Name: Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Keşfedin fare akut beyin dilimlerinde elektroporasyon ve time-lapse görüntüleme ile neuroblast göçünü inceleme yöntemini. Bu teknik, doğum sonrası beyin gelişiminde hücre dinamiklerini analiz etmek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MS ve YZ KCL ve KCL-Çin Doktora studentships tarafından desteklenmektedir. MO Bir Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi Doktora öğrencilikle tarafından finanse edildi. Biz Elektroporasyondan değerli tavsiye için Masaru Okabe ve Haziran-ichi Miyazaki PCX-EGFP plazmid ve Alain Chedotal ve Athena Ypsilanti teşekkür ederim.

Bu prosedür, İngiltere İçişleri Bakanlığı Yönetmeliği (Hayvan Bilimsel Usul Yasası, 1986) ile uyumludur. Bilim adamları kurulan ve kendi kurumsal ve ulusal hayvan düzenleyici kuruluşlar tarafından onaylanan yönergeleri takip etmelidir. 1.. Doğum Sonrası Elektroporasyon 1.1. Cam kapillerleri, DNA Çözüm ve Electroporator hazırlanması <ol><li> DNA enjeksiyon için çekti cam kılcal damarları (0.86 mm: 1,5 mm, ID OD) hazırlayın. (Sutter P-97 kılcal çektirmesi için Gösterge ayarları şunlardır: Isı 283; 50 çekin, Velocity 90, gün 50). Yaklaşık 2 ul bir hacme karşılık gelen kılcal bir iz yapın. </li><li> 850 msn aralıklarla (100 V, 50 milisaniye ON nabız, 850 msn&#39;den, nabız 5 OFF darbe) ile, 100 V, 5 kare bakliyat, 50 msn / darbe elektroporatörü voltajını ayarlayın. </li><li> 1-2 mg / ml bir son konsantrasyona kadar, yüksek saflıkta (OD&gt; 1,80 260/280) seyreltin endotoksin içermeyen plazmid DNAEndotoksin ile Tris-EDTA tampon maddesi ya da PBS boşaltın. Bu, DNA çözeltisi (başarılı bir şekilde enjekte edildiğinde boya ventrikülde yaymalıdır)% 0.1 hızlı yeşil ilave edilmesi tavsiye edilmektedir. </li><li> , 5-7 mm elektrotlar hazırlayın elektrot jeli ve ısıtma pedi ısınmak. </li></ol> 1.2. Elektroporasyon <ol><li> Kafes bir doğum sonrası gün 2 yavru fare çıkarın ve (~ 0.6 L / dk &#39;lık bir akış hızında) izofluran teneffüs bunu anestezi. </li><li> Yaklaşık 1 dakika sonra, ayak tutam yanıt kullanarak anesthetization durumunu belirlemek. Herhangi bir hareket olursa, intraventriküler enjeksiyonu ile devam edin. </li><li> Kılcal bağlı bir aspiratör tüpü kullanılarak DNA 1-2 ul kılcal iğne yerleştirin. </li><li> Bir soğuk ışık kaynağı altında, başparmak ve daha az dominant elin işaret parmağı arasında yavru kafa tutun. Biraz doğru enjeksiyon noktası tanınmasına yardımcı olmak için kafasına cilt geri çekin. </li><li> Göz ve t arasında sanal bir çizgi dikkateO dönüm lambda (Şekil 1A) kraniometrik. Lambda (hattı orta noktasından yaklaşık 1 mm) 15 bu hattın uzunluğunun yaklaşık üçte bir kılcal iğne takın. Beyinde derin penetrasyonu önlemek için emin olun, derin 2 mm hakkında kılcal yerleştirin. </li><li> Ağız yoluyla yavaş yavaş üfleyerek plazmid enjekte edilir (kılcal bağlı bir şırınga da kullanılabilir). Bu başarılı plazmid enjeksiyonu önlemek gibi bu işlem sırasında, parmaklarınız beyin üzerinde çok fazla baskı uygulamadan olmadığından emin olun. </li><li> DNA çözeltisinin bir minimum miktarda kılcal bırakıldığında enjeksiyon durdurun. Bu, intrakraniyal basınç artışı zararlı önlemek için en az 1 ul enjekte etmek için tavsiye edilir. </li><li> Coat hem jel ile elektrotlar ve DNA (Şekil 1A) enjekte edildi yarımkürenin yan tarafında olumlu tarafı ile koyun. Için rostral SVZ&#39;unda içine DNA eklenmesi için, yer elektrotlar biraz rostralenjeksiyon noktası. Elektrot konumu değişen SVZ&#39;unda 22,25 farklı alanlarda elektroporasyon bölgesel özgüllük elde edebilirsiniz. </li><li> Darbe Ayak pedalına basarak geçerli transferini başlatmak. Elektroporasyon tamamlandığında, (düşük voltaj değerleri zayıf elektroporasyon verimliliği ile ilişkili beri voltaj değerleri, 90 V altında olmamalıdır) elektroporatör ekranda gerilimi kontrol edin. </li><li> Birkaç dakika ısıtma pedi üzerinde oksijen altında yavru canlandırdığı ve uzak anneden yerleştirerek, kafese geri. Anne yavru alır ve çöp geri kalanı ile tekrar bir araya emin olun. Elektroporasyondan sonra, bir sonraki adımdan önce 4-7 gün boyunca anneleri ile yavrular bırakın. </li></ol> 2. Akut Beyin Dilim Kültürler hazırlanması 2.1. Çözümleri ve Araçları hazırlanması <ol><li> Aşağıdaki çözeltiler (bu kesme ve görüntüleme için yüksek glikoz DMEM kullanmak da mümkündür gerekmektedir17): Diseksiyon Medium (500 mi) Gey Dengeli medya - 500ml % 45 Glukoz - 5ml Film Medium (10 mi) % 45 Glukoz - 0.110 mi HEPES 1 M - 0,100 mi Pen / Strep - 0,100 mi FCS - 0.500 ml B27 - 0.100 mi Glutamine - 0.200 mi Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (fenol kırmızı içermeyen) - 8.89 mi </li><li> 37 ° C&#39;de ısıtın kadar film orta </li><li> Sıra Millicell 37 ° C /% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde film orta ve yer 1 ml içeren, 35 mm cam alt kültürü çanağı içine yerleştirir. </li><li> Vibratome aksesuarları (tornavida, odasını, jilet, yapıştırıcı) hazırlayın. </li><li> Makas, küçük spatula, düz forseps: diseksiyon araçları hazırlayın. </li><li> Dilimleri taşıma araçları hazırlayın: küçük fırça veya yumuşak bir aşılama döngü (boyut: 10 ul), plastik Pasteur pipetler, bir buz kutusu ve birkaç 6 cm plastik tabaklar. </li><li> Diseksiyon orta ön soğutma2-4 ° C&#39;de </li></ol> 2.2. Beyin Dilimleri hazırlanması <ol><li> Önceden ısıtılmış diseksiyon orta ile 6 cm çanak doldurun ve (taze kesilmiş dilimleri tutmaya) buz üzerine yerleştirin. </li><li> Servikal dislokasyon ardından, yavru fare başını kesmek için makas kullanın. , Bir neşter ile kafa derisi kaldırmak beyinciğe OB orta sagital sütür boyunca kafatası kesilmiş ve hafifçe forseps kullanarak kranial kapaklarını çıkarın. Tüm beyin maruz olduğundan emin olun ve dikkatli bir dokusuna zarar vermemek için özel dikkat, bir spatula kullanarak teşrih. Diseksiyon dikkatli yapılması gereken, ancak aynı zamanda çok hızlı bir şekilde (eğer mümkünse bir dakikadan daha az). Uyuşturucu / gaz anestezik terminal anestezi nöroblast ve hayvan kurban aşağıdaki nispeten hızlı bir şekilde yansıması gereken beyin dilim kültürlerin sağlıklı devletin göçmen özelliklerini etkileyebilir çünkü Servikal dislokasyon bizim tercih edilen bir yöntemdir. </li><li> Bir raz ile beyin Hemisectya da bıçak (Şekil 2). Uninjected Yarımküreyi atın veya diğer deneyler için kullanın. </li><li> Vibratome tutucuya bant küçük bir parça koyun ve bunun üstüne beyin yarımkürede (Şekil 2) eklemek için tutkal gerekli minimum miktarda kullanın. Bu, tekrarlanan uygulamalara tutkal tutucu yüzeyinin hasar görmesini önler. </li><li> Tutkal birkaç saniye kurumasını sağlayın. </li><li> Önceden ısıtılmış diseksiyon çözümü ile dolu vibratome tepsisine tutucu yerleştirin. Bıçağın doğru koku ampul (Şekil 2) yöneltin. </li><li> Uygun ayarları kullanarak beyin yarımkürede kesme başlar. Aşağıdaki parametreler önerilir: dilim kalınlığı 300 mikron; hız ~ 3-5; frekans ~ 9. Yüksek frekans ve düşük hızlı dilim zarar görmesini önlemek için önerilmektedir. </li><li> Küçük bir fırça veya yumuşak bir aşılama döngü kullanarak dilimleri toplayın. Sadece görünür OB (genellikle 2-3 dilim / beyin) ile dilimleri tutun. Tipik olarak, RMS çoğu içeren dilim can alt yüzeyinden ~ 300 um bulunabilir. </li><li> (Her iki tarafta floresan kontrol etmek için onları çevirmek için emin) GFP sinyali için standart bir floresan mikroskop altında dilimleri kontrol edin ve RMS çoğu boyunca parlak floresan gösteren olanları seçin. </li></ol> 2.3. Kültürleme Beyin Dilimleri <ol><li> Bir hücre kültürü kaputu, beyin dilim en kaudal üçte kesip ve ince düz bir cımbız veya bir mikrodisseksiyon neşter kullanarak herhangi bir tutkal izlerini kaldırmak. </li><li> İncelikli bir plastik Pasteur pipet kullanarak dilim aspire (daha büyük bir açıklık oluşturmak için pipet ucu kesilmiş, bu dilim zarar görmesini önleyecek) ve insert önceden ısıtılmış Millicell ortasına yerleştirin. </li><li> En parlak flüoresan sinyali ile yan Millicell (bir inverted mikroskop ile görüntüleme için) girişi ile temas halinde yerleştirilir emin olun. </li><li> Bir pipet ile insertin üst fazla diseksiyon çözüm çıkarın. </li><li> Için dilim kültürleri bırakıngörüntüleme önce en az 1 saat boyunca 37 ° C /% 5 CO2 inkübatörü içinde yerleşirler. </li></ol> 3. Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme <ol><li> En az 2 saat görüntüleme önce, sabit ayarlanmış Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2), dijital CCD kamera soğutmalı Perkin Elmer UltraViewVoX konfokal dönen disk sistemi, ters Nikon Ti-E mikroskop, ve ısıtma sistemi (Solent Scientific) açın 37 ° C&#39;de sıcaklığı </li><li> Volocity yazılım Toplama modülü açın ve &quot;VIZ&quot; butonuna tıklayın ve görüntüleme için lazer (lar) ı seçin. </li><li> Beyin dilim hazırlık 2 saat içinde, mikroskop sahnede görüntüleme odasında beyin dilim içeren cam alt çanak yerleştirin. </li><li> Yansıması olacak dilimin alanı (örneğin, sadece enjeksiyon yerinde sonra RMS ilk inen kısmı veya ELBO seçmek ve odaklanmak için uygun floresan ışığı altında Nikon CFI Süper Planı Fluor ELWD 20X/0.45 objektif kullanınRMS bölge w, ya da sadece Nöroblastlar OB girmeden önce dirsek sonra). </li><li> Aşağıdaki eylemlerden ile time-lapse görüntüleme ayarlayın: <ol><li> Mikroskop, numunenin lazer tarama izin L100 butonuna tıklayın. </li><li> Volocity, uygun lazer (GFP örneğin 488 nm lazer) seçerek ultraview Lazer Changer açın. </li><li> Floresan sinyal yoğunluğuna bağlı olarak pozlama süresini (genellikle 100-500 arasında msn) ve lazer yoğunluğu (genellikle% 20-30) ayarlayın. </li><li> Hücre görselleştirme geliştirmek için görüntü dijital kazanç ayarlayın. </li><li> Beyin dilim içindeki görüntüye z-yığın aralığı (genellikle üzerinde 100-120 mikron aralık) seçin. (Bu, daha sonraki izleme analizi kolaylaştıracak) mümkün olduğu kadar örtüşen mümkün önlemek için bir izole edilmiş hücre uygun bir sayısı ile bir aralık seçin. </li><li> Her z-yığın görüntü (genellikle 2-4 mikron) arasındaki boşluğu seçin. </li><li> Zaman int seçinHer z-yığın yakalama (örneğin 3 dk) ve toplam görüntüleme süresi (örneğin 3 saat) arasında erval. </li><li> Görüntüleme parametrelerinde değişiklikleri kaydetmek için &quot;kaydet&quot; ikonuna tıklayın. </li><li> Görüntüleme başlamak için kayıt düğmesine basın. </li></ol></li><li> Kontrol ve deney numunelerinin Alternatif görüntüleme aynı gün boyunca (örneğin bir araç / ilaç tedavisi veya farklı elektroporasyona plazmid için). </li></ol> 4. Neuroblast Göç Analizi <ol><li> Volocity Kantitasyon modülünde, bir time-lapse deneyi tamamladıktan sonra oluşturulan istenen kitaplığı açın. Sol üst kutuya (Şekil 4A, adım 1) &quot;Extended Odaklama&quot; öğesini seçin. </li><li> (Şekil 4A, adım 2) Ölçüm penceresini görüntülemek için &quot;Ölçümler&quot; sekmesine tıklayın. </li><li> Görevlerin bir listesi ekranın sol alt köşesinde görünür. Drag &quot;Track&quot; (&quot;Diğer&quot; başlığı altında bulunan alt başlığıYukarıdaki uzay liste). Bu ekranın sol üst kısmında &quot;İz&quot; adlı yeni bir pencerenin açılması (Şekil 4A, adım 3) isteyecektir. </li><li> Parça pencerede &quot;Giriş&quot; sekmesinde (Şekil 4A, adım 4) den &quot;Puan&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Nokta Aracı (Şekil 4A, adım 5) tıklayın. </li><li> Hücre vücudun merkezi alanında fare ile tıklayarak göç neuroblast izleme başlatın ve zaman sukut son noktaya kadar hücre hareketlerini takip tutmak ulaşılır (3 hr-uzun film için örnek nokta sayısı 61 için) . </li><li> Veri seçmek edinmek için Ölçüm Menüsü (Şekil 4B, 6-7 adım) dan &quot;Ölçüm Item&quot;. Bir pencere ekranın merkezindeki görünür. </li><li> Bu pencerede, &quot;adı verilen yeni bir ölçüm öğe:&quot; seçin ve (Şekil 4C, adım 8) bir ad yazın. PR önce &quot;All zamannoktaları&quot; seçeneğini seçmeyi unutmayınessing OK (Şekil 4C, adım 9). Bir ölçüm öğesi dosyası time-lapse dosyası altında görünecek ve kantitatif analiz için parametreleri (örneğin göç mesafe, hız, yer değiştirme ve yer değiştirme oranı) içerecektir. </li><li> Bir pencerede (Şekil 4D, adım 10) olarak açmak için ölçüm öğe dosyasına çift tıklayın. </li><li> , Analiz hücrelerin tek parça görselleştirmek &quot;Display&quot; seçeneği (Şekil 4D, adım 11) adlı &quot;Paletli Point&quot; seçin. </li><li> Sağ Ölçüm Ürün dosyasını tıklayın ve ardından göç parametreleri analiz etmek Excel gibi programlarda ithal edilebilir bir metin dosyası olarak dışa aktarın. </li><li> , Filme dönemde her bir hücresi tarafından yapılan ölçüm Öğe dosyasında &quot;Display&quot; seçenekleri &quot;Nokta&quot; veya &quot;Nüfus&quot; seçin ve (her parça benzersiz bir kimliği vardır) kimliği tıklayın ardışık çerçeve ve duraklar arasındaki hareketlerini ölçmek için. Devam ile sonuçlanan dosya İhracatadımda 4.10 açıklandığı gibi ing. </li></ol>

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+brain%3A+significant+answers+and+significant+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li>
<li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+and+new+memories%3A+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and.</a> 11, 339-350 (2010).</li>
<li>Lazarini, F., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+adult+neurogenesis+essential+for+olfaction%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Is adult neurogenesis essential for olfaction?</a> Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).</li>
<li>Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+replacement+from+endogenous+precursors+in+the+adult+brain+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke.</a> Nat. Med. 8, 963-970 (2002).</li>
<li>Emsley, J. G., Hagg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha6beta1+integrin+directs+migration+of+neuronal+precursors+in+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain.</a> Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).</li>
<li>Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+neuroblasts+emigrate+toward+cortical+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).</li>
<li>Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+of+tangential+pathways+for+neuronal+migration+in+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).</li>
<li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).</li>
<li>Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+symphony+of+signals+conducts+early+and+late+stages+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis.</a> Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).</li>
<li>Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+neuronal+migration+changes+the+fate+of+developing+neurons+in+the+postnatal+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).</li>
<li>Gotts, J. E., Chesselet, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+subventricular+zone+expansion+after+focal+cortical+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury.</a> J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).</li>
<li>Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+patterns+of+subventricular+zone+cells+in+adult+mice+change+after+cerebral+cortex+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury.</a> Brain Res. 996, 213-226 (2004).</li>
<li>Romanko, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+mammalian+subventricular+zone+in+cell+replacement+after+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury.</a> Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PloS One. 3, e1883(2008).</li>
<li>Barnabe-Heider, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+adult+mouse+neurogenic+niches+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation.</a> Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).</li>
<li>Platel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li>
<li>Pathania, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-132+enhances+dendritic+morphogenesis%2C+spine+density%2C+synaptic+integration%2C+and+survival+of+newborn+olfactory+bulb+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons.</a> PloS One. 7, e38174(2012).</li>
<li>dal Maschio, M., M,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nat. Commun. 3, 960(2012).</li>
<li>Oudin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+regulate+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).</li>
<li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Front. Neurosci. 4, (2010).</li>
<li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+subventricular+zone+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neonatal subventricular zone electroporation.</a> J. Vis. Exp. (72), e50197(2013).</li>
<li>Nam, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility%3A+a+two-photon+time-lapse+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li>
<li>James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+cell+migration%3A+lessons+from+quantitative+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy.</a> Front. Neurosci. 5, 30(2011).</li>
<li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls%3A+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Dev. 6, 13(2011).</li>
<li>Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plexin-b2+regulates+the+proliferation+and+migration+of+neuroblasts+in+the+postnatal+and+adult+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone.</a> J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).</li>
<li>Sanai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corridors+of+migrating+neurons+in+the+human+brain+and+their+decline+during+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy.</a> Nature. 478, 382-386 (2011).</li>
<li>Tattersfield, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+striatum+of+the+quinolinic+acid+lesion+model+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease.</a> Neuroscience. 127, 319-332 (2004).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li>
<li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+acute+slices+of+the+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain.</a> J. Vis. Exp. (67), e4061(2012).</li>
<li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li>
<li>Schaar, B. T., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+coordination+during+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal coordination during neuronal migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).</li>
<li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li>
<li>Comte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li>
<li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

RMS boyunca sinir atalarıdır Verimli göç fonksiyonel nöronlar 10 onların sonraki olgunlaşmasını sağlar. OB yönelik sinir atalarıdır Tanınmış akışları insan bebeklik görülebilir ve erken doğum sonrası insan beyin gelişiminde 27 önemli bir rol oynaması olasıdır. Ayrıca, bu hücreler, yaralanmaya ve nörodejenerasyon 4,28 etkilenen beyin siteleri hedef edebiliyoruz. Gerçek zamanlı neuroblast dinamikleri üzerinde gen manipülasyonu etkisini izlemek için güçlü olmak tamamen neuroblast hareketi g...

Memeli beyninde, yeni nöron (nöron) &#39;nin üretimi başlıca iki bölgede doğumdan sonra ortaya çıkar, hipokampus 1 kıvrımlarının lateral ventriküllere ve subgranular bölgesinin subventricular bölgesi (SVZ). Son yıllarda toplanan önemli kanıtlar hipokampus ve koku alma ampul hafıza fonksiyonları 1-3 doğum sonrası nöron için kritik bir rol destekler. Önemlisi, doğum sonrası nörogenezis aynı zamanda terapötik çünkü dejeneratif nörolojik bozuklukları ile ilişkisi potansiyelini ve beyinde 4-6 yaralı sitelere göç neuroblasts yeteneğini tutar. Subventricular bölgesi (SVZ) son zamanlarda önemli bir nörojenik niş olarak ortaya çıkmıştır. SVZ&#39;una türetilmiş Nöroblastlar bu doğum sonrası beyin 1,7,8 en uzun göç süreci yapma, rostral göçmen akışı (RMS) aracılığıyla koku ampul (OB) doğru göç ederler. Memeli SVZ / RMS / OB sistemi haline gelmiştirBöyle çoğalması, göç ve farklılaşma 1,8 nörogenezin farklı adımlar, incelemek için yararlı bir model. Birçok büyüme faktörleri ve hücre dışı ipuçları RMS boyunca SVZ&#39;una nörogenezi ve göç düzenleyen, ancak hücre içi moleküler mekanizmalar tam olarak uzak olmaktan 1,9 anlaşılamamıştır. RMS boyunca doğru göç yenidoğan nöronların 10 sonradan olgunlaşması için çok önemlidir. Ayrıca, bazı çalışmalar SVZ&#39;una türetilmiş Nöroblastlar beyin hasarı sitelere 4-6,11-13 için RMS dışına göç olduğunu göstermiştir. Bu durumda, sinyal düzenleyici mekanizmalar neuroblast göç soruşturma nöron anlamak için sadece temel hem de potansiyel terapötik uygulamalar içindir. Burada, in vivo doğum sonrası elektroporasyon ile SVZ&#39;una sinir atalarıdır etiket ve time-lapse dönen disk konfokal microsco kullanarak akut beyin dilim kültürlerde RMS boyunca onların göç izlemek için ayrıntılı bir protokol açıklarpy. Elektroporasyon yaygın embriyonik yetişkin evrelerinde 14-18 gelişimsel çalışmalarında kullanılmaktadır. Bu SVZ&#39;una sinir atalarıdır hedef ve işlemek için güçlü bir araçtır ve transgenik modeller 1,15,19,20 viral vektörlerin veya kuşak stereotaktik enjeksiyonu için daha ucuz ve çok daha hızlı bir alternatif temsil eder. Bu ameliyat gerekir ve yüksek sağkalım oranlarına sahip değildir nispeten basit bir işlemdir. ShRNA veya loxP sistemi ilgi genlerin hedeflenmesi ya da SVZ progenitörlerinin kalıcı etiketleme elde etmek, böylece yetişkin nöron çalışmalar 21,22 için yararlı bir araç temsil kullanılabilir kullanılarak fare Genetik modellerde CRE rekombinaz-sentezleyen plasmidlerin Elektroporasyon. Sağlam bir beyin görüntüleme RMS neuroblast göç nedeniyle hala geçerli teknik kısıtlamalar nedeniyle zordur. Ancak, bu süreç uygun bir Sist sağlamak akut beyin dilimleri, konfokal dönen disk time-lapse mikroskopi kullanılarak izlenebilirem yakından farmakolojik manipülasyon 23,24 için de müsait in vivo durum benzer. Time-lapse görüntüleme ile vivo doğum sonrası elektroporasyon Kavrama neuroblast hareketliliğini kontrol moleküler mekanizmaların anlaşılmasını kolaylaştırmak ve beyin tamir teşvik etmek için yeni yaklaşımların gelişmesine katkıda bulunacaktır.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Cam alt kültür kabı</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Gey'in Dengeli ortamı</td><td>Sigma</td><td>G9779-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz, %45</td> <td>Sigma</td><td>G8769-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kalem/ Strep</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>GIBCO</td><td>10109-163</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a</td><td>>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (fenol kırmızısı içermez)</td><td>GIBCO</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yeşil</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Enjeksiyon için cam kılcal damarlar</td><td>Harvard Aparatı</td><td>30-0057</td><td></td></tr><tr><td>Aspiratör tüpü</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Sutter P-97 kılcal çektirme</td><td>Sutter Aleti</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ECM830 Kare Dalga Elektroporatörü</td><td>Harvard Aparatı</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Platin Cımbız 7 mm</td><td>Harvard Aparatı</td><td>45-0488</td><td></td></tr><tr><td>Ayak Pedalı Modeli 1250F</td><td>Harvard Aparatı</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>Elektrotlar için Jel</td><td>Cefar Compex</td><td>6602048</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Merial</td><td>AP/İLAÇLAR/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Tutkal</td><td>Roti coll</td><td>Roti coll 1</td><td></td></tr><tr><td>UltraViEW VoX eğirme diski sistemi</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD kamera ile donatılmış özelleştirilmiş kurulum (birden fazla lazer kaynağı kullanılabilir)</td></tr><tr><td>Volocity yazılımı</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Edinim, Nicetleme, Görselleştirme Modülleri Mikroskopi</td></tr><tr><td>için çevre odası</td><td>Solent Scientific</td><td></td><td>Ismarlama</td></tr><tr><td>Ti-E ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Bu belgede açıklanan uygulama için CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objektifi önerilir</td></tr></tbody></table>

fare akut beyin dilimleri neuroblast göç vivo doğum sonrası elektroporasyonla ve time-lapse görüntüleme

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Subventricular bölgesi (SVZ) doğum sonrası beyindeki ana nörojenik niş biridir. Burada, sinir atalarıdır çoğalır ve koku ampul (OB) doğru rostral göçmen akışı (RMS) birlikte hareket edebilmek nöroblast doğuran. Bu uzun mesafe göç OB yenidoğan nöronların sonraki olgunlaşması için gereklidir, fakat bu süreci düzenleyen moleküler mekanizmalar hala belirsiz olmasıdır. Neuroblast hareketliliğini kontrol sinyal yollarını araştıran nörojenezindeki temel bir adım anlamak değil, aynı zamanda yaralanma, inme veya dejenerasyon etkilenen beyin sitelerini hedeflemek için bu neuroblasts yeteneği verilmiş, tedavi rejeneratif potansiyele sahip olabilir sadece. Bu yazıda; in vivo sonrası elektroporasyon ve fare RMS neuroblast göç sonraki zaman atlamalı görüntüleme için ayrıntılı bir protokol açıklar. Doğum sonrası elektroporasyon verimli SVZ&#39;una dede transfect olabilirsırayla RMS boyunca göç neuroblasts oluşturmak hücreleri. Akut beyin dilim kültürleri disk time-lapse mikroskopi iplik konfokal kullanarak, neuroblast göç yakından in vivo durumu andıran bir ortamda izlenebilir. Ayrıca, neuroblast hareketliliği izlenen ve kantitatif analiz edilebilir. Örnek olarak, biz RMS boyunca göç neuroblasts etiket ve görselleştirmek için bir GFP-ifade plazmid in vivo doğum sonrası elektroporasyon nasıl kullanılacağını açıklar. LoxP sistemi vasıtası ile koşullu knockout farelerde shRNA veya CRE rekombinaz-sentezleyen plasmidlerin Elektroporasyon de ilginç genlerin hedeflenmesi için kullanılabilir. Akut beyin dilim kültürlerin Farmakolojik manipulasyon neuroblast göç farklı sinyal moleküllerin rolünü araştırmak için yapılabilir. Time-lapse görüntüleme ile vivo elektroporasyon bağlanmasıyla, biz neuroblast hareketliliği kontrol eden moleküler mekanizmaları anlamak ve geliştirmek için katkıda bulunmayı umuyoruzRomanın Ment beyin tamir teşvik yaklaşır.

SVZ türevi göç neuroblasts işaretlenmesi genellikle 4-8 gün başarılı bir elektroporasyon (Şekil 1 B) sonra, RMS boyunca gözlenebilir. Daha uzun süre noktaları da seçilebilir, ancak çoğu OB girmiş olacağından daha az hücre RMS bulunacaktır. Nöroblastomun yaklaşık 2-3 hafta sonra, elektroporasyon (gösterilmemiştir), OB olgun granül hücrelerin morfolojisi ve tipik özellikleri elde başlar. ~ 1 saat kültür işleminden sonra, elektroporasyona fare yavrularından Beyin dilimleri güvenilir bir şekilde 3-4 saat bo...

Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki temel bir olaydır. Biz akut beyin dilimleri zaman atlamalı görüntüleme kullanarak in vivo doğum sonrası elektroporasyon ve onların göç sonraki görselleştirme tarafından neuroblasts verimli etiketleme için bir protokol açıklar. Biz video izleme tarafından neuroblast dinamiklerinin kantitatif analiz için bir açıklama içerir.

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Bu prosedürün genel amacı, doğum sonrası fare beynindeki rostral göç akımı boyunca Neuroblast'ın göçünü görselleştirmek ve analiz etmektir. Bu, fare poplarının lateral ventrikülünde ilk olarak Elektroporasyonlu, bir DNA plazmid ENC kaplayan yeşil floresan proteini ile gerçekleştirilir. İkinci adım, elektroporasyonlu farelerden beyin dilimleri hazırlamaktır.Daha sonra, kültürleme için en iyi GFP sinyaline sahip dilimler seçilir. Son adım, dönen disk konfokal mikroskop kullanılarak GFP işaretli göçmen nöroblastı içeren beyin dilimlerinin hızlandırılmış görüntülemesidir. Sonuç olarak, hızlandırılmış filmler, hücre takibi ve nöroblast göçünün kantitatif analizi için kullanılır.Bu yöntem, kök hücre kaynaklı nöroblastın hareketinin doğum sonrası beyinde nasıl yönlendirildiği ve düzenlendiği gibi nörojenez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin viral vektör iletimi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, daha kolay, daha ucuz ve daha az zaman alıcı olmasıdır. Ek olarak, nöroblastın seyrek etiketlenmesine izin verir, bu nedenle göç dinamiklerinin ayrıntılı bir analizini mümkün kılar.Bu prosedüre, elektroporasyonun voltajını 50 milisaniye aralıklarla 100 voltta darbe başına 850 milisaniye olmak üzere beş kare darbeye ayarlayarak başlayın. Ardından, kılcal damara bağlı bir aspiratör tüpü kullanarak bir ila iki mikrolitre DNA içeren bir kılcal iğne yükleyin. Daha sonra, doğum sonrası ikinci gün bir fare yavrusunu kafesten çıkarın ve flor inhalasyonu ile uyuşturun.Bundan sonra, yavrunun başını daha az baskın olan elinizin baş parmağı ile işaret parmağı arasında tutun. Doğru enjeksiyon noktasının belirlenmesine yardımcı olmak için cildi başın üzerine hafifçe geri çekin. Göz ile kranio metrik dönüm noktası Lambda arasında sanal bir çizgi düşünün.Daha sonra kılcal iğneyi Lambda'dan bu çizginin uzunluğunun yaklaşık üçte birine kadar yaklaşık iki milimetre derinliğe kadar sokun, ağızdan yavaşça üfleyerek plazmid enjekte edin. Bu işlem sırasında parmaklarınızın beyne çok fazla baskı uygulamadığından emin olun. Kılcal damarda minimum miktarda DNA çözeltisi kaldığında enjeksiyonu durdurun.Daha sonra her iki elektrotu da jel ile kaplayın ve pozitif tarafı DNA'nın enjekte edildiği hemisferin yan tarafına yerleştirin. DNA'nın Rostral SVZ'ye dahil edilmesi için, elektrotları enjeksiyon noktasına hafifçe rostral yerleştirin. Ardından, darbeli ayak pedalı pedalına basarak akım transferini başlatın.Daha sonra yavrunun kafasındaki jeli silin, yavruyu birkaç dakika boyunca bir ısıtma yastığı üzerinde oksijenle yeniden canlandırın. Daha sonra, kafese geri koyun ve anneden uzağa koyun. Annenin yavruyu aldığından ve onu çöpün geri kalanıyla yeniden bir araya getirdiğinden emin olun.Bu prosedürde, milli hücre eklerini bir mililitre film ortamı içeren 35 milimetrelik bir cam tabanlı kültür kabına yerleştirin. Daha sonra kültür kabını 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit sıcaklıkta nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Fare yavrusunun kafasını kestikten sonra, kafa derisini bir neşter ile çıkarın.Daha sonra, kafatasını beyincikten koku alma ampulüne kadar orta sagital sütür boyunca kesin. Kafatası üzerinde bazı ek enine kesimler yapın ve forseps kullanarak kraniyal flepleri nazikçe çıkarın. Tüm beynin açıkta olduğundan emin olun ve dokuya zarar vermemeye özellikle dikkat ederek bir spatula kullanarak dikkatlice inceleyin.Bundan sonra, hemis beyni bir jiletle parçalara ayırır ve enjekte edilmemiş yarım küreyi atar. Daha sonra vibram tutucusuna küçük bir parça bant yerleştirin. Beyin yarım küresini üzerine yapıştırmak için gereken minimum miktarda yapıştırıcı kullanın.Beyin yarım küresini 300 mikronluk dilimler halinde kesmeye başlayın. Ardından küçük bir boya boya fırçası veya yumuşak bir aşılama halkası kullanarak dilimleri toplayın. Daha sonra, dilimlerin her iki tarafını da GFP sinyali için standart bir floresan mikroskobu altında kontrol edin ve rostral göç akımının çoğu boyunca parlak floresan gösterenleri seçin.Bir öz kültür başlığında, beyin diliminin en küçük üçte birlik kısmını kesin ve yapıştırıcı izlerini çıkarın. Ardından, plastik bir pipet kullanarak dilimi aspire edin ve önceden ısıtılmış bir milli hücre ekinin ortasına yerleştirin. Ek parçanın üstündeki fazla diseksiyon solüsyonunu bir gilson pipeti ile çıkarın.Daha sonra dilim kültürlerini en az bir saat boyunca 37 derece santigrat derece% 5 karbondioksit inkübatöründe dinlenmeye bırakın. Beyin dilimi hazırlığından sonraki iki saat içinde görüntülemeden önce. Beyin dilimini içeren cam alt tabağı mikroskop tablasındaki görüntüleme odasına yerleştirin.Ardından, görüntülenecek dilimin alanını seçmek ve odaklamak için uygun floresan ışığı altında 20 x 0,45'lik bir objektif kullanın. Mikroskopta hızlandırılmış görüntülemeyi ayarlamak için, numunenin lazerle taranmasına izin vermek için L 100 düğmesine tıklayın. Daha sonraki hızda, uygun lazeri seçerek ultra view lazer değiştiriciyi açın.Pozlama süresi kazancını ve lazer yoğunluğunu ayarlayın. Ardından beynin içini görüntülemek için Zack aralığını seçin. Ardından, her ZS yığın görüntüsü arasındaki boşluğu seçin.Her ZS yığını yakalama ile toplam görüntüleme süresi arasındaki zaman aralığını seçin. Ardından, görüntüleme parametrelerindeki değişiklikleri kaydetmek için kaydet simgesine tıklayın. Sonunda, Velocity kantitasyon modülünde görüntülemeyi başlatmak için kayıt düğmesine basın.Oluşturulan istenen kitaplığı açın. Hızlandırılmış bir denemeyi tamamladıktan sonra, sol üst kutudan genişletilmiş odağı seçin. Ölçüm penceresini görüntülemek için ölçümler sekmesine tıklayın.Ekranın sol alt kısmında bir görev listesi görünür. Parçayı yukarıdaki boşluğa sürükleyin. Bu, track adlı yeni bir pencerenin açılmasını isteyecektir.Ekranın sol üst kısmında, parça penceresindeki giriş sekmesinden noktaları seçin. Nokta aracına tıklayın, araçlar sekmesine tıklayın ve nesneleri manuel olarak izleme seçeneğini seçin, operatörün hücreleri izlemeye başlamasına izin vermek için bir pencere açılacaktır. Hücre gövdesinin merkezi alanına fare ile tıklayarak göç eden nöroblastı izlemeye başlayın ve zaman atlamasının son zaman noktasına ulaşılana kadar hücre hareketini izlemeye devam edin.Veri elde etmek için ölçüm öğesi yap'ı seçin. Ölçümler menüsünden, ekranın ortasında bir pencere belirecektir. Bu pencerede, adında yeni bir ölçüm öğesi seçin ve bir ölçüm öğesi adı yazın.Kantitatif analiz için parametreler içeren dosya, hızlandırılmış dosyanın altında görünecektir. Analiz edilen hücrelerin tek izlerini görselleştirmek için bir pencere olarak açmak için bu ölçüm öğesi dosyasına çift tıklayın. Görüntüleme seçeneklerinden izlenen noktayı seçin ve göç yolları için görselleştirilmesi gereken hücreleri seçin.Geçiş parametrelerini analiz etmek için ölçüm öğesi dosyasına sağ tıklayın ve daha sonra Excel gibi programlarda içe aktarılabilen bir metin dosyası olarak dışa aktarın. Bunlar, bir fare sagital beyin diliminden alınan nöroblastın dönen disk hızlandırılmış görüntüleridir. Plazmit görüntülerini eksprese eden A GFP'nin elektroporasyonundan beş gün sonra bir saat arayla görüntülenir.Her panel, dört mikron aralıklı 28 ardışık görüntüden oluşan bir Zack projeksiyonudur. Ok uçları, RMS boyunca koku alma ampulüne doğru göç eden dört temsili nöroblastı gösterir. Bunlar, dört nöroblastın hızlandırılmış görüntülemesinden elde edilen temsili göç yollarıdır.Bu grafik, iki temsili nöroblastın zamanla göç ettiği mesafeyi göstermektedir. Bu hücreler tipik bir tuzlama hareketliliği davranışı sergilerler. Bu filmde, fare RMS'nin GFP etiketli bir bölümü geçiş gösterilmektedir.Nöroblast, plazmit eksprese eden A GFP'nin elektroporasyonundan beş gün sonra elde edilir. Koku ampulü, sağ alt köşeye doğru görüş alanı dışında bulunur. Konfokal Z yığınları, dönen bir disk konfokalinde yakalandı.20 mikronluk bir aralıkta üç saat boyunca her üç dakikada bir 120 x objektif ile oynatma hızı saniyede 10 karedir. Bu prosedürü denerken, deneylere başlamadan önce elektroporasyon yapmayı unutmamak ve ayrıca akut beyin dilimi kültürlerini mümkün olan en kısa sürede dikkatlice hazırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, doğum sonrası fare beynindeki Neuroblast göçünü nasıl görselleştireceğinizi ve analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

in-vivo-postnatal-electroporation-time-lapse-imaging-neuroblast

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz fare önbeyin nöronal göç gerçek zamanlı videoimaging için bir protokol açıklar. Viral etiketli veya aşılı nöronal öncüllerinin göç durağan ve göç fazlarının süreleri ve hız gibi hücre göçü farklı evreleri, incelemek için nispeten hızlı toplama aralığı ile geniş alan floresan görüntüleme kullanarak akut canlı dilim kaydedildi göç.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

Kaynak: Wiegreffe, C., et. al.,  {{}}In Utero Elektroporasyon. J. Vis. Uzm. {{TAG_ 44}} (2017) Bu video, transdüksiyonlu fare embriyonik beyin dilimlerinde radyal glial iskeleler yoluyla subventriküler bölgeden kortikal plakaya kortikal nöron radyal göçünü gözlemlemek için hızlandırılmış konfokal mikroskopiyi göstermektedir.

Transdüksiyonlu Fare Embriyonik Beyin Dilimlerinde Kortikal Nöron Radyal Migrasyonunun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki çok önemli bir adımdır. Protokol Burada açıklanan DNA / küçük firkete RNA (ShRNA) nucleofection ve kemirgen doğum sonrası rostral göçmen akımından izole nöroblast ile 3D göç deneyi kullanılarak neuroblast göç aday düzenleyicilerinin rolünü araştırmak için kullanılabilir.

Kemirgen neuroblasts nucleofection Neuroblast Göç Eğitim için<em&gt; In vitro</em

Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Bu protokol, in situ akson büyümesi ve büyüme konisi dinamiklerini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem göstermektedir. Fizyolojik olarak ilgili akut beyin dilimlerinin ex vivo olarak nasıl hazırlanacağını açıklar ve kullanıcı dostu bir analiz boru hattı sağlar.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Bu protokol, postnatal beyin ve rostral göçmen akışı neuroblast göç yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için optimize edilmiş bir Organotipik dilim tahlil açıklamaktadır.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Mevcut video, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bireysel nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme gerçekleştirmek için elektroporasyon ve konfokal mikroskopi kombinasyonu yararlanır bir yöntem gösteriyor.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

Keşfedin fare akut beyin dilimlerinde elektroporasyon ve time-lapse görüntüleme ile neuroblast göçünü inceleme yöntemini. Bu teknik, doğum sonrası beyin gelişiminde hücre dinamiklerini analiz etmek için güçlü bir araç sunar.

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

Daha fazla video keşfet