Mikrodalga destekli Poli işlevselleştirilmesi (etilen glikol) ve zincir polimerizasyonu ve Hidrojel formasyonunda kullanılan On-reçine Peptides

Bu prosedürün genel amacı, müteakip zincir polimerizasyonları ve hidrojel sentezi için polietilen glikol ve peptitleri metamfetamin akrilat grupları ile işlevselleştirmektir. Bu, önce metamfetamin akrilik anhidrit ve BM işlevselleştirilmiş öncüsünün bir parıldama şişesinde birleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, peg veya peptidi işlevsel hale getirmek için mikrodalga enerjisini kullanmaktır.

Daha sonra, PEG DM kloro metan içinde çözülür veya peptit reçineden ayrılır. Ve tüm yan zincir koruma grupları asit bazlı bir kokteylde çıkarılır. Son adım, PEG DM veya metamfetamin akrilamid işlevselleştirilmiş peptidi eter içinde çökeltmektir.

Sonuç olarak, peg veya peptit makrosunun başarılı bir şekilde işlevselleştirilmesini göstermek için proton, NMR veya Maldi uçuş süresi kütle spektrometresi kullanılır. Merhaba, benim adım Amy Van Hove. Rochester Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği bölümünde doktora öğrencisiyim.

Bu tekniğin, PEG'nin metamfetamin akrilik florür ile reaksiyona sokulması gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, reaksiyonun önemli ölçüde daha hızlı ve daha çevre dostu olmasıdır. Merhaba, benim adım Brandon Wilson. Rochester Üniversitesi'nde kimya mühendisliği lisans öğrencisiyim.

Bu yöntem, hidrojellerin peg dimetil kullanılarak nasıl üretildiği, moleküllerdeki terapötik hücrelerin iletimini kontrol etmek için kullanılabileceği gibi biyomalzemeler alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Merhaba, ben Danielle Benoit, Rochester Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nde yardımcı doçentim. Bu tekniğin sonuçları, sentezlenen bileşikler hücre ve ilaç dağıtım uygulamaları için kullanılabildiğinden, çeşitli hastalıklar için tedaviler geliştirmek içindir.

Bu işleme başlamadan önce, büyük bir peynir altı suyu teknesinde su ile kirlenmeyi önlemek için gerekli cam malzemeleri bir saat fırında kuruttu. Moleküler ağırlığı 1000 ila 100.000 dalton arasında olan beş gram peg çıkarın. Varsa, plastik parçayı kimyasal başlıktaki bir parıldama şişesinin kapağından çıkarın.

10 molar fazla meth akrilik anhidriti yırtılmış bir sintilasyon şişesine dağıtın. Ardından şişeye PEG ekleyin. Ardından, kapağı şişenin üzerine gevşek bir şekilde çevirin ve şişeyi mikrodalgaya yerleştirin.

Isıya dayanıklı eldivenler giyerek mikrodalgayı maksimum güçte beş dakikaya ayarlayın. Şişeyi her 30 saniyede bir mikrodalgadan çıkarın. Ardından kapağı tamamen sıkın ve numuneyi 30 saniye boyunca girdaplayın.

Şişeyi mikrodalgaya geri koymadan önce kapağı gevşetin. Çözelti tam beş dakika boyunca mikrodalgada kalana kadar bu adımları tekrarlayın. Şişeyi mikrodalgadan çıkardıktan sonra kapağı gevşetin ve PEG DM'nin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.

Daha sonra PEG DM'yi 10 ila 15 mililitre di kloro metan içinde çözün. PEG DM'yi 20 dakika boyunca 10 x fazla pre datil eter içinde çökeltin. Yedi santimetrelik bir Buckner hunisi ve 500 mililitrelik bir şişe kullanarak.

PEG DM'yi vakumlu filtrasyon ile toplayın. Daha sonra, filtrelenmiş PEG DM'yi, havalandırma için kapaktan delinmiş büyük bir gösterge iğnesi ile 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Tüpü bir vakum odasına yerleştirin ve PEG DM'yi gece boyunca kurutun.

Tüpü vakum odasından çıkardıktan sonra, PEG DM'yi buz gibi soğuk datil eter ile çökelten DI kloro metan çökeltisi içinde kırmızı çözün. Filtrasyon ve toplamayı takiben reaktif olmayan meth akrilik anhidriti çıkarmak için, PEG DM'yi daha önce olduğu gibi bir vakum odasında kurutun. Proton NMR analizi için, bir sintilasyon şişesine yaklaşık 10 miligram PEG DM yerleştirin ve yaklaşık bir mililitre döteryumlu kloroform ekleyin.

Numune çözüldükten sonra temiz bir NMR tüpüne aktarın. Ardından, proton NMR spektrumlarını toplayın ve yeterli veri çözünürlüğü elde etmek için numuneleri oda sıcaklığında en az 64 tarama için çalıştırın. İlgilenilen peptidi katı faz sentezi ile sentezledikten sonra, kullanıma hazır olana kadar DMF'de dört santigrat derecede reçine üzerinde saklayın.

Daha sonra peptit reçinesini, filtre kağıdı ve 250 mililitrelik bir şişe ile yedi santimetrelik bir buckner hunisi kullanarak filtrasyon yoluyla toplayın. Plastik parçayı bir sintilasyon şişesinin kapağından çıkarın ve reçineyi şişeye aktarın. Tek kullanımlık bir pipet kullanarak, reçineyi kaplayacak kadar meth akrilik anhidrit ekleyin Kapağı şişenin üzerine gevşek bir şekilde çevirdikten sonra, mikrodalgaya koyun ve zamanlayıcıyı üç dakikaya ayarlayın.

Maksimum güçte, ısıya dayanıklı eldivenler giyerek, şişeyi her 15 ila 20 saniyede bir mikrodalgadan çıkarın. Kapağı tamamen sıktıktan sonra, numuneyi 15 saniye boyunca vorteksleyin. Şişeyi mikrodalgaya geri koymadan önce kapağı gevşetin.

Çözelti tam üç dakika boyunca mikrodalgada kalana kadar bunları tekrarlayın. Flakon kapağı gevşetildiğinde, az miktarda DMF ve yedi santimetrelik bir buckner hunisi kullanarak peptit çözeltisinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Filtre kağıdı ve 250 mililitrelik bir şişe ile.

Bölünme ve derin koruma için peptit reçinesini şişeden toplayın. Peptit reçinesini, 0.25 milimol arginin içeren peptit için taze bir sintilasyon şişesine aktarın. Her birine 0.25 mililitre tri, ISO propileni, üç altı dioksit, bir sekiz oktanlı diol, tiyol deiyonize su ve 18.0 mililitre TFA ekleyin.

Daha sonra reaksiyon karışımını oda sıcaklığında dört saat boyunca bir laboratuvar deprem döndürücü üzerinde döndürün. Bittiğinde, peptidi 10 x fazla önceden soğutulmuş etil eter içinde çökeltin. Çözeltiyi dört adet 50 mililitrelik konik tüp arasında eşit olarak bölün, santrifüjlemeyi takiben peptidi toplamak için dört numuneyi 3.200 G'de 10 dakika santrifüjleyin, eteri boşaltın, peptidi iki 50 mililitrelik konik tüp arasına bölünmüş 100 mililitre taze etil eter içinde yeniden süspanse edin.

Santrifüjleme işlemini tekrarlayın. Resus, peptidi toplam dört eter yıkaması için iki kez 50 mililitre taze eter içinde askıya alır, son santrifüjleme adımından sonra atık eteri boşaltın ve peptidi gece boyunca vakum altında kurutun. Numuneyi Maldi uçuş süresi analizine hazırlamak için, bir ila iki miligram peptidi 1.5 mililitrelik bir einor tüpüne yerleştirin ve numuneyi bir mililitre maldi çözücü içinde çözün.

Bunu takiben, çoklu çözücü içinde mililitre başına 10 miligramlık bir Alpha Sano dört hidroksi seramik asit matris çözeltisi hazırlayın. Peptit ve matris çözeltilerini, birleşik çözeltinin bir mikrolitresini bire bir oranda, MALDI numune plakası üzerinde üç ayrı konuma birleştirin. Bir ısı tabancası kullanarak lekeleri kurutun.

Daha sonra her bir numuneyi yeniden tespit edin ve kurutun. Son olarak, MALDI uçuş süresi verilerini toplayın ve peptitin uç terminaline meth akrilamid grubunun eklenmesi nedeniyle moleküler ağırlıkta mol başına 68 gramlık bir artışı onaylayın. Burada, bu reaksiyon için mikrodalga destekli yöntem kullanılarak işlevselleştirilmiş iki kilodalton doğrusal PEG DM'nin NMR spektrumu gösterilmektedir.

Proton NMR analizi, terminal metakrilat protonlarının gözlemlenen ve teorik oranından merkezi PEG protonlarına kadar işlevselleştirme yüzdesini hesaplamak için kullanılabilir. Genel işlevselleştirme yüzdesi %91'dir ve bu PEG DM, hidrojel sentezinde kullanım için yeterince işlevselleştirilmiştir. Pep peptitlerinin proton NMR analizinde ortaya çıkan çok sayıda proton tepe noktası nedeniyle işlevselleştirme yüzdesinin hesaplanmasına ilişkin ayrıntılar için metin protokolüne bakın.

Peptit işlevselleştirmesi, maldi uçuş süresi kütle spektrometresi kullanılarak daha kolay araştırılabilir. Bu, peptit GKRG'nin sentezlendiği ve metamfetamin fonksiyonelleştirmesine tabi tutulduğu, peptidin küçük bir kısmının, gözlenen moleküler ağırlık zirvesini gösteren ön işlevselleştirme moleküler ağırlık değerlendirmesi için parçalandığı yerde gösterilmiştir 676 gram mol başına, peptitin beklenen moleküler ağırlığı, peptidin geri kalanı, meth akrilamid işlevselleştirmesinden sonra bölünmeden önce metamfetamin işlevselleştirmesine tabi tutulmuştur. Gözlenen moleküler ağırlık zirvesi, metamfetamin akrilamid işlevselleştirilmiş peptidinin beklenen ağırlığı olan mol başına 744 gramda meydana gelir.

Hem PEG DM'nin hem de metamfetamin işlevselliğini göstermek için akrilamid işlevselleştirilmiş peptitler, PEG hidrojelleri 0.5 milimolar metamfetamin ile ve 0.5 milimolar meth olmadan üretildi. Burada gösterilen akrilamid işlevselleştirilmiş GK, R-G-D-S-G, tek başına peg jelleri ve metamfetamin işlevselleştirilmiş peptit içeren peg jelleri üzerindeki MSC'lerin temsili faz kontrastı ve canlı ölü floresan görüntüleridir. MSC'ler, BM işlevselleştirilmiş peg hidrojellerine yapışamadılar, ancak hücre yapışma peptidi RGD'nin dahil edilmesi üzerine, hidrojel yüzeyine yapışabildiler ve yayılabildiler.

Canlı ölü görüntüleri, tohumlanmış MSC popülasyonunun yaşayabilirliğini temsil etmemektedir. Daha ziyade, floresan görüntülerin, yapışma hücreleri ile hidrojel topolojisindeki küçük varyasyonlar arasında ayrım yapması amaçlanmıştır, bu da tek başına faz kontrastı altında zor olabilir. İlginç bir şekilde, PEG üzerine ekilen yayılmamış hücreler, yalnızca jeller hem kalsiyum hem de AUM Homodimer için pozitif lekelenir, bu da hücrelerin görüntüleme sırasında ölmekte olduğunu gösterir.

PEG hidrojellerinin birçok avantajından biri, peg'in özel yapısını değiştiren oldukça ayarlanabilir yapılarıdır. Hidrojel, araştırmacılara burada gösterildiği gibi elastikiyet modülü gibi özellikler üzerinde yüksek derecede kontrol sağlar. Hem PEG moleküler ağırlığının hem de ağırlık yüzdesinin hidrojel ağ boyutunu, ortaya çıkan hidrojeli, sertliği ve kapsüllenmiş ilaçların salım hızını kontrol ettiği bilinmektedir.

Bu, değişen moleküler ağırlıklı PEG dm'ye sahip hidrojeller üretilerek ve elde edilen hidrojel modülünün ve ağ boyutunun, peg'in moleküler ağırlığını artırarak varsayıldığı gibi araştırılmasıyla gösterilmiştir. Macer, hidrojel ağ boyutunda bir artışa neden oldu ve hidrojel sertliğinde bir azalmaya neden oldu, hidrojel ağ boyutu ve ortaya çıkan jel sertliği de ağırlık değiştirilerek kontrol edilebilir. PEG hidrojellerin yüzdesi değişen ağırlıklarda üretildi.

Doğrusal 10 kilodalton PEG DM yüzdesi ve hidrojel sertliği ve ağ boyutu burada gösterildiği gibi belirlendi, PEG'nin ağırlık yüzdesinin arttırılması, ağ boyutunda önemli bir azalmaya ve hidrojel sertliğinde bir artışa neden olur. Kapsüllenmiş sığır serum albümini içeren hidrojeller, burada gösterildiği gibi değişen moleküler ağırlıklı peg kullanılarak oluşturulmuştur. Sığır serum albümin salınımı, hidrojel içindeki daha büyük ağ boyutunun bir sonucu olarak daha yüksek moleküler ağırlıklı PEG DM kullanılarak oluşturulan hidrojellerden daha hızlı gerçekleşir.

Bu videoyu izledikten sonra, mikrodalga destekli yöntem kullanılarak PEG DME ödülünün nasıl sentezleneceğini ve proton NMR kullanılarak işlevselleştirmenin nasıl değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedüre hakim olduktan sonra, hidrojel bozunmasının hücre fonksiyonunu nasıl etkilediğine dair ek soruları yanıtlamak için hidrolitik bozunur grupların halka açılması da kullanılabilir. Ayrıca, bu tekniğin, metamfetamin akrilamid işlevlerini uç terminal peptit dizilerine seçici olarak dahil etmek için nasıl kullanılabileceğini ve bu işlevselleştirmenin çok zamanlı uçuş kütle spektrometresi kullanılarak nasıl değerlendirileceğini iyi anlamalısınız.

İzlediğiniz için teşekkürler.