Fibroblast aracılı Fibrin Jel Sıkıştırmayı Gözlemleme ve Ölçme

Bu prosedürün genel amacı, bir fibrin jel sisteminde hücre-matriks etkileşimlerinin fiber yeniden hizalanması ve matriks yeniden şekillenme faaliyetleri üzerindeki etkisini gözlemlemek ve analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle çevre kontrollü bir biyoreaktör içerisindeki lamel cam üzerine mikroboncuklar içeren üç boyutlu bir fibrin jelin polimerize edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, fibroblast kümelerini veya X eksplantlarını jelin yüzeyine geometrik desenler halinde yerleştirmek için kullanılan yüksek konsantrasyonlu bir hücre süspansiyonunun hazırlanmasıdır.

Ardından, örnek 48 saat boyunca her 15 dakikada bir diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kullanılarak görüntülenir. Son adım, dijital görüntü korelasyonu kullanarak jelin farklı bölgelerinden gelen gerinim şeklinde fibrin reorganizasyonunun ve yeniden şekillenmesinin derecesini ölçmektir. Nihayetinde, bu eksplant sistemi, hücrelerin basit geometrik düzenlere yerleştirilmesine olanak tanıyarak hücre kaynaklı matris yeniden şekillenmesi ve fiber yeniden hizalanmasının altında yatan mekanizmaların görselleştirilmesini ve incelenmesini kolaylaştırır.

Bu yöntem, çok mekansal ve zamansal mekanik uyaranların hücre davranışı üzerindeki etkileri ve bunların çevre doku matriksinde oluşturduğu değişiklikler gibi mekanik biyoloji alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu prosedürü, laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Arabic de Jesus gerçekleştirecek. 33,3 mg/mL'lik bir stok çözelti oluşturmak için fibrinojeni 37 °C'de önceden ısıtılmış salinde gece boyunca yavaşça çözün. İstenen geometri aralığını takip ederek her bir x eksplantının konumunu belirlemek için perfile bir şablon hazırlayın.

Her bir nokta yaklaşık bir ila iki milimetre aralıklarla yerleştirilir. Bu mesafe, eksplantlar arasında fiber hizalanmasının oluşturulması için ideal bir aralığa karşılık gelir. Ardından, biyoreaktörün tüm bileşenlerini %70 etanol kullanarak iyice temizleyin ve temizlenen bileşenleri, montajdan önce iki ila üç saat boyunca bir doku kültürü kabininin UV ışığı altında bekletin.

Biyoreaktör bileşenleri sterilize edildikten sonra, örneğin hazırlanacağı 60 milimetre çapındaki lam kapak camının altına şablonu bant yardımıyla sabitleyin. Ardından, sırasıyla mikroboncuk süspansiyonunu, fibrinojeni ve trombini hazırlayın. Stok çözeltiler için, mililitrede 10 milyon boncuk konsantrasyonu elde etmek amacıyla 0,017 mililitre Mikroboncuk stok çözeltisi ve 0,149 mililitre DMEM'yi bir mikro santrifüj tüpünde birleştirin.

Ardından, boncukları dağıtmak ve çözeltiyi homojenleştirmek için süspansiyonu 10 dakika boyunca sonike edin. 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 0,22 mililitre fibrinogen stok çözeltisi, 0,44 mililitre 20 milimolar HEPES tamponu ve 0,1667 mililitre mikroboncuk çözeltisi ekleyin. Bileşenleri nazikçe karıştırın ve ardından tüpü, ayrı bir 15 mililitrelik santrifüj tüpü içerisinde buz üzerine yerleştirin.

Birlikte karıştırılır. Saline içinde 25 units/mL konsantrasyonda çözünmüş 32.8 µL thrombin, 131 µL 20 mM HEPES tamponu ve 2.46 µL 2 M kalsiyum klorür.

Ardından, hazırlanan trombin ve fibrinogen çözeltilerini, çözelti homojen bir şekilde dağılana kadar beş ila 10 kez pipetleyerek dikkatlice karıştırın. Karıştırma sırasında pipeti tamamen boşaltmayarak karışıma hava kabarcığı girmesini en aza indirmeye çalışın. Karıştırılmış çözeltiyi mümkün olan en kısa sürede lamel cam üzerindeki sekiz milimetrekarelik PDMS kalıplara pipetleyin ve jelin oda sıcaklığında polimerleşmesini bekleyin.

Trombin eklenmesi, polimerizasyonu takiben çözeltinin yaklaşık 30 saniye içinde hızla jelleşmesini sağlayacaktır; biyoreaktörü kapatın ve hücre eksplantlarını hazırlayın. Bir T 75 flasktan tripsin kullanarak %70 ila %90 konfluense ulaşmış insan dermal fibroblast hücrelerini hasat edin ve bunları beş dakika boyunca 200 ×g'de santrifüjleyin. Biyoreaktörü bir biyogüvenlik kabinine taşıyın ve aseptik koşullar altında kapağı dikkatlice çıkarın. Ardından besiyerini aspire edin ve hücre peletini %10 FBS içeren DMEM içerisinde mililitrede 20 milyon hücre nihai konsantrasyonuna kadar resüspande edin.

Ardından, hücreleri bir mikro pipete yükleyip polimerize olmuş fibrin jel içine 0.3 µL hücre süspansiyonu enjekte ederek eksplantları oluşturun. Şablondaki deseni takip ederek, her bir eksplantın yaklaşık 6.000 hücre içermesini sağlayın. Eksplantlar jel üzerine yerleştirildikten sonra biyoreaktörü kapatın.

Ardından, ısıtma bloklarını yerleştirin ve termokuplları sıcaklık kontrol cihazına bağlayın. Sıcaklık kontrol cihazını 37 °C'ye ayarlayın ve hücrelerin çökelip fibrin matrisine tutunması için jelleri bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra; %5 CO₂ ile iki ila üç saat boyunca kondisyonize edilmiş, %10 fetal bovine serum, %1 penisilin streptomisin, %0,1 amfoterisin B ve 10 µg/mL aprotinin ile desteklenmiş yaklaşık 5 mL DMEM'i doğrudan biyoreaktör haznesine ekleyin.

Ardından biyoreaktörü yeniden kapatın. Biyoreaktörü tamamen doldurmak için giriş portundaki tırtıklı bağlantı elemanı üzerinden bir şırınga ile ek beş mililitre karbondioksit koşullandırılmış besiyeri ekleyin; oluşan tüm hava kabarcıklarını dikkatlice giderin. Ek %5 karbondioksit koşullandırılmış besiyeri ile doldurulmuş 10 mililitrelik veya 30 mililitrelik bir şırınga ile bir şırınga pompası kurun. Şırıngayı, luer lock uçlu steril tüplerle biyoreaktör kapağındaki giriş portuna doğrudan bağlayın.

Şırınga pompasındaki perfüzyon hızını dakikada 0,01 mililitre olarak ayarlayın. Ardından, modifiye edilmiş tüp parçalarını her iki çıkış portuna bağlayın ve uçlarını 100 mililitrelik bir behere yerleştirin. Atıkları toplamak için, biyoreaktör beslemesinde bir basınç farkı oluşmaması amacıyla giriş ve çıkış hatlarının yüksekliklerini bir laboratuvar krikosu kullanarak ayarlayın.

Deney boyunca biyoreaktöre taze %5 karbon dioksit ile koşullandırılmış besiyeri ekleyin. pH'ı korumak, besin maddeleri sağlamak ve atık ürünleri uzaklaştırmak için, besiyeri ile doldurulmuş 10 mililitrelik bir şırınga yaklaşık 16 saat yetecektir. 20 XDIC objektifini mikroskobun görüntüleme penceresinin altına yerleştirin ve polarizör analizör ile prizmanın yerinde olduğundan emin olun.

Ardından görüntüleme yazılımını açın. Objektifi üç x explan arasındaki alana odaklayın ve bu konumun X, Y ve Z koordinatlarını görüntüleme yazılımına kaydedin. X explan ile çevresindeki tüm alanı görüntülemek için, geniş bir görüntü elde etme seçeneğini belirleyin ve alanın boyutunu tanımlayın.

Bu işlem, belirtilen alan çevresinde birden fazla görüntünün elde edilmesine ve büyük bir mozaik görüntü oluşturulmasına olanak tanıyacaktır; ışık şiddetini ve pozlama süresini mümkün olan en düşük değerlere ayarlayın. Bu, hücreler, mikroboncuklar ve fibrin lifleri arasındaki ayrımı yapabilecek yeterli çözünürlüğü sağlarken, fototoksisite kaynaklı hücre ölümünü önlemeye yardımcı olacaktır. Bu özel deneyde, jeldeki ışık saçan boncukların yüksek yoğunluğu nedeniyle fibrin liflerinin görünür olmadığını unutmayın; fibrin liflerini gözlemlemek için boncuk yoğunluğunu veya jel kalınlığını azaltın.

Ardından, gerinim takibine başlayın. Öncelikle özel MATLAB kodu oluşturarak veya indirerek, jel boyunca referans noktaları olarak kullanılan mikroboncuklar aracılığıyla görüntüleri kaydedin. Görüntülerin kaydedilmesi, elde edilen görüntülerin her seferinde tam olarak aynı konumdan alındığından emin olmanızı sağlayacaktır.

Fiber yeniden hizalanması, her 15 dakikada bir karolu görüntüler yakalanarak gözlemlenmiştir. 48 saatlik bir süre boyunca, karolu görüntülerden münferit bölgeler çıkarılmış ve gerinim takip algoritması ile analiz edilmiştir. Mikroboncuk yer değiştirmelerinden yerel gerinimleri ölçmek için, kontur grafikleri kayışa karşılık gelen fiber yeniden hizalanma bölgesindeki maksimum asal gerinimin dağılımını göstermektedir.

Bu teknikte uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde işlem yaklaşık üç ila dört saatte tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından; doku yeniden şekillendirilmesinde hangi mekanobiyolojik yolakların yer aldığı ve bu süreçlerin çeşitli biyokimyasallar tarafından nasıl modüle edildiği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, kolajenin vele hücre iskeleti proteinlerinin floresan işaretlenmesi ile hücre göçünün kantifikasyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.