Sanal Gerçeklik Çevre gezinme Farelerde iki foton Kalsiyum Görüntüleme

Burada bir sanal gerçeklik ortamında davranış sırasında fare korteksin iki foton görüntüleme katılan deneysel işlemleri.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farelerde kronik iki foton görüntülemenin temel yönlerini gerçekleştirmek ve sanal gerçeklik ortamını keşfetmektir. Bu, davranan farelerde hızlı ve kararlı görüntüleme için iki fotonlu bir mikroskobun modifiye edilmesiyle elde edilir. Daha sonra, hareket takibi yapabilen hava destekli bir koşu bandı kurulur.

Daha sonra ışık sızıntısını en aza indirmek için mikroskopla senkronize edilmiş bir LED projektör kullanan bir sanal gerçeklik ortamı hazırlanır. Sonuç olarak, hareket artefaktlarının azalması, ışık sızıntısının azalması ve foto hasar kenarının en aza indirilmesi nedeniyle iyi ve stabil görüntü kayıtları elde edilir. Bu yöntem, sanal gerçeklik ortamında gezinme sırasında nöroaktiviteyi ölçmek için kullanılabilse de, görsel uyarım gerektiren çok çeşitli farklı davranışsal paradigmalara da kolayca uyarlanabilir.

Tüm hayvan prosedürleri, Kanton Basil sta'nın veterinerlik departmanının yönergelerine uygun olarak onaylandı ve gerçekleştirildi. Bu deneylerde kullanılan iki foton mikroskobu, sekiz veya 12 kilohertz rezonans tarayıcı ve standart bir galvanometreden oluşan bir tarama kafasından oluşur. Bu, 750 çarpı 400 pikselde 40 veya 60 hertz kare hızlarını mümkün kılar ve beyin hareketinin neden olduğu görüntü bozulmasını, foto ağartmayı ve fototoksisiteyi azaltır.

Piezoelektrik yüksek hızlı bir Z stepper, birden çok derinlikte zaman aralıklı görüntüleri sırayla elde etmek için kullanılır. Tarama yolunun geri dönüş noktalarında dokuya lazer maruziyetini azaltmak için mekanik bir köreltici kullanılır, kördürücünün genişliğini ayarlamak için ayarlanabilir olması gerekir. Rezonans tarayıcının genliğine bağlı olarak, koşu bandının bilye tutucusuna en az 10 milimetre iç çapa sahip bir hava besleme tüpü bağlayın ve gürültüyü azaltmak için ana hava beslemesi ile bilye tutucu arasına bir BLE miktarda boru yerleştirin.

Özel olarak tasarlanmış ve 3D baskılı bir top tutucuya 20 santimetre çapında bir polistiren köpük top yerleştirin. Davranışsal paradigma yalnızca ileri ve geri hareket gerektiriyorsa, topun yan tarafına 19 gauge hipodermik iğne gibi bir pim yerleştirin. Topun yatay eksendeki hareketini kısıtlamak için, topun sırasıyla iki veya üç eksen etrafındaki hareketini izlemek için bir veya iki optik bilgisayar faresi kullanın.

Sanal gerçeklik ortamını hazırlamak için, ekran için LED projektörler veya LED arkadan aydınlatmalı bilgisayar ekranları kullanın. Görüntüleme sırasında LED'lerin hızlı bir şekilde titremesi için bir geçit devresi entegre edin. 24 kilohertz titreme frekansı, titreme füzyon eşiğinin üzerindeki büyüklük sıralarıdır ve bunun üzerinde titreme artık hayvan tarafından algılanmaz.

Projektörün ışık çıkışını öğrenci takibi için rezonans tarayıcının geri dönüş noktalarıyla senkronize etmek için tam titreme frekansını ve görev döngüsünü ayarlayın, CMOS tabanlı bir video kamera kullanın. Kameranın kızılötesi engelleme filtresi içermediğinden emin olun. Genetik kalsiyum indikatörünü enjekte ettikten ve bir kraniyal pencere implante ettikten yaklaşık iki ila üç hafta sonra, kraniyal pencere implantını netlik ve ifade açısından kontrol etmek için epi floresan aydınlatma kullanın.

Açıkça görülebilir ve keskin bir şekilde tanımlanmış. Yüzeysel kan damarlarının sınırları, pencere implantının bir ila iki gün sonra görüntüleme için uygun olduğunun iyi bir göstergesidir. İki foton deneyini gerçekleştirmek için, lazer gücünü numunede 50 miliwatt'ın altında bir değere ölçün ve ayarlayın.

Ardından küresel koşu bandına giden hava akışını açın. Sonraki kafa, hayvanı küresel koşu bandına sabitleyin. İlk birkaç kez fare kafası sabitlenir.

Bu işlem, hayvanı izo flor ile kısa bir süre sakinleştirerek kolaylaştırılabilir. Hayvan prosedüre alıştıktan sonra, montaj normal olarak sedasyon olmadan gerçekleştirilebilir. Bu prosedür sırasında hayvan üzerindeki stresi en aza indirmenin kritik olduğunu unutmayın.

Ardından, hayvana erişime izin vermek için görsel görüntüleme sistemini hayvana mümkün olduğunca yakın konumlandırın. Kraniyal pencere implantının kir içermediğinden emin olun ve gerekirse suyla temizleyin, ışık koruması için kafatası penceresi ile suya daldırma hedefi arasına daldırma ortamı olarak şeffaf ultrason jeli uygulayın. Objektifin ve baş çubuğunun etrafına bir parça siyah bant sarın.

Sanal ortam arenasını son konumuna getirin ve video kamerayı öğrenci takibi için ayarlayın. Son olarak, lazer körelticiyi deney sırasında kullanılan tarama genliğiyle eşleşecek şekilde ayarlayın ve deneyler tamamlandığında verileri kaydetmeye başlayın. Hayvanı kurumunuzun yönergelerine göre ötenazi yapın.

Genetik bir kalsiyum indikatörü ile etiketlenmiş hücre popülasyonlarının iki fotonlu kalsiyum görüntülemesindeki görüntü kalitesi, büyük ölçüde burada gösterildiği gibi kraniyal pencere implantının kalitesine bağlıdır, virüs enjeksiyonundan sonra kraniyal pencereyi netlik açısından kontrol ederken, granülasyon dokusu veya kemik büyümesi görünmemelidir. Ayrıca, yüzeysel kan damarlarının paterni değişmeden kalmalı ve damar sisteminin sınırları keskin bir şekilde tanımlanmalıdır. Aynı zamanda, etiketli hücrelerin BOI'si bir epi floresan mikroskobu altında açıkça görülebilmelidir.

İdeal olarak, hazırlık, farenin hareketinden kaynaklanan iki foton görüntüsünün bozulmaları, çerçeve kaydından sonra görüntüde görünmeyecek şekilde yeterince kararlıdır. Görsel stimülasyon sisteminden gelen ışık sızıntısı, projektörün ışık çıkışının rezonans tarayıcının geri dönüş noktalarına doğru şekilde zamanlanmasıyla tamamen ortadan kaldırılabilir. Veriler elde edilmediğinde, ışık kaynağının titreme frekansı, tarama frekansının iki katı olmalıdır.

Bu örnekte, görsel stimülasyon sırasında turuncu kutularda gösterilen ışık sızıntısının etkisini göstermek için karartıcı çıkarılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, görüntülemede, farelerde davranmada, sanal gerçeklik ortamında gezinmede iki yönlü performans göstermeyi iyi anlamış olmalısınız. Görüntüleme ve sanal gerçeklik sistemlerini burada anlatıldığı gibi kurmanın yanı sıra, bu deneylerde başarının anahtarı kafatası penceresi implant tekniğine hakim olmaktır.

Temiz bir implant, yüksek kaliteli görüntüler ve stabil kayıtlar için bir ön koşuldur.