Name: Sanal Gerçeklik Çevre gezinme Farelerde iki foton Kalsiyum Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-20T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Öğrenin, sanal gerçeklik ortamında gezinen farelerde kronik iki foton kalsiyum görüntüleme yöntemini. Hareket artefaktlarını azaltarak yüksek kaliteli nöroaktivite kayıtları elde edin ve davranışsal nörobilim çalışmalarınızı geliştirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Biyomedikal Araştırma Friedrich Miescher Enstitüsü, Max Planck Derneği ve İnsan Frontiers Bilim Programı tarafından desteklenmiştir.

Bütün hayvan prosedürleri onaylanmış ve Kanton Basel-Stadt Veteriner Bölümü kurallarına uygun olarak yürütülmüştür. 1.. Donanım ve Yazılım Kurulumu <ol><li> İki foton mikroskop tarama kurulumu: <ol><li> Bir aydınlatma kaynağı (darbe genişliği &lt;120 FSEC) gibi darbeli bir kızılötesi lazer kullanın. </li><li> . 8 veya 12 kHz rezonans tarayıcı ve standart bir galvanometre Not oluşan bir tarama kafa kullanın: Bu 750 x 400 piksel çözünürlükte 40 veya 60 Hz kare hızlarını mümkün kılar. Yüksek kare hızı, beyin hareketini kaynaklı görüntü bozulmaları en aza indirmek için önemlidir. Ayrıca, hızlı rezonans tarama daha yüksek bir sinyal verim sonuçları ve azaltır 16 ve fototoksisite photobleaching. </li><li> Birden fazla derinliklerde acquire zaman serpiştirmeli görüntüleri sırayla bir Piezo-elektrik yüksek hız z-step kullanın Not:. Bu isteğe ve kare hızı pahasına veri verimi artırmak için kullanılır. </li><li> Am kullanındokuya lazer maruziyeti azaltmak için ekanik blanker. Rezonant tarayıcının genliği bağlı olarak boşaltıcısı genişliğini ayarlamak Not:. Nedeniyle bir rezonant tarayıcının tarama yolunun sinüzoidal doğasına, lazer ışını tarama dönüş noktalarında nispeten yavaş hareket eder. Lazere maruz kalmanın büyük olduğu, bu dönüş noktalarında dokusunun hasar görmesini önlemek için, mekanik blanker lazer ışını tarama durur ve boru lens arasında odak düzlemi sokulur. </li><li> . Veri toplama için bir alan programlanabilir geçit dizisi (FPGA) Not ile birlikte yüksek hızlı sayısallaştırıcıya (800 MHz) kullanın: FPGA yüksek geçiren filtreler ve piksel içine PMT sinyal kutuları. Bir band geçiren filtre PMT amplifikatör sonucu FPGA ve etkili low-pass filtre üzerinde yüksek geçiren filtre kombinasyonu kabaca lazer (80 MHz) ve tekrarlama oranı etrafında merkezli. Örnek FPGA kod, ek olarak sağlanır. </li></ol></li><li> Dombeck ve meslektaşları tasarıma dayanan hava destekli koşu bandı kurulum 2 <ol><li> En az 10 mm iç çapa sahip bir hava besleme tüpü kullanılarak bir hava besleme hattına topu tutucu bağlayın. Top tutucu hava besleme girişinin kesite üst düzeye çıkarmak ve ana hava kaynağı ve top tutucu Not arasında boru bol miktarda yer:. Artan kesiti ve hava besleme boru artan uzunlukta ses oluşumunu azaltır. </li><li> Özel tasarlanmış ve 3D baskılı top tutucu bir polistiren köpük topu (20 cm çapında) yerleştirin. </li><li> Davranışsal paradigma sadece ileri (ve geri) hareket gerektiriyorsa, topun tarafında bir iğne (örneğin 19 G derialtı iğne) ekleyerek yatay (pitch) ekseni topun hareketini kısıtlamak Not:. Genellikle hayvanlar uyum Bu azaltılmış dönme paradigmada çok daha hızlı kurulum. </li><li> Bir veya iki optik bilgisayar fareleri kullanarak topu takip hareketisırasıyla, yaklaşık iki hareket veya her üç eksen tespit etmek Not:. bilgisayar fareleri ideal görüntüleme ile en az müdahale için bir kızılötesi diyot ile çalışmalıdır. </li></ol></li><li> Sanal gerçeklik ortamında kurulum <ol><li> Sanal gerçeklik ortamı hazırlayın Not:. Panda3D, serbestçe kullanılabilir bir oyun motoru dayalı bir örnek ortamı, ek olarak verilmiştir. Sanal ortamda nesneleri Wings3D, bir açık kaynak 3D modeler kullanılarak üretilir. Örnek program bir veri toplama kartı konum bilgilerini okur ve sanal ortamda hareketin içine bu çevirir. Kod aynı zamanda toroidal ekrana yansıtılan edilmesi için gerekli ortam doğrusal olmayan dönüşümü gerçekleştirir. Toroidal Ekranın ayrıntılı yapısı başka 14,17 tarif edilmiştir. </li><li> Sanal ortam göstermek için LED projektörleri veya LED aydınlatmalı bilgisayar ekranları kullanın. Bir yolluk CIR entegre. görüntüleme Not sırasında LED&#39;ler hızlı titremesi için CUIT: görsel uyarılma sırasında iki foton görüntüleme An doğasında sorun hedefi koruyucu azaltılabilir görsel uyarı sistemi kaynaklı ışık sızıntısı olduğunu. Görüntülemenin sırasında görsel uyarı için kullanılan LED arenalarda ile yapılır Ancak, görsel uyarı sistemi ışık sızıntısı tamamen, (veri alınan değil) rezonans tarayıcı dönüş noktalarına projektörün ışık çıkışını eşitleyerek kaldırılmış olabilir Drosophila 18. Bu görsel uyarı ve veri toplama bir etkili yüksek hızlı arda (bakınız Şekil 2) ile sonuçlanır. Titrek frekans (24 kHz) titreşen artık hayvan tarafından algılandığı yukarıda, titreme füzyon eşiğinin üzerinde büyüklükte emir. Ticari bir LED projektöre Bu modifikasyon bir elektronik devre diyagramıdır, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. </li></ol></li><li> Delikanlıil izleme <ol><li> Öğrenci konum takibi için bir CMOS tabanlı bir video kamera (30 fps) kullanın. Kamera kızılötesi bir engelleme filtresi içermediğinden emin olun Not:. Öğrenci nedeniyle gözünden çıkan iki foton uyarma lazer başıboş ışık kayıtları sırasında yüksek kontrast de görülebilir. Öğrenci konumu ve çapı Sakatani ve Isa 19 tasarıma dayanan özel programlanmış yazılımı kullanarak gerçek zamanlı olarak ayıklanır. </li></ol></li></ol> 2. Genetik Kalsiyum Göstergesi ve Pencere İmplant Enjeksiyon Daha önce Aşağıdaki ilavelerle anlatıldığı gibi bir kalsiyum göstergesi 20 ve kafatası pencere 21&#39;in implantasyonu enjeksiyonu gerçekleştirilir: <ol><li> Virüs çözeltisi ile geri dolduruldu ve bir basınç enjeksiyon sistemine bağlı bir cam enjeksiyon pipeti kullanarak, ilgi konusu virüs bölgesine enjekte edilir. Pipet bağlı basıncını ayarlamak iç-çapı, genellikle yakl. 70-140 mbar, 1-2 dakikalık bir süre boyunca virüs solüsyonu yaklaşık 100 nl enjekte etmek. Düşük frekanslı (2 Hz 0,05 saniye darbeler) iletilen düşük hacimli enjeksiyon darbeler enjeksiyon sırasında pipet boyunca virüsün taşmasını önlemek için kullanılmalıdır Not:. Enjeksiyon hacmi izlemek amacıyla, küçük bir pipet ile işaretlenebilir , stereo bir mikroskop altında eşit aralıklı, belli uzunlukta (örneğin 0.5 mm). Çizgiler arasında menisk hacmi daha sonra, enjekte edilen hacmin tahmin etmek için de kullanılabilir. </li><li> Birkaç hafta sonra enjeksiyon araçlan, bu, yaklaşık 500 um bir çapa sahip yoğun işaretli hücrelerin bir bolus ile sonuçlanmalıdır. Ilgilenilen bölgesinde GECI ifade etkinliği Geci ve promoter kombinasyonunun seçimi, hem de bulaşıcı titresi ve kullanılan rekombinant AAV serotip bağlıdır Not:. Temsili bir örnek olarak, enjeksiyon ile AAV2/1-EF1α-GCaMP5 viral tittatmin edici ifadesinde bir fare sonuç primer görsel korteks içine 8 x 10 12 GC / ml er az iki hafta enjeksiyon (Şekil 1) sonrası. </li><li> Kafa çubuğu fare görüş alanını engellememelidir, ama davranışı sırasında sabit görüntüleme için yetecek kadar sert olmalıdır. Bu genellikle Baş çubuğunun her iki tarafında iki noktadan bağlanmaktadır (Şekil 1 &#39;e bakın). Sıkıca kafatası kafa çubuğunu takmak için, kafa çubuğu eklenecektir maruz kafatası alanını maksimize etmek ve kuru olduğundan emin olun. Buna ek olarak, bir neşter ya da bir şırınga kullanılarak, bu şekilde yapıştırılması için yüzey alanını artırmak yüzeysel olukları oluşturmak için kafatası çizik. Diş çimento ile baş bar takmadan önce siyanoakrilat doku yapıştırıcısı ile kemik örtün. </li></ol> 3. Deneysel Prosedür <ol><li> Virüs enjeksiyonunu takiben iki üç hafta, epi altında netlik ve ifade için kafa penceresi implant kontrolfloresan aydınlatma. Yüzeysel kan damarlarının açıkça görülebilir ve keskin tanımlanmış sınırlar pencere implant (bkz. Şekil 1) görüntüleme için uygun olduğunu iyi bir göstergesidir. </li><li> Ölçün ve örnek 50 mW altındaki bir değere lazer gücü ayarlar. </li><li> Küresel koşu bandı için hava akışına açın. </li><li> Mikroskop altında kafası tespit için, kısaca stresi azaltmak için izofluran ile hayvan uyutmak. Izofluran anestezi kabın içine hayvan koyun ve hayvan durur (yaklaşık 10 sn) hareketli kadar bekleyin. Hayvan çıkarın ve hemen baş mikroskop altında bunu düzeltmek. </li><li> Hala hayvana erişim sağlamak için, hayvana mümkün olduğu kadar yakın bir görsel görüntüleme sistemi yerleştirin. Daha az görsel iletişim hayvan deneyi ile, daha az hayvan Deneyin ilk aşamasında olacak vurgulamıştır. </li><li> Kafa penceresi implant toz ve kir serbest olduğundan emin olun. Su ile temizleyinizGerekirse. </li><li> Kranial pencere ve su daldırma hedefi arasında daldırma ortamı olarak açık ultrason jeli uygulayın. Bu durum, su buharlaşma veya sızıntı yavaş görüntü bozulması sorunlarını çözer ve suyu tutmak için kafa çubuğunda bir koni monte etmek ihtiyacını hafifletir Not:. Santrifüj jel önce tüm hava kabarcıklarını çıkarmak ve herhangi bir hava yaratmak için değil dikkat çekmek için kullanım Jelin uygulaması sırasında kabarcıklar. Hava kabarcıkları ciddi görüntü kalitesini düşürebilir. </li><li> Işık koruma için objektif ve baş bar etrafında siyah bir parça bant sarın. </li><li> Nihai konumuna sanal ortamda arenaya taşımak ve öğrenci takibi için video kamera ayarlayın. </li><li> Deney sırasında kullanılan tarama genlik maç için lazer Blanker ayarlayın. </li><li> Veri kayıt başlayın. </li></ol>

<ol><li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Miniature+Head-Mounted+Two-Photon+MicroscopeHigh-Resolution+Brain+Imaging+in+Freely+Moving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).</li>
<li>Huber, D., Gutnisky, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+mismatch+signals+in+primary+visual+cortex+of+the+behaving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse.</a> Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., Chen, T. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., Araki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li>
<li>Mittmann, W., Wallace, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).</li>
<li>Katona, G., Szalay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li>
<li>Mank, M., Santos, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Margolis, D. J., Lütcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+cortical+population+activity+imaged+throughout+long-term+sensory+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation.</a> Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).</li>
<li>Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li>
<li>Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+are+able+to+navigate+in+virtual+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rats are able to navigate in virtual environments.</a> J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching).</a> Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li>
<li>Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+Reality+for+Mice%2C+mousevr.blogspot.com%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com.</a> Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).</li>
<li>Sakatani, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+spontaneous+saccade-like+rapid+eye+movements+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice.</a> Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).</li>
<li>Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+2-photon+calcium+imaging+in+layer+2%2F3+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice.</a> J. Vis. Exp. (13), (2008).</li>
<li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+spatial+navigation+in+the+medial+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Davranış iki foton görüntüleme başarısı için en önemli iki yolla preparatın stabilitesi olan: <ol><li> Gün sonra pencere implantasyon boyunca, doku iltihaplı tepkiler granülasyon doku ve engel ya da görüntülemesi önleyecektir kıkırdak oluşumunun geliştirilmesi yol açabilir. </li><li> Deney sırasında beyin sinirsel aktivite ile ilgili floresan sinyalini bozarak dan hareket eserler önlemek için yeterince kararlı olmak zorundadır. </li></ol> Kranial pencere implantasyon cerrahisi çabuk beyne müm...

(Genetik GCaMP5 7 ya da R-geco 8 ya da OGB veya Fluo4 gibi sentetik boyalar gibi kodlanmış) kalsiyum göstergeleri iki foton görüntüleme farelere 1-6 davranmak nöronal etkinliği ölçmek için bir güçlü bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Yaklaşık 800 um beyin yüzeyinden 9,10 altına kadar yakın bir hareket potansiyeli çözünürlükte hücre yüzlerce aktivitesinin aynı anda ölçüm sağlar. Ayrıca, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GeCIS) kullanılarak nöron faaliyeti kronik 5,11,12 ölçülebilir ve genetik olarak tanımlanmış hücre tiplerinde 13. Hep birlikte, bu yöntem, in vivo nöronal hesaplama çalışmada yeni olanaklar bir çok açmak zamansal ve uzamsal çözünürlük derecesi sağlar. Cerrahi müdahale görüntüleme için fare beyin ortaya çıkarmak ve etiketlemek için gereklidir. Hücreler tipik olarak, bir rekombinant adeno-ilişkili Vir kullanılarak transfekte edilir<html> GECI teslimat ve bir kafatası pencere için bize (AAV) sistemi beyne optik erişmek için enjeksiyon sitesi üzerinden implante edilir. Bir kafa çubuğu daha sonra iki foton mikroskop altında kafa sabitleme için kafatasına bağlı. Uyanık görüntüleme ile sorunların çoğu hazırlanmasında istikrarsızlıklar kaynaklanır olarak bu adımların tasarım ve uygulama önemlidir. İdeal olarak burada tarif edilen ameliyat sonrası birkaç aya kadar kronik görüntüleme için izin vermelidir. Iki foton görüntüleme sırasında görsel olarak yönlendirilen davranışını etkinleştirmek için, kafa sabit fare bir sanal gerçeklik ortamı gezinmek için kullanabileceğiniz bir hava destekli küresel koşu bandı, oturur. Yürüme bandı üzerinde fare hareket fare 14,15 çevreleyen toroidal bir ekran üzerinde görüntülenen sanal ortamda hareketine bağlıdır. Bu tür hareketlilik, görsel uyaran ve gözbebeği konumunda gibi davranışsal değişkenler 6 kaydedilebilir. t &quot;&gt; bir sanal gerçeklik ortamı keşfetmek farelerde kronik iki foton görüntüleme dahil prosedürlerini açıklar hitaben önemli noktalar vardır:. hareket eserler azalma, hafif sızıntı azaltılması, eş zamanlı olarak kaydedilen hücrelerinin sayısının maksimizasyonu ve minimizasyonu fotoğraf hasar. Ayrıca hava destekli koşu bandı, öğrenci takibi, ve sanal gerçeklik ortamı kurma hakkında ayrıntılı bilgi vermektedir. Burada anlatılan prosedürler davranışsal paradigmalar bir potansiyel çeşitli kafa sabit farelerde floresan etiketli hücre popülasyonlarının görüntüleme için kullanılabilir .

<table><tbody><tr><td>Kapak kaymaları (çap = 3-5 mm)</td><td>Menzel</td><td></td><td>pencere implantı</td></tr><tr><td>InSight DeepSee lazer</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>mikroskobu</td></tr><tr><td>12 kHz Rezonans tarayıcı</td><td>Cambridge Technology</td><td>G1-003-30026</td><td>mikroskop</td></tr><tr><td>Galvometer</td><td>Cambridge Technology</td><td>G6215H</td><td>mikroskop</td></tr><tr><td>Sayısallaştırıcı</td><td>National Instruments</td><td>NI 5772</td><td>mikroskop</td></tr><tr><td>FPGA</td><td>Ulusal Aletler</td><td>PXIe 7965R</td><td>mikroskop</td></tr><tr><td>Edinme kartı</td><td>Ulusal Aletler</td><td>PCIe 6363</td><td>mikroskop</td></tr><tr><td>Emisyon filtresi 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td>mikroskop</td></tr><tr><td>Piezo-elektrik z-sürücü</td><td>Physikinstrumente</td><td>P-726.1CD</td><td>mikroskop</td></tr><tr><td>Piezo-elektrik için Kontrol Cihazı sürücü</td><td>Physikinstrumente</td><td>E665 LVPZT</td><td>mikroskop</td></tr><tr><td>Objektif 16X, 0.8NA</td><td>Nikon</td><td>CFI75</td><td>mikroskop</td></tr><tr><td>Akım amplifikatörü</td><td>Femto</td><td>DHPCA-100</td><td>mikroskop</td></tr><tr><td>Fotoçoğaltıcı tüp</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>mikroskop</td></tr><tr><td>IR filtresiz USB Kamera</td><td>Görüntüleme Kaynağı</td><td>DMK22BUC03</td><td>öğrenci takibi</td></tr><tr><td>Objektif 50 mm</td><td>ImagingSource</td><td>M5018-MP</td><td>göz bebeği takibi</td></tr><tr><td>Makro adaptör halkaları</td><td>ImagingSource</td><td>LAexSet</td><td>göz bebeği takibi</td></tr><tr><td>Optik bilgisayar faresi</td><td>Logitech</td><td>G500</td><td>hareket takibi</td></tr><tr><td>Strafor top 20 cm</td><td>örneğin idee-shop.de</td><td>08797.00.15</td><td>sanal ortam</td></tr><tr><td>LED projektör</td><td>Samsung</td><td>SP-F10M</td><td>sanal çevre</td></tr><tr><td>Edinme kartı</td><td>National Instruments</td><td>NI 6009</td><td>sanal ortam</td></tr><tr><td>Panda3D oyun motoru</td><td></td><td><a href="http://www.panda3d.org/">www.panda3d.org</a></td><td>sanal ortam</td></tr><tr><td>Python için Numpy</td><td></td> kitaplığı<td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>sanal ortam</td></tr><tr><td>Scipy Python</td><td></td> kitaplığı<td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>sanal ortam</td></tr><tr><td>NI-DAQmx sürücüsü</td><td>National Instruments</td><td><a href="http://www.ni.com/">www.ni.com</a></td><td>sanal ortam</td></tr><tr><td>Ultrason jeli</td><td>Dahlhausen</td><td>5701.0342.10</td><td>görüntüleme</td></tr></tbody></table>

sanal gerçeklik Çevre gezinme farelerde iki foton kalsiyum görüntüleme

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

Bu davranış 1-6 işlemleri sırasında genetik olarak tanımlanmış olan hücrelerin faaliyetinin kronik ölçümü için izin verdiği Son yıllarda, iki foton görüntüleme, nörolojik çok değerli bir araç haline gelmiştir. Burada hayvan bir sanal gerçeklik ortamı gider iken fare kortekste iki foton görüntüleme gerçekleştirmek için yöntemleri tarif. Biz bir aydınlık sanal ortamda bir davrandığını hayvan görüntüleme için anahtar deneysel prosedürlerin yönlerine odaklanmak. Burada adres vardır, bu deney düzeneği ortaya çıkan temel sorunları:, beyin hareket ilgili eserler minimize sanal gerçeklik projeksiyon sistemi ışık sızıntısı en aza indirmek, ve lazer kaynaklı doku hasarı en aza indirmek. Biz de sanal gerçeklik ortamı kontrol etmek ve öğrenci izleme yapmak için örnek yazılım sağlarlar. Bu işlemler ve kaynak ile bu fareler davranmak kullanılmak için geleneksel bir iki-fotonlu mikroskop dönüştürmek mümkün olmalıdır.

Bir Geci ile etiketlenmiş, hücre popülasyonlarının iki foton kalsiyum görüntülemede görüntü kalitesi, büyük ölçüde kafa penceresi implantın kalitesine bağlıdır. Virüs enjeksiyondan kranial penceresini aşağıdaki iki hafta netlik için kontrol edilmelidir. Herhangi bir granülasyon dokusu veya kemik yeniden büyümesini görebilir (Şekil 1A) olmalıdır. Ayrıca, yüzeysel kan damarlarının model değişmeden kalmalıdır ve damar sınırlarının keskin tanımlanmalıdır. Aynı zamanda, GECI sentezleme de kontrol edilebilir....

Burada bir sanal gerçeklik ortamında davranış sırasında fare korteksin iki foton görüntüleme katılan deneysel işlemleri.

Sanal Gerçeklik Çevre gezinme Farelerde iki foton Kalsiyum Görüntüleme

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farelerde kronik iki foton görüntülemenin temel yönlerini gerçekleştirmek ve sanal gerçeklik ortamını keşfetmektir. Bu, davranan farelerde hızlı ve kararlı görüntüleme için iki fotonlu bir mikroskobun modifiye edilmesiyle elde edilir. Daha sonra, hareket takibi yapabilen hava destekli bir koşu bandı kurulur.Daha sonra ışık sızıntısını en aza indirmek için mikroskopla senkronize edilmiş bir LED projektör kullanan bir sanal gerçeklik ortamı hazırlanır. Sonuç olarak, hareket artefaktlarının azalması, ışık sızıntısının azalması ve foto hasar kenarının en aza indirilmesi nedeniyle iyi ve stabil görüntü kayıtları elde edilir. Bu yöntem, sanal gerçeklik ortamında gezinme sırasında nöroaktiviteyi ölçmek için kullanılabilse de, görsel uyarım gerektiren çok çeşitli farklı davranışsal paradigmalara da kolayca uyarlanabilir.Tüm hayvan prosedürleri, Kanton Basil sta'nın veterinerlik departmanının yönergelerine uygun olarak onaylandı ve gerçekleştirildi. Bu deneylerde kullanılan iki foton mikroskobu, sekiz veya 12 kilohertz rezonans tarayıcı ve standart bir galvanometreden oluşan bir tarama kafasından oluşur. Bu, 750 çarpı 400 pikselde 40 veya 60 hertz kare hızlarını mümkün kılar ve beyin hareketinin neden olduğu görüntü bozulmasını, foto ağartmayı ve fototoksisiteyi azaltır.Piezoelektrik yüksek hızlı bir Z stepper, birden çok derinlikte zaman aralıklı görüntüleri sırayla elde etmek için kullanılır. Tarama yolunun geri dönüş noktalarında dokuya lazer maruziyetini azaltmak için mekanik bir köreltici kullanılır, kördürücünün genişliğini ayarlamak için ayarlanabilir olması gerekir. Rezonans tarayıcının genliğine bağlı olarak, koşu bandının bilye tutucusuna en az 10 milimetre iç çapa sahip bir hava besleme tüpü bağlayın ve gürültüyü azaltmak için ana hava beslemesi ile bilye tutucu arasına bir BLE miktarda boru yerleştirin.Özel olarak tasarlanmış ve 3D baskılı bir top tutucuya 20 santimetre çapında bir polistiren köpük top yerleştirin. Davranışsal paradigma yalnızca ileri ve geri hareket gerektiriyorsa, topun yan tarafına 19 gauge hipodermik iğne gibi bir pim yerleştirin. Topun yatay eksendeki hareketini kısıtlamak için, topun sırasıyla iki veya üç eksen etrafındaki hareketini izlemek için bir veya iki optik bilgisayar faresi kullanın.Sanal gerçeklik ortamını hazırlamak için, ekran için LED projektörler veya LED arkadan aydınlatmalı bilgisayar ekranları kullanın. Görüntüleme sırasında LED'lerin hızlı bir şekilde titremesi için bir geçit devresi entegre edin. 24 kilohertz titreme frekansı, titreme füzyon eşiğinin üzerindeki büyüklük sıralarıdır ve bunun üzerinde titreme artık hayvan tarafından algılanmaz.Projektörün ışık çıkışını öğrenci takibi için rezonans tarayıcının geri dönüş noktalarıyla senkronize etmek için tam titreme frekansını ve görev döngüsünü ayarlayın, CMOS tabanlı bir video kamera kullanın. Kameranın kızılötesi engelleme filtresi içermediğinden emin olun. Genetik kalsiyum indikatörünü enjekte ettikten ve bir kraniyal pencere implante ettikten yaklaşık iki ila üç hafta sonra, kraniyal pencere implantını netlik ve ifade açısından kontrol etmek için epi floresan aydınlatma kullanın.Açıkça görülebilir ve keskin bir şekilde tanımlanmış. Yüzeysel kan damarlarının sınırları, pencere implantının bir ila iki gün sonra görüntüleme için uygun olduğunun iyi bir göstergesidir. İki foton deneyini gerçekleştirmek için, lazer gücünü numunede 50 miliwatt'ın altında bir değere ölçün ve ayarlayın.Ardından küresel koşu bandına giden hava akışını açın. Sonraki kafa, hayvanı küresel koşu bandına sabitleyin. İlk birkaç kez fare kafası sabitlenir.Bu işlem, hayvanı izo flor ile kısa bir süre sakinleştirerek kolaylaştırılabilir. Hayvan prosedüre alıştıktan sonra, montaj normal olarak sedasyon olmadan gerçekleştirilebilir. Bu prosedür sırasında hayvan üzerindeki stresi en aza indirmenin kritik olduğunu unutmayın.Ardından, hayvana erişime izin vermek için görsel görüntüleme sistemini hayvana mümkün olduğunca yakın konumlandırın. Kraniyal pencere implantının kir içermediğinden emin olun ve gerekirse suyla temizleyin, ışık koruması için kafatası penceresi ile suya daldırma hedefi arasına daldırma ortamı olarak şeffaf ultrason jeli uygulayın. Objektifin ve baş çubuğunun etrafına bir parça siyah bant sarın.Sanal ortam arenasını son konumuna getirin ve video kamerayı öğrenci takibi için ayarlayın. Son olarak, lazer körelticiyi deney sırasında kullanılan tarama genliğiyle eşleşecek şekilde ayarlayın ve deneyler tamamlandığında verileri kaydetmeye başlayın. Hayvanı kurumunuzun yönergelerine göre ötenazi yapın.Genetik bir kalsiyum indikatörü ile etiketlenmiş hücre popülasyonlarının iki fotonlu kalsiyum görüntülemesindeki görüntü kalitesi, büyük ölçüde burada gösterildiği gibi kraniyal pencere implantının kalitesine bağlıdır, virüs enjeksiyonundan sonra kraniyal pencereyi netlik açısından kontrol ederken, granülasyon dokusu veya kemik büyümesi görünmemelidir. Ayrıca, yüzeysel kan damarlarının paterni değişmeden kalmalı ve damar sisteminin sınırları keskin bir şekilde tanımlanmalıdır. Aynı zamanda, etiketli hücrelerin BOI'si bir epi floresan mikroskobu altında açıkça görülebilmelidir.İdeal olarak, hazırlık, farenin hareketinden kaynaklanan iki foton görüntüsünün bozulmaları, çerçeve kaydından sonra görüntüde görünmeyecek şekilde yeterince kararlıdır. Görsel stimülasyon sisteminden gelen ışık sızıntısı, projektörün ışık çıkışının rezonans tarayıcının geri dönüş noktalarına doğru şekilde zamanlanmasıyla tamamen ortadan kaldırılabilir. Veriler elde edilmediğinde, ışık kaynağının titreme frekansı, tarama frekansının iki katı olmalıdır.Bu örnekte, görsel stimülasyon sırasında turuncu kutularda gösterilen ışık sızıntısının etkisini göstermek için karartıcı çıkarılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, görüntülemede, farelerde davranmada, sanal gerçeklik ortamında gezinmede iki yönlü performans göstermeyi iyi anlamış olmalısınız. Görüntüleme ve sanal gerçeklik sistemlerini burada anlatıldığı gibi kurmanın yanı sıra, bu deneylerde başarının anahtarı kafatası penceresi implant tekniğine hakim olmaktır.Temiz bir implant, yüksek kaliteli görüntüler ve stabil kayıtlar için bir ön koşuldur.

two-photon-calcium-imaging-mice-navigating-virtual-reality

Research

JoVE Journal

Behavior

Davranış

Neokorteks mikrodevreler ağ dinamiklerini anlamak için, aynı anda çok sayıda nöron aktivitesini kaydetmek için esastır. In vivo iki foton kalsiyum görüntüleme, bir tek hücre çözünürlük ile yoğun bir nöronal nüfusun faaliyet kaydetmenize olanak sağlayan tek yöntem.

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

Source: Maruoka, H., et. al. uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi. J. Vis. Exp. (2022) Bu video, görsel stimülasyon sırasında uyanık bir farede nöronal aktiviteyi ve mikroglial dinamikleri görüntülemek için iki fotonlu bir mikroskopi prosedürünü göstermektedir. kalsiyum geçişleri ve hücresel etkileşimler.

Uyanık Bir Farede Mikroglial Dinamiklerin ve Nöronal Aktivitenin Eş Zamanlı Görüntülenmesi

Kaynak: Lee, H. et. al., Serbestçe Davranan Farenin Amigdalasında Başa Monte Minyatür Mikroskopla Başarılı İn vivo Kalsiyum Görüntüleme. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, gradyan kırılma indisi veya GRIN lens ve minyatür bir mikroskop kullanılarak bir farede in vivo kalsiyum görüntülemeyi göstermektedir. Kurulum, sürtünmesiz bir mobil kafes sistemi içinde kafa sabitlemesini birleştirir, nöronları uyarır ve kalsiyum iyonu akışını tetikler. GRIN lens, beyindeki kalsiyum sinyalini yakalayarak nöronal...

Serbestçe Hareket Eden Bir Farede Gerçek Zamanlı Mikroendoskopik Kalsiyum Görüntüleme

Kaynak: Thapa, R., et. al., Derin Beyin için Stereotaksik Viral Enjeksiyon ve Gradyan İndeksli Lens İmplantasyonu In Vivo Kalsiyum Görüntüleme.  J. Vis. Uzm. (2021)Video, transdüksiyonlu bir farede bir miniskop kullanarak nöronal aktiviteyi davranışla ilişkilendiren gerçek zamanlı kalsiyum görüntülemeyi göstermektedir.

Bir farenin gerçek zamanlı kalsiyum görüntülemesi Bir miniskop kullanarak medial prefrontal korteks

Yetişkin farenin beyin ata tarafından beyin atmasını ortaya çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Minyatür mikroskoplu gradyan-kırılma indeksi lens kullanılarak, in vivo zeytin nöral somata aktivitesini incelemek için kalsiyum görüntüleme kullanılabilir.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Miniskop in vivo kalsiyum görüntüleme, serbestçe davranan farelerde nöronal dinamikleri ve mikro devreleri incelemek için güçlü bir tekniktir. Bu protokol, bir miniskop kullanarak iyi in vivo kalsiyum görüntüleme elde etmek için beyin ameliyatları yapmayı açıklar.

Derin Beyin In Vivo Kalsiyum Görüntüleme için Stereotaksik Viral Enjeksiyon ve Degrade İndeks Lens İmplantasyonu

Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Mevcut protokol, gıda sargısı, şeffaf silikon ve kapak camı kullanarak büyük (6 x 3 mm2) bir kafatası penceresi yapmayı açıklamaktadır. Bu kafatası penceresi, aynı farede in vivo geniş alan ve iki fotonlu kalsiyum görüntüleme deneylerine izin verir.

İn Vivo Büyük Bir Kraniyal Pencere Kullanarak Bir Fareden Geniş Alan ve İki Foton Kalsiyum Görüntüleme

Burada, sanal gerçeklik (VR) kullanarak fare uzamsal öğrenimini araştırmak için basitleştirilmiş bir açık kaynaklı donanım ve yazılım kurulumu sunuyoruz. Bu sistem, bir mikrodenetleyici ağı ve kullanımı kolay bir Python grafik yazılım paketi çalıştıran tek kartlı bir bilgisayar kullanarak bir tekerlek üzerinde çalışan kafası kısıtlanmış bir fareye sanal bir doğrusal iz görüntüler.

Kafası kısıtlanmış farelerde uzamsal öğrenmenin ölçülmesi için açık kaynaklı bir sanal gerçeklik sistemi

Bu protokol, vahşi tip farelerde korteksi bozulmadan bırakırken iki foton mikroskobu ile tek nöron aktivitesinin görüntülenmesi ve kısmi korteks mutant farelerde geniş alan mikroskobu ile tüm SC'nin görüntülenmesi dahil olmak üzere, uyanık farelerin superior colliculus'unda (SC) kalsiyum yanıtlarını görüntüleme prosedürünü detaylandırır.

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

Bir kafa plakası ve hem tek hem de iki fotonlu mikroskoplarla uyumlu bir optik tasarımla entegre edildiğinde, mikroprizma mercek, kafa sabit durumlarda iyi kontrol edilen deneyler veya serbestçe hareket eden hayvanlarda doğal davranışsal görevler dahil olmak üzere çeşitli koşullar altında dikey bir sütundaki nöral tepkileri ölçmede önemli bir avantaj sunar.

Serbest Hareket Eden ve Kafası Sabit Hayvanlarda Mikroprizmalar Kullanılarak Tanımlanmış Nöral Popülasyonların Uzun Süreli Görüntülenmesi

Öğrenin, sanal gerçeklik ortamında gezinen farelerde kronik iki foton kalsiyum görüntüleme yöntemini. Hareket artefaktlarını azaltarak yüksek kaliteli nöroaktivite kayıtları elde edin ve davranışsal nörobilim çalışmalarınızı geliştirin.

Sanal Gerçeklik Çevre gezinme Farelerde iki foton Kalsiyum Görüntüleme

Daha fazla video keşfet