Böcek Uçuş Behavior Monitoring için erken Metamorfik Yerleştirme Teknoloji

Merhaba, ben Dr. Albert Bos laboratuvarından Alex Derber. North Carolina State Üniversitesi Elektrik Mühendisliği Bölümü'ndeyim. Bugün, erken metamorfoz aşamalarındaki manica sex'e elektrot implante etmek için yeni bir cerrahi prosedürü uygulamalı olarak göstereceğiz.

Erken Metamorfik ekim teknolojisi olarak adlandırılan bu prosedürde, implante edilen elektrotlar, böceğin pupa metamorfik evresi sırasında dokuya entegre edilir. Bu prosedürün temel avantajı, nöromüsküler doku ile mekanik olarak stabil ve elektriksel olarak güvenilir bir eşleşme sağlaması ve böceğin uçuş nörofizyolojisinin incelenmesine olanak tanımasıdır. Erişkin evrede, IC Mensa yaklaşık 40 gün süren metamorfik bir yaşam döngüsü geçirir.

Mensa yaşam döngüsüne yumurta evresiyle başlar. Yedi ila 10 gün sonra larva yumurtadan çıkar ve üçüncü yıldız larva evresine ulaşır. Toplamda beş yıldız larva evresi vardır ve larvalar bu evrelerin her birinde enerji toplama ve büyüme süreçlerinden geçer.

Beşinci instarda larval evreden beş ila altı gün sonra, böcek erken pupa evresine girer. Pupa evresi boyunca, böcek dokularında kapsamlı bir dejenerasyon ve ardından rejenerasyon gerçekleşir. Yetişkin bir güve olarak çıkışa hazırlanmak için böcek 17 ila 19 gün geçirir.

Erken pupa evresinde, geç pupa evresine girmeden önce ve geç pupa evresi sırasında, pupanın dorsal toraksına cerrahi olarak elektrik iletkenliği olan bir elektrot yerleştiririz. Doku, implante edilen elektrotların etrafında gelişerek bunların böceğin gövdesine sabitlenmesini sağlar. Birkaç gün boyunca pupanın toraksına yerleştirilen elektrotlar, böceğin tüm doku sisteminin yeniden yapılandırılmasından yararlanılarak, final erişkin evresindeki bir güve olarak böceğin gövdesinin bir parçası şeklinde ortaya çıkar.

Metamorfik gelişim sırasında, elektrotlar toraksteki dolaylı uçuş kaslarına implante edilir. Kanat hareketinden dolaylı olarak sorumlu olan bu kas grupları, dorsal ventral ve dorsal longitudinal kaslardır. Burada, kanadın yukarı kalkış hareketinden dolaylı olarak sorumlu olan dorsal ventral kaslara elektrot yerleştirme işlemini göstereceğiz.

Bu yerleştirme ile, hareket sırasında dorsal ventral kaslardan elektromiyogramı kablosuz olarak kaydedeceğiz. Böcek, hareketi uyaran bir LED arenası içerisinde, elektromanyetik olarak levite edilen bir platform tarafından askıya alınmıştır. Erken metamorfoz yerleştirme teknolojisi prosedürü, yerleştirilen elektrotlar ile kayıt cihazları arasında bir arayüz olarak kullanılacak olan bir baskılı devre kartının yapımı ile başlar.

Tel elektrotlar, düz ve esnek bir kablo konnektörüne bağlı olan baskı devre kartı üzerine lehimlenir. Başlamak için, ince uçlu kalıcı bir markör ve makas kullanarak 0,5 x 5 cm² boyutunda bir bakır kaplı laminat parçası ölçün ve kesin. Aynı ince uçlu kalıcı markörü kullanarak, aşındırma maskesi desenleri olarak üç adet 0,1 x 5 cm² boyutunda ped çizin.

Bakır laminat kesiğinin tüm uzunluğu boyunca işaretlemeleri yapmak için cetvel gibi düz bir kenarlı araç kullanın. İşaretlerin belirgin olduğundan ve birbirleriyle örtüşmediğinden emin olun. Eğer işaret çizgileri birbirinin üzerine binerse, elektrotlar kısa devre yapacaktır.

Düz, esnek kablo konnektörü bağlantısı yapılırken kartların kullanılamaz hale gelmemesi için, bakır laminat kesintiyi işaretlerin aşındırılması işlemi amacıyla havalandırmalı bir alana, tercihen çeker ocak altına götürün. Basılı devre kartı aşındırma işlemi toksik olduğundan işlem sırasında dikkatli olun. Yutulması durumunda zehirli olabilir ve temas halinde cildi tahriş edebilir; Teflon bandı, bakır laminat kesintinin bir ucuna uzunluk boyunca yaklaşık bir santimetreyi kapsayacak şekilde yerleştirin.

Ardından, bakır laminat kesiği, şeridin yarısı aşındırma solüsyonuna batacak şekilde şeffaf bantla dereceli bir beherin içine yapıştırın. Beheri 20 dakika boyunca döner bir platforma yerleştirin. Aşındırılmış bakır laminatı beherden çıkarın ve 10 dakika boyunca suyla dolu bir behere yerleştirin.

Kalıntıları durulamak için, hassas temizleme mendilinin bir parçasına izopropil alkol uygulayın ve aşındırılmamış bakır pedleri açığa çıkarmak için işaretlemeleri silin. Kalıcı markörün tüm izlerini temizleyin. Baskılı devre kartını yaklaşık bir santimetre uzunluğunda daha küçük kareler halinde kesin.

Baskı devre kartları aşındırıldıktan sonra, elektrotların bağlantıya hazır hale getirilmesi gerekir. Bu adımların bir mikroskobun görsel yardımıyla gerçekleştirilmesi önerilir. Keskin bir bıçak kullanarak, 0,11 inç kaplı ve 0,008 inç çıplak çapındaki kaplamalı, dizlenmiş paslanmaz çelik telden her biri üç santimetre uzunluğunda iki parça kesin.

Bu paslanmaz çelik tel parçaları, böceğin toraksına yerleştirilecek olan aktif elektrotlardır. Bir jilet kullanarak, her telin her iki ucundan dört ila beş milimetrelik plastik kaplamayı çıkarın. Ardından, kesin.

Topraklama elektrodu için uç uzatması oluşturmak amacıyla 0,7 santimetre uzunluğunda bir parça izoleli paslanmaz çelik tel. Kaplamayı, önceki adımda yapıldığı gibi jiletle dikkatlice çıkarın veya havya ısısıyla eritin. Ardından, bir parça lititz teli 4,5 santimetre uzunluğunda kesin.

Bu lehimleme işlemi için indüktör teli de kullanılabilir. Önceden hazırlanan 0,7 santimetrelik paslanmaz çelik uç parçası, lititz toprak bağlantı teline eklenir. Toprak bağlantısının ucunda açıkta kalmış bir paslanmaz çelik uç bulunmalıdır.

Sivrilmiş devre kartını, bir Teflon bant kullanarak lehimleme çalışma alanına sabitleyin. Bantı, elektrotların karta lehimlenmesine izin verecek şekilde pedlerin bir ila iki milimetresi açıkta kalacak şekilde devre kartının üzerine yerleştirin. Pedlerin maskelenmiş lehimsiz uçları FCC konnektörüne yerleştirilecektir.

Üç elektrot telini, her birinin bir ucunun elektrot kartındaki ilgili pedlere lehimlenebileceği şekilde Teflon bant ile hizalayın. İki aktif elektrot, kartın kenarlarına yakın pedlere lehimlenmelidir. Topraklanmış şase elektrotları ise merkez pedine lehimlenmelidir.

Lehimlemeyi kolaylaştırmak için elektrot pedlerine paslanmaz çelik lehim pastası uygulayın. Çok fazla lehim uygulayarak ped bağlantılarını kısa devre yaptırmamaya dikkat edin. Elektrotları önce 10 dakika boyunca asetona, ardından 10 dakika boyunca izopropil alkole daldırın.

Lehim kalıntılarını temizlemek için. Çözeltiler ayrı kaplara veya beherlere dökülebilir. Temizlik performansını artırmak için, daldırma işlemi sırasında elektrotları ultrasonik banyoya ve temizleme çözeltilerine yerleştirebilirsiniz. Böcekler, gündüz ve gece arasındaki geçişlerde en aktif durumda olacaklardır.

Bu nedenle, otomatik priz zamanlayıcıları kullanılarak bir böcek odası içerisinde yapay bir gündüz-gece döngüsü oluşturulmalıdır. Bunlar, yedi saatlik karanlık ve 17 saatlik aydınlık bir döngüyü simüle edecek şekilde ayarlanmalıdır. Uygun yerleştirme zamanını belirlemek için manduka sex eye pu eye günlük olarak incelenmelidir.

Pupa gözleri, kanatlardan yaklaşık bir gün sonra yerleştirilmeye hazırdır. Koyu lekeler sergileyen pupalarda yerleştirme işlemi, pupa kapanmadan yedi ila dört gün önce gerçekleştirildiğinde en başarılı sonuçları verir. Alttaki daha koyu renkli pupa, pui'yi anesteziye almak için elektrotların cerrahi yerleşimine hazırdır.

Bunları yaklaşık altı saat boyunca dört derece Celsius'ta buzdolabında bekletin. Ardından, yerleştirme çalışma alanını hazırlayın. Çalışma alanı izopropil alkol, keskin cımbız uçları ve 30 gauge'lik bir hipodermik iğne içermelidir.

Bir seçenek olarak, elektrot sabitlemesini artırmak için siyanoakrilat yapıştırıcı kullanılabilir; iğne cımbızlarını ve elektrotları izopropil alkole daldırarak veya silerek sterilize edin. Altı saat sonra pupillayı buzdolabından çıkarın ve çalışma alanına aktarın. Dorsal toraks üzerinde, ilgilenilen kas grubuna karşılık gelen konumu belirleyin.

Burada, kanatların yukarı yönlü hareketinden sorumlu olan dorsal ventral kaslarla ilgileniyoruz. Keskin bir bıçak veya hipodermik iğne kullanarak, ekzokatikula tabakası boyunca bir santimetrelik bir kare şeklinde nazikçe çizin. Cımbız yardımıyla bu parçaları yavaşça soyun.

Toraksın açıkta kalan bölgesindeki kanat tüylerini temizlemek için cımbız kullanın. Temizleme işlemine yardımcı olması için isteğe bağlı olarak bir vakum kullanılabilir. Yerleştirilen elektrotlarla etkileşime girmesini önlemek için tüylerin mümkün olduğunca fazlasının temizlenmesi önemlidir.

Kas grubunu hedefleyen iki giriş noktası oluşturmak için iğneyi, kanatların toraksa bağlandığı meso thax bölgesine yaklaşık beş milimetre derinliğinde yavaşça yerleştirin. Deliklerin yerini unutmayın, çünkü kaybolurlarsa bulunmaları zor olabilir. Mekanik dayanıklılığı artırmak için bir seçenek olarak pupayı masada sabitleyin ve iki kayıt elektrodunu bu iki giriş noktasına yönlendirmek için cımbız kullanın.

Elektrotların etrafındaki tüm tüyleri temizleyin ve tel aplikatörü kullanarak toraks üzerindeki her bir yerleştirme noktasının etrafına bolca ciano accolate yapıştırıcı uygulayın. Kafesi, böceğin tırmanabileceği pürüzlü ve dokulu bir malzemenin duvarları ve tavanı kapladığı şekilde ELO için hazırlayın. Çıkış gerçekleştiğinde, delikli karton kutular veya paketleme kağıtları kullanılabilir.

Rijit bir fiksasyon hazırlayın. Yaklaşık altı santimetre uzunluğunda ve iki milimetre çapında bir çubuk kullanın. Bu çubuğu, çıkıntı yapan prosların altındaki delikten dikkatlice kaydırın.

Plastik karıştırıcılar kullanılır. Bu adım için pamuklu bir çubuk veya metal teller de kullanılabilir. Çubuğun her iki ucunu, pupanın yuvarlanamayacağı şekilde kafes yüzeyine sabitleyin.

Pupayı, mezotoraks yukarı bakacak şekilde kafesin içine yerleştirin. Aşırı hareket elektrotların hasar görmesine, hemolenf kaybına veya yerleştirme işleminin etkisiz hale gelmesine neden olabilir. Toprak elektrodu, abdomene veya toraksın distal kısımlarına yerleştirilmelidir.

Sinyal eşleşmesini önlemek için disin yerleştirilmesi, pupa gelişiminin geç aşamalarında veya böcek çıktıktan sonra yapılabilir. Şase elektrodunun yerleştirme alanı, hem pupa evresindeki yerleştirme hem de ergin evresindeki yerleştirme için bu pupa evresinde hazırlanmalıdır. Burada, ergin evresinde şase elektrodu yerleştirmesi gösterilmektedir.

Güveleri altı saat boyunca dört °C sıcaklıktaki buzdolabında bekletin. Soğuk işlem immobilizasyonu için; izopropil alkol, sivri pensler, 30 gauge hipodermik iğne, kreyol yapıştırıcı, yapıştırıcı uygulamak için bir parça tel, isteğe bağlı bir termal koter ve isteğe bağlı bir dental mum çubuğu içeren yerleştirme çalışma alanını hazırlayın. Daha önce yapıldığı gibi, kayıt elektrotlarının boyunca posterior abdomenden yaklaşık bir ila iki santimetre uzaklıktaki bir yerleştirme noktasına yerleştirilen güveyle temas etmeden önce hipodermik iğneyi izopropil alkole daldırın; abdomeni delmek ve bir yerleştirme noktası oluşturmak için iğneyi yavaşça yerleştirin.

İğne dört milimetreden fazla nüfuz etmemelidir. Giriş yerinden hemo lenf çıkarsa, iğneyi çok derin yerleştirmişsiniz demektir ve prosedürün başarılı olma olasılığı azalır. Bir cımbız kullanarak topraklama elektrodunu giriş yerine dikkatlice yerleştirin ve üç ila dört milimetre derinliğe ulaşana kadar baskı uygulayın.

Elektrodu yerinde tutun ve isteğe bağlı bir adım olarak, yerleştirme bölgesinin etrafına yapıştırıcı uygulamak için bir tel kullanın. Yerleştirmenin mekanik dayanıklılığını daha da artırmak için termal koter kullanın ve ucunda iki ila üç milimetrelik küçük bir balmumu damlası toplayın. Ucu yerleştirme bölgesine yakın bir yere yerleştirin ve balmumu elektrodu çevreleyip onu sıkıca yerinde tutacak şekilde ısı uygulayın.

Soğutma işleminden sonra, deneyleri gerçekleştirmeden önce böceğin yerleştirme işleminden kurtulması için bir gün bekleyin. Böcek üzerindeki elektrot kartını Triangle Biosystems international kafa ünitesine bağlamak için düz esnek kablo konnektörlerine sahip bir adaptör kartı gereklidir. Adaptör kartı, daha önce elektrot kartının hazırlanması için sunulan adımlar izlenerek hazırlanan aşındırılmış bir bakır laminat kart kullanır; lehim istasyonunda, hazırlanan kartın bir ucuna düz esnek bir kablo konnektörü lehimleyin.

10 pinli düz esnek kablo konnektörü, konnektörün kenarlarındaki iki pin çifti ve merkezdeki pin çifti üç bakır pedle temas edecek şekilde karta lehimlenebilir. Ardından, üç adet 30 AWG bağlantı kablosu üç pede lehimlenir. Kartın diğer ucunda, tarif edildiği üzere osiloskop okumaları için adaptör kartındaki üç pede üç adet mini konnektör lehimlenir.

Bir sonraki aşamada, konnektörlerden ikisini kartın kenarlarına dik olacak şekilde konumlandırın. Orta konnektör, kartın düzleminden hafifçe yukarıya doğru açılı durmalıdır; bu üç telin diğer ucunu Triangle Biosystems International tarafından sağlanan kafa aşaması konnektörüne bağlayın.

Elektrotların güvenilirliğine yardımcı olmak ve sinyal-gürültü oranını gözlemlemek için kafa aşaması devre kartı, levitasyon çerçevesinin üzerine sabitlenmelidir. Kablolu osiloskop kayıtları alınabilir. Kablosuz kayıt sistemini kurmadan önce, osiloskopu çok kanallı bir AC nöro kayıt amplifikatörüne bağlayın.

Amplifikatör parametrelerini bir hertz yüksek geçiren kesim frekansına, 20 kilohertz düşük geçiren kesim frekansına ve 100 kazanca ayarlayın. Adaptör kartındaki dişi mini kablo konnektörlerinin her birini amplifikatör giriş kanallarına bağlayın. Elektrot kartı implante edilmiş böceği kafesten çıkarın.

Aktif durumdayken, bir cımbız yardımıyla ölçümler alınmadan önce güveye üzerine konması için bir doku parçası yerleştirilebilir, ardından elektrot kartını adaptör kartındaki düz esnek kablo bağlantı reseptörüne kaydırarak yerleştirin. Böceğin altındaki dokuyu kaldırın ve elektromiyogram spike'larının oluşumunu gözlemleyin. Böcek kanatlarını çırparken verileri osiloskop üzerinden yakalayın ve kaydedin.

Bu şekil, kanat çırpma öncesinde ve sırasında kaslardan birinden osiloskop ile alınan kas potansiyeli sinyalini göstermektedir. Sinyal, yüz kat yükseltme, 1 Hz'lik bir yüksek geçiren filtre, 20 kHz'lik bir düşük geçiren filtre ve sükunet süresi ile işlenmiştir. Herhangi bir kas potansiyeli gözlemlenmemiştir.

Kanat çırpma sırasındaki kas potansiyelleri yaklaşık 15 ila 20 hertz frekansında gerçekleşir. Osiloskop ölçümleri toplandıktan ve doğrulandıktan sonra, kablosuz EMG sinyalleri toplanmalıdır. Tethered Manus sex uçuşu sırasında EMG sinyallerinin kablosuz kaydı için bir elektromanyetik levitasyon platformu kurulabilir.

Levitasyon platformu, bir bağlama mekanizmasını dengelemek üzere tasarlanmış bir çerçeveden oluşur. Serbest yüzen levitasyon, çerçevenin ve dolayısıyla böceğin ya yapmasına olanak tanır. Bağlama tellerinin kısıtlaması olmadan yapılan testler sırasında, çerçeve bir erimiş biriktirme modelleme makinesi kullanılarak hızlı prototiplenebilir.

Mıknatıs yüklü bu çerçeve, taban platformundaki bir dizi elektromıknatıs tarafından havada tutulur. Bu levitasyon platformu, beş kere yedi adet bireysel LED'den oluşan bir diziden meydana gelen 60 panel kullanılarak inşa edilen LED arenasının içinde yer alır. Arena, hem saat yönünde hem de saat yönünün tersine dönme simülasyonuna ve dönüş hızının kontrolüne olanak tanıyan APIC 18 F 45 20 mikrodenetleyici ile kontrol edilir.

TBSI kablosuz kayıt sistemini kurun. TBSI kafa aşamasını, levitasyon platformundaki adaptör kartı konnektörüne bağlayın. Böceği, aktif olduğu bir zamanda, tercihen şafak vaktinde kafesten çıkarın.

Cımbız kullanarak, böceğin düzenek içerisinde sıkıca asılı kalmasını sağlayacak şekilde elektrot kartını, levitasyon çerçevesindeki düz esnek kablo alıcısına dikkatlice yerleştirin. Kablosuz veri iletimini etkinleştirmek için manyetik çubuğu, kafa aşamasındaki manyetik anahtarın yakınına yerleştirin.

Kafa aşamasının aktif olduğunu ve kayıt için hazır olduğunu belirten mavi bir ışık yanacaktır. Tam karanlık sağlamak için odadaki ışıkları kapatın ve bir bilgisayar üzerinden TBSI neuro aware yazılımını açın. Odaya ek aydınlatma sağlamak için kırmızı bir lamba kullanabilirsiniz.

Uygun konfigürasyon dosyasını seçin. Bu prosedürde kullanılan konfigürasyon dosyası varsayılan W five ayarıdır. Ardından, başlangıç arayüzünün sol üst köşesindeki start deck düğmesine tıklayın.

Sinyalleri izlemeye başlamak için, TBSI kayıt sistemindeki EMG sinyallerini gözlemlemek amacıyla tüm kanallar pencere sekmesini seçin. Güvenilir bir kablosuz bağlantı ve elektrot çalışması sağlamak için tüm LED arena bileşenlerini, regüleli DC güç kaynağını ve mikrodenetleyiciyi açın. Arena içindeki levitasyon platformunu yavaşça dengeleyin.

Nor Aware arayüzünün sol panelindeki "record to binary" sekmesini seçin. Kayıt süresini ve dosya kayıt konumunu belirleyin. Verilerinizi kaydetmek için uygun çıktı ayarlarını seçin.

TBSI kayıt yazılımı içinde bir kayıt oturumu başlatmak için başlat düğmesine tıklayın. Bu işlem, dosyanızın yaygın olarak kullanılan veri işleme programlarına aktarılabilen bir .next dosyası olarak kaydedilmesini sağlayacaktır.

Böceğin, LED'lerin hareketine karşılık gelen yönde uçtuğunu gözlemleyin. LED'lerin yönünü tersine çevirin ve böceğin de yönünü değiştirdiğini onaylayın. Bu işlemi istediğiniz kadar tekrarlayın. Gösterilen ok, LED düzeninin dönme yönünü belirtmektedir.

Ok sarı renge döner. Böcek saat yönünün tersine bir dönüş tamamladığında ok mavi renge döner, böcek saat yönünde bir dönüş tamamladığında ise ok mavi olur. Film oynatma sırasında görülen konuşma hızı normalden %50 daha hızlıdır.

Bu Şekil, durgunluk döneminde bir kas için kanat çırpma öncesinde ve sırasında kablosuz cihazla elde edilen kas potansiyeli sinyalini göstermektedir. Herhangi bir kas potansiyeli gözlemlenmemiştir. Kanat çırpma sırasındaki kas potansiyelleri yaklaşık 15 ila 20 hertz hızında meydana gelmektedir.

Burada sadece tek kanallı bir kayıt gösterdik. Ancak, bu düzenekle alınan çok kanallı bir kayıt, uçuş manevraları sırasında birden fazla kas grubu arasındaki koordinasyonu gözlemlemek için kullanılabilir. Az önce, man sex to pupa evresindeki bir örneğe erken metamorfoz aşaması elektrot yerleşiminin nasıl yapılacağını gösterdik.

İnsersiyonun pupa evresinin geç aşamasında zamanlanması, işlemin pupa evresinde çok erken veya çok geç yapılmaması açısından önemlidir. Aksi takdirde, güvenilir bir elektrot düzeneği kurma konusunda sorunlar yaşayabilirsiniz. Ayrıca, böcek LED arenasında havada asılıyken indirekt uçuş kaslarından kablosuz olarak EMG verisi kaydetmek için gerekli olan elektriksel bileşenlerin nasıl monte edileceğini de gösterdik.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.