştırın ve hazırlanmış bir altı hazırlayın.

Kuyu plakası. PBS'yi kuyucuklardan çıkarın ve daha sonra sonraki 10 ila 14 günlük kültür boyunca üç kuyuya oyuk başına üç mililitre hücre karışımı ekleyin. Ortamı her gün taze takviye edilmiş N iki ile değiştirin, her gün kaplamadan 24 saat sonra başlayarak, N ikide taze bir takviye hacmi ekleyin.

Zaten hücrelerde bulunan ortama orta. Hücreleri farklılaşmamış tutmak ve genişlemelerine izin vermek için ortam koşullarına özen göstermek çok önemlidir. İlk orta değişimden sonra, kan damarları ile birlikte büyük miktarda hücresel kalıntı kaldı.

Bununla birlikte, önümüzdeki birkaç gün içinde, farklı çoğalan kök hücre kolonileri görünür hale geldi. Ayrıca hücre popülasyonları gibi daha uzun iğ de mevcuttu. Bunlar nöral kök hücreler değildir ve sonunda nöral kök hücreler çoğaldıkça ele geçirilmiştir.

Önümüzdeki iki hafta boyunca, nöral kök hücreler birleşene kadar daha yoğun bir şekilde büyüdü. Bu kültürler, SOX iki, hesi ve yuva dahil olmak üzere bir dizi kök hücre belirteci için pozitif boyandı. Böylece, seçilen ve genişletilen hücre popülasyonlarının gerçekten nöral kök hücreler olduğuna dair güven sağlar.

FGF'nin ortamdan çekilmesinden sonra daha fazla onay geldi, bu da hücrelerin 10 gün boyunca nöronlara, astrositlere ve tüm cendra sitlerine farklılaşmasına izin verdi. Farklılaşmayı teşvik etmek. Takviye edilmiş N iki besiyerini unsu takviyeli N iki, orta ile değiştirin ve hücreleri 10 gün boyunca bu şekilde kültürleyin, 10 gün sonra her 48 saatte bir N ikisini değiştirin, ortamı aspire edin ve hücreleri 20 dakika boyunca oyuk başına iki mililitre% 4 para formaldehit ile sabitleyin.

Sabitleyiciyi yıkama başına beş dakika boyunca iki kez üç mililitre PBS ile yıkayın. İkinci yıkamayı aspire ettikten sonra, hücreler oda sıcaklığında 20 dakika inkübe ederken hücrelere nüfuz etmek ve bloke etmek için %5 normal eşek serumu ve %0.1 tritton X 100 içeren iki mililitre PBS ekleyin. Primer antikor karışımını PBS'de %5 NDS içeren hazırlayın.

Bu örnekte, nöronları tanımlamak için anti T UJ bir antikor uygulanırken, sırasıyla astrositleri ve oligodendrositleri görselleştirmek için GFAP ve CPA antikorları kullanılır. 20 dakika sonra, bloke edici çözeltiyi aspire edin ve her birine 1.5 mililitre birincil antikor karışımı ekleyin. Hücreleri iyi inkübe edin.

90 dakika sonra 90 dakika boyunca oda sıcaklığını ekleyin, hücreleri iki PBS banyosu ile yıkayın, ardından% 5 NDS içeren bir PBS uygulaması yapın, üç mililitre çözelti ve beş dakikalık banyolar kullanın. Son yıkamayı çıkardıktan sonra, her birine% 5 NDS içeren PBS'de 1.5 mililitre ikincil antikor uygulayın. Sonra plakayı karanlığa koyun, oda sıcaklığını ekleyin ve 40 dakika bekleyin.

40 dakika sonra, ikincilini iki mililitre taze hazırlanmış DPI lekesi ile değiştirin ve üç dakika bekleyin. DPI çözeltisini aspire ettikten sonra, hücreleri yıkama başına beş dakika boyunca üç mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Bu prosedürü takiben hücreler daha sonra mikroskopi için hazırdır.

Farmakolojik tedavilerden veya hücre farklılaşması sırasında ortaya çıkan protein ekspresyonu ve fosforilasyondaki değişikliklere bakmak için western blots gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu tekniğin geliştirilmesinden sonra, aslında sinirbilim alanındaki araştırmacıların, fareler, sıçanlar ve hatta primatlar da dahil olmak üzere birkaç farklı türde araştırmada uyguladıkları yeni yöntemleri test etmelerinin yolunu açtı.