Sanal Gerçeklik Çevre gezinme Farelerde iki foton Kalsiyum Görüntüleme
20 Şubat 2014
Burada bir sanal gerçeklik ortamında davranış sırasında fare korteksin iki foton görüntüleme katılan deneysel işlemleri.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, farelerde kronik iki foton görüntülemenin temel yönlerini gerçekleştirmek ve sanal gerçeklik ortamını keşfetmektir. Bu, davranan farelerde hızlı ve kararlı görüntüleme için iki fotonlu bir mikroskobun modifiye edilmesiyle elde edilir. Daha sonra, hareket takibi yapabilen hava destekli bir koşu bandı kurulur.
Daha sonra ışık sızıntısını en aza indirmek için mikroskopla senkronize edilmiş bir LED projektör kullanan bir sanal gerçeklik ortamı hazırlanır. Sonuç olarak, hareket artefaktlarının azalması, ışık sızıntısının azalması ve foto hasar kenarının en aza indirilmesi nedeniyle iyi ve stabil görüntü kayıtları elde edilir. Bu yöntem, sanal gerçeklik ortamında gezinme sırasında nöroaktiviteyi ölçmek için kullanılabilse de, görsel uyarım gerektiren çok çeşitli farklı davranışsal paradigmalara da kolayca uyarlanabilir.
Tüm hayvan prosedürleri, Kanton Basil sta'nın veterinerlik departmanının yönergelerine uygun olarak onaylandı ve gerçekleştirildi. Bu deneylerde kullanılan iki foton mikroskobu, sekiz veya 12 kilohertz rezonans tarayıcı ve standart bir galvanometreden oluşan bir tarama kafasından oluşur. Bu, 750 çarpı 400 pikselde 40 veya 60 hertz kare hızlarını mümkün kılar ve beyin hareketinin neden olduğu görüntü bozulmasını, foto ağartmayı ve fototoksisiteyi azaltır.
Piezoelektrik yüksek hızlı bir Z stepper, birden çok derinlikte zaman aralıklı görüntüleri sırayla elde etmek için kullanılır. Tarama yolunun geri dönüş noktalarında dokuya lazer maruziyetini azaltmak için mekanik bir köreltici kullanılır, kördürücünün genişliğini ayarlamak için ayarlanabilir olması gerekir. Rezonans tarayıcının genliğine bağlı olarak, koşu bandının bilye tutucusuna en az 10 milimetre iç çapa sahip bir hava besleme tüpü bağlayın ve gürültüyü azaltmak için ana hava beslemesi ile bilye tutucu arasına bir BLE miktarda boru yerleştirin.
Özel olarak tasarlanmış ve 3D baskılı bir top tutucuya 20 santimetre çapında bir polistiren köpük top yerleştirin. Davranışsal paradigma yalnızca ileri ve geri hareket gerektiriyorsa, topun yan tarafına 19 gauge hipodermik iğne gibi bir pim yerleştirin. Topun yatay eksendeki hareketini kısıtlamak için, topun sırasıyla iki veya üç eksen etrafındaki hareketini izlemek için bir veya iki optik bilgisayar faresi kullanın.
Sanal gerçeklik ortamını hazırlamak için, ekran için LED projektörler veya LED arkadan aydınlatmalı bilgisayar ekranları kullanın. Görüntüleme sırasında LED'lerin hızlı bir şekilde titremesi için bir geçit devresi entegre edin. 24 kilohertz titreme frekansı, titreme füzyon eşiğinin üzerindeki büyüklük sıralarıdır ve bunun üzerinde titreme artık hayvan tarafından algılanmaz.
Projektörün ışık çıkışını öğrenci takibi için rezonans tarayıcının geri dönüş noktalarıyla senkronize etmek için tam titreme frekansını ve görev döngüsünü ayarlayın, CMOS tabanlı bir video kamera kullanın. Kameranın kızılötesi engelleme filtresi içermediğinden emin olun. Genetik kalsiyum indikatörünü enjekte ettikten ve bir kraniyal pencere implante ettikten yaklaşık iki ila üç hafta sonra, kraniyal pencere implantını netlik ve ifade açısından kontrol etmek için epi floresan aydınlatma kullanın.
Açıkça görülebilir ve keskin bir şekilde tanımlanmış. Yüzeysel kan damarlarının sınırları, pencere implantının bir ila iki gün sonra görüntüleme için uygun olduğunun iyi bir göstergesidir. İki foton deneyini gerçekleştirmek için, lazer gücünü numunede 50 miliwatt'ın altında bir değere ölçün ve ayarlayın.
Ardından küresel koşu bandına giden hava akışını açın. Sonraki kafa, hayvanı küresel koşu bandına sabitleyin. İlk birkaç kez fare kafası sabitlenir.
Bu işlem, hayvanı izo flor ile kısa bir süre sakinleştirerek kolaylaştırılabilir. Hayvan prosedüre alıştıktan sonra, montaj normal olarak sedasyon olmadan gerçekleştirilebilir. Bu prosedür sırasında hayvan üzerindeki stresi en aza indirmenin kritik olduğunu unutmayın.
Ardından, hayvana erişime izin vermek için görsel görüntüleme sistemini hayvana mümkün olduğunca yakın konumlandırın. Kraniyal pencere implantının kir içermediğinden emin olun ve gerekirse suyla temizleyin, ışık koruması için kafatası penceresi ile suya daldırma hedefi arasına daldırma ortamı olarak şeffaf ultrason jeli uygulayın. Objektifin ve baş çubuğunun etrafına bir parça siyah bant sarın.
Sanal ortam arenasını son konumuna getirin ve video kamerayı öğrenci takibi için ayarlayın. Son olarak, lazer körelticiyi deney sırasında kullanılan tarama genliğiyle eşleşecek şekilde ayarlayın ve deneyler tamamlandığında verileri kaydetmeye başlayın. Hayvanı kurumunuzun yönergelerine göre ötenazi yapın.
Genetik bir kalsiyum indikatörü ile etiketlenmiş hücre popülasyonlarının iki fotonlu kalsiyum görüntülemesindeki görüntü kalitesi, büyük ölçüde burada gösterildiği gibi kraniyal pencere implantının kalitesine bağlıdır, virüs enjeksiyonundan sonra kraniyal pencereyi netlik açısından kontrol ederken, granülasyon dokusu veya kemik büyümesi görünmemelidir. Ayrıca, yüzeysel kan damarlarının paterni değişmeden kalmalı ve damar sisteminin sınırları keskin bir şekilde tanımlanmalıdır. Aynı zamanda, etiketli hücrelerin BOI'si bir epi floresan mikroskobu altında açıkça görülebilmelidir.
İdeal olarak, hazırlık, farenin hareketinden kaynaklanan iki foton görüntüsünün bozulmaları, çerçeve kaydından sonra görüntüde görünmeyecek şekilde yeterince kararlıdır. Görsel stimülasyon sisteminden gelen ışık sızıntısı, projektörün ışık çıkışının rezonans tarayıcının geri dönüş noktalarına doğru şekilde zamanlanmasıyla tamamen ortadan kaldırılabilir. Veriler elde edilmediğinde, ışık kaynağının titreme frekansı, tarama frekansının iki katı olmalıdır.
Bu örnekte, görsel stimülasyon sırasında turuncu kutularda gösterilen ışık sızıntısının etkisini göstermek için karartıcı çıkarılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, görüntülemede, farelerde davranmada, sanal gerçeklik ortamında gezinmede iki yönlü performans göstermeyi iyi anlamış olmalısınız. Görüntüleme ve sanal gerçeklik sistemlerini burada anlatıldığı gibi kurmanın yanı sıra, bu deneylerde başarının anahtarı kafatası penceresi implant tekniğine hakim olmaktır.
Temiz bir implant, yüksek kaliteli görüntüler ve stabil kayıtlar için bir ön koşuldur.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, denekler bir sanal gerçeklik ortamında gezinirken fare korteksinin kronik iki foton görüntülemesine yönelik deneysel prosedürleri açıklamaktadır. Metodoloji, davranışsal çalışmalar sırasında artefaktların minimize edilmesine ve görüntü kalitesinin artırılmasına odaklanmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Görüntüleme Teknikleri
- Davranışsal Çalışmalar
Arka Plan
- Kronik iki foton görüntüleme, canlı deneklerde nöroaktivitenin gözlemlenmesine olanak tanır.
- Sanal gerçeklik ortamları, davranışsal deneyler için kontrollü uyaranlar sağlayabilir.
- Işık sızıntısını ve hareket artefaktlarını minimize etmek, yüksek kaliteli görüntüleme için kritik öneme sahiptir.
- Uyarlanabilir yöntemler, çeşitli davranışsal paradigmalara uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Sanal gerçeklik ortamında navigasyon sırasında farelerdeki nöroaktiviteyi incelemek.
- Harekete uyumlu, stabil bir görüntüleme düzeneği geliştirmek.
- Görsel uyarılara yanıt olarak beyin fonksiyonlarına dair anlayışı artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Hızlı görüntüleme için iki fotonlu mikroskobun modifikasyonu.
- Lokomosyon takibi için hava destekli bir koşu bandının kurulumu.
- Bir LED projektör kullanılarak senkronize bir sanal gerçeklik ortamının hazırlanması.
- Hareket artefaktlarını ve ışık sızıntısını azaltmaya yönelik tekniklerin uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Stabil ve yüksek kaliteli görüntü kayıtları elde edilmiştir.
- Azaltılmış hareket artefaktları, nöroaktivite ölçümlerinin güvenilirliğini artırmıştır.
- Yöntem çok yönlüdür ve çeşitli davranışsal çalışmalar için uyarlanabilir.
- Navigasyon görevleri sırasında nöroaktivite ölçümünün başarılı bir şekilde gösterimi gerçekleştirilmiştir.
Sonuçlar
- Modifiye edilmiş görüntüleme düzeneği, davranış sergileyen farelerde beyin aktivitesini incelemek için etkilidir.
- Sanal gerçeklik ortamları, uyaranlara verilen nöral tepkilere dair değerli bilgiler sağlar.
- Bu yaklaşım, geniş bir deneysel paradigmalar yelpazesinde kullanılabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu yöntem, davranış halindeki farelerde kronik ve yüksek sadakatli nöral aktivite izlemeye olanak tanıyarak, nörobilim ilaç keşiflerinde hedef doğrulama ve mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. Lokomosyon sırasında iki fotonlu görüntülemeyi stabilize ederek, yolak modülasyon çalışmalarındaki öngörü güvenini artırır. Bu yaklaşım, in vitro bulgular ile in vivo fonksiyonel çıktıları birbirine bağlayarak, MSS hedefli terapötikler için translasyonel sürekliliği geliştirir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hedefe yönelik navigasyon sırasında hücre tipine özgü kalsiyum dinamikleri aracılığıyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Kontrollü bir VR paradigmasında nöronal popülasyon aktivitesini tanımlanmış davranışsal çıktılarla ilişkilendirerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Öngörücü Değer: Hedef etkileşiminin ölçülebilir ve tekrarlanabilir nörofizyolojik çıktılarını sağlayarak portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Kararlı ve artefaktların minimize edildiği görüntüleme pencereleri oluşturarak, onaylanmış biyolojik sistemleri sonraki bileşik taramaları için hazırlar.
- Kantitatif Çıktı: Doz-yanıt ve kinetik analizleri destekleyen floresan tabanlı bağımlı değişken ölçümlerini (ΔF/F) mümkün kılar.
- Ölçeklenebilirlik: Senkronize LED projeksiyonu ve hareket takip altyapısı sayesinde, platformun farklı davranışsal paradigmalar arasında yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgililik: Nöropsikiyatrik ve nörodejeneratif endikasyonlarla ilgili modellerde nöral devre disfonksiyonunun incelenmesini kolaylaştırır.
- Translasyonel Süreklilik: Nöronal aktivitenin tutarlı ve boylamsal okumaları aracılığıyla, erken keşif mekanizmalarını preklinik doğrulamaya bağlar.
- Riski Ayarlanmış İlerleme: Hedef modülasyonun davranış sırasında beklenen devre düzeyindeki etkileri üretip üretmediğini ortaya çıkararak git/gitme kararlarına bilgi sağlar.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Yöntem, hipotez testinden öncü bileşik optimizasyonuna kadar olan keşif sürecine entegre olarak, hedef seçimini ve bileşik önceliklendirmesini bilgilendiren mekanistik veriler sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Navigasyon görevleri sırasında hücreye özgü aktivite haritalandırmasına olanak tanıyarak, yolak açıklığa kavuşturulmasını ve hedef doğrulanmasını destekler.
- Tarama: MSS programlarında güvenilir bileşik değerlendirmesi için temel teşkil eden analiz hazırlığı ve tekrarlanabilir nicel çıktılar sağlar.
- Analitik: Deneysel koşulların istatistiksel karşılaştırmasına imkan veren ΔF/F ölçümleri ve zamanla kilitlenmiş davranışsal korelasyonlar sunar.
- Translasyonel Araştırma: Genetik olarak tanımlanmış nöronal popülasyonların stabil, kronik görüntülemesi aracılığıyla keşif aşamasından preklinik çalışmalara süreklilik sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla projede çeşitli görsel stimülasyon paradigmalarına uyarlanabilen, yeniden kullanılabilir bir görüntüleme platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hareket artefaktlarından ve ışık sızıntısından kaynaklanan gürültüyü azaltarak hedef modülasyonundaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Senkronize lazer karartma ve pupil takibi yoluyla tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Erken aşamalı mekanistik risk azaltma sayesinde, geç aşama MSS programlarındaki başarısızlık oranlarını düşürerek sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Bileşiklerin, yalnızca bağlanma afinitesine göre değil, fonksiyonel nöral devre etkilerine göre riskle düzeltilmiş önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Kranyal pencere cerrahisi, genetik kalsiyum indikatörü ekspresyonu ve iki fotonlu sistem hizalaması konusunda uzmanlık gerektirir.
- Yüksek hızlı rezonans tarama, piezoelektrik Z-adımleme ve kapılama devrelerine sahip LED projeksiyon sistemlerine dayanır.
- Cerrahi hazırlık, davranışsal eğitim ve görüntü işleme boru hatları için ekipler arası standartlaştırma gerektirir.
- Kafa fiksasyonu, koşu bandı mekaniği ve görsel alan kapsamındaki modele özgü adaptasyonlar dikkate alınmalıdır.
- Pratik sınırlamalar arasında cerrahi canlılık penceresi, indikatör ekspresyon stabilitesi ve düzeltmeye rağmen kalıntı hareket artefaktlarına karşı duyarlılık yer alır.
