Name: Bir kültür Mesane EPİTELİ karşısında İnsan Nötrofil Göç Kantitatif Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Keşfedin mesane epiteli üzerinden insan nötrofil göçünü kantitatif değerlendirme yöntemini. Bu in vitro model, üriner sistem enfeksiyonlarında immün yanıtı incelemek için güvenilir bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sağlık (NIH) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen R01-DK080752 ve P50-DK064540 verir. Biz bu tahlili kurarak onun çabaları J. Loughman teşekkür ederim.

1.. 5637 Mesane Epitel hücrelerinin kültür Laminer akış doku kültürü kaputu UV radyasyonu ile hazırlanmış ve% 70 etanol ile sildi aşağıdaki adımları uygulayın. <ol><li> % 10 fetal sığır serumu (FBS) [adlandırılır RPMI +] ihtiva eden RPMI-1640 ortamı hazırlayın, filtre, su banyosu içinde bir 0.22 um gözenek boyutlu filtre kullanılarak sterilize ve sıcak 37 ° C. </li><li> 5637 hücre cryovial çözülme (American Type Culture Collection HTB-9, mesane karsinomu türetilmiş), 37 ° C su banyosu içinde. Hızla 20 ml RPMI + ihtiva eden bir 75 cm 2 doku kültürü şişesine çözülmüş hücreleri aktarın. </li><li> Hücreler, yaklaşık% 95 konfluent (kap basma-6 x 10 6 hücre), yaklaşık 4 gün kadar,% 5 CO2 ile nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de inkübe edin, şişeyi. </li><li> 5637 hücreleri altkültürü için: <ol><li> Şişeden gelen orta çıkarın. 10 ml Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin ile hücrelerin yıkayınOda sıcaklığında e (DPBS). </li><li> 6 ml ılık (37 ° C),% 0.05 tripsin, şişeye% 0.02 EDTA çözeltisi ekleyin ve 15 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile bir 15 ml konik bir tüp ve pelet hücreleri aktarın. Tripsin / EDTA çözeltisi çıkarın. </li><li> 20 ml RPMI + içeren yeni bir 75 cm 2 şişeye 6 ml RPMI + (10 6 hücre / ml), ve transfer 1 ml (10 6 hücre) &#39;de tekrar süspansiyon hücreleri. </li></ol></li><li> Hücreler% 95 izdiham ulaştığınızda her 4 gün hücrelerini altkültürü için adım 1.4 tekrarlayın ya. </li></ol> 2. Geçirgen Desteklenmesi Hakkındaki 5637 Hücreler tohumlama ve Yetiştirme Aseptik teknik kullanılarak doku kültürü kaputu aşağıdaki adımları uygulayın. En iyi sonuçlar için, az 10 altkültürler uğramıştır 5637 hücreleri kullanır. <ol><li> Steril forseps kullanılarak, steril bir 25 mm derin doku kültürü çanağı içinde geçirgen destek ters. </li><li&gt; 1.4.1-1.4.3 aşamalara göre% 95 birleştiği noktada 5637 hücre, 75 cm 2 şişe tripsinize edin. </li><li> 1000 ul pipet kullanarak, yumuşak bir hemositometre kullanılarak bir hücre sayımı ile belirlenir 3 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar ~ 2 ml RPMI + hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Membran dokunmadan her geçirgen destek hücre süspansiyonu (1.5 x 10 5 hücre) 50 ul uygulanır. Tabağına yerleştirin kapağı ve dikkatli bir şekilde en fazla 16 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de çanak yerleştirin. </li><li> Oyuk başına 0.6 ml RPMI + ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka içine steril forseps sağ geçirgen destek kullanılması. Her bir geçirgen desteğin üst haznesine 0.1 ml RPMI + ekleyin. % 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Her 2 günde bir ortam değiştirin. First, aspirat alt rezervuar ardından üst hazneden orta ve alt hazne (0.6 mi), ters sırayla taze RPMI + uygulamak ve daha sonra üst reservoir (0.1 ml). </li><li> Yedi gün 5637 hücreleri ile geçirgen destek tohumlama sonra, hücrelerin izdiham değerlendirmek. RPMI + (~ 0.35 mi) ile üst doldurun. Orta üst ve alt kapları arasındaki dengeye etmez, hücreler yeterince birleşmiş olan. </li></ol> 3. Bakteriyel inokulum hazırlanması <ol><li> Aseptik teknik kullanılarak, bir kap ile bir 250 ml şişeye uygun bir kültür et suyu ile 20 ml ekleyin. E. Luria-Bertani (LB) suyu kullanın coli kültürleri ve uygun olduğunda suyu için antibiyotik ekleyin. </li><li> Steril bir aşılama döngü kullanılarak, bir gliserol stokundan bakteri ya da bir çizgi plaka ile suyu inoküle. UPEC suşlar için, (tip 1 pili üretimini teşvik etmek için) çalkalama olmaksızın, yaklaşık olarak 16 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe bakteri kültürü. </li><li> Bir santrifüj tüpüne bakteri kültürü aktarın. 10 dakika boyunca 8000 x g&#39;de santrifüj ile bakteriler Pelet. </li><li> Süpernatant süzünVe ~ 10 9 CFU / ml &#39;ye eşdeğer, = 1.000 OD 600 için PBS içinde tekrar süspansiyon bakteri. <ol><li> Isı ile öldürülmüş bakteriyel uyarıcı oluşturmak için, bir kısım 30 dakika boyunca 55 ° C &#39;de yeniden süspansiyon haline getirilmiş bakteri (150 ul, örneğin 1.5 x 10 ~ 8 CFU) inkübe edilir. Bakteriyel ölüm onaylamak için ısı ile öldürülmüş süspansiyonu bir kısım Plate. </li></ol></li><li> Kullanımdan hemen önce, yeniden süspansiyon haline getirilmiş bakteriler (canlı ya da ısıyla öldürülmüş) 10 kat sıcak serum içermeyen RPMI 8 CFU / ml 10 için bir mikro tüp içerisinde [RPMI-adlandırılır] seyreltin. </li></ol> 4. Periferik Kan İnsan nötrofilleri İzolasyonu Yetişkin gönüllülerin kan toplanması ileri inceleme ve kurumsal inceleme kurulu onayı gerektirir. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin ve düzgün bir insan kanına maruz kalmaktan kaçınmak için tehlikeli madde atmayın. <ol><li> Sağlıklı yetişkin v venöz kan yaklaşık 25 miolunteer phlebotomy eğitimli personel tarafından 3 steril sodyum heparin içeren kan toplama tüpleri içine çekilmelidir. <ol><li> Sıkıca dirsek üstü, üst kol etrafında bir lastik turnike sarın. </li><li> Steril% 70 alkol silin kullanarak giriş siteyi, Antekübital fossayı dezenfekte edin. </li><li> Kanatlı bir kelebek iğne sistemine bir plastik tüp tutucu takın. </li><li> Yukarı bakacak şekilde 30 ° açı veya daha az, eğimin bir antekubital damara iğne takın. Kan bir hamle plastik boru göründüğünde iğne damarı delinmiş. </li><li> Plastik tüp yuvasına bir kan toplama tüpü yerleştirin. Ilk koleksiyonu tüp dolu olduğunda, ikinci toplama tüpü ile değiştirin. Üçüncü boru ile tekrarlayın. </li><li> Üçüncü toplama tüp, yaklaşık yarısı dolduğunda, turnike çıkarın. </li><li> Steril bir pamuk ile delinme siteyi örtün ve yavaş yavaş damardan iğneyi. İğne ve yer i üzerinde koruyucu kalkan kaydırınna biohazard konteyner diyez. </li><li> Ponksiyon basınç uygulayın. Yapışkan bandaj ile delinme site ve pamuk örtün. </li><li> Yavaşça heparin dağıtmak için kan toplama tüpleri ters. </li></ol></li></ol> Aseptik teknik kullanılarak doku kültürü kaputu aşağıdaki adımları uygulayın. <ol start="2"><li> 10 ml bir pipet kullanarak, yumuşak bir taze, steril bir 50 ml konik bir tüp için kan aktarın. % 3 eşdeğer bir hacim (a / h) dekstran% 0.9 NaCI ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. 20 dakika boyunca, oda sıcaklığında dik olarak tüp inkübe edin. </li><li> Alt katmanı bozmadan, dikkatle üst tabakası aspire ve yeni bir 50 ml konik tüp transfer. 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile Pelet hücreleri. Süpernatant atın. </li><li> Kan tekrar başlangıç ​​hacmine eşit% 0.9 NaCI hacminde hücre pelletini. </li><li> Hücre süspansiyonu, p altında yoğunluk santrifüj çözeltisi 10 ml Katmanİki faz arasındaki arayüz ayırma. Hiçbir frenli 30 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj. Süpernatant atın. </li><li> Arta kalan kırmızı kan hücreleri lize etmek için, 10 ml soğuk% 0.2 NaCl&#39;de hücre pelletini. 30 saniye boyunca inkübe ve sonra derhal izotonikliğe yeniden 10 ml soğuk% 1.6 NaCI ekleyin. </li><li> 6 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile Pelet hücreleri. Süpernatant atın. </li><li> Hücre topağı, kırmızı kan hücrelerinin lize, tipik olarak 3 tur arındırılmış olması görünene kadar yineleyin 4,6-4,7 adımları tekrarlayın. </li><li> 1000 ul pipet kullanarak, in, hücre pelletini, öncelikle PMN tekrar süspansiyon sıcak (37 ° C) RPMI-hücre bir hemasitometre kullanılarak saymak suretiyle belirlendi 10 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda,. Kullanılana kadar 37 ° C&#39;de hücreleri tutun. Sırasıyla, boyandıktan sonra, nükleer morfoloji tripan mavi dışlama ve görselleştirme ile değerlendirilen Tipik olarak, PMN canlılığı ve saflık&gt;% 99 bulunmaktadır. </li></ol> 5. Transuroepithelial Nötrofil Göç gibidemek Aseptik teknik kullanılarak doku kültürü kaputu aşağıdaki adımları uygulayın. Adım 2.7 &#39;de tespit edildiği üzere, birleşik 5637 hücre katmanları taşıyan sadece geçirgen destek kullanın. Ihtiva eden 24 oyuklu plakalar RPMI-olabilir, önceden hazırlanmış ve% 5 CO2, kullanıma kadar 37 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. <ol><li> Kısım 1, 24 oyuklu plakada oyuk başına RPMI-ısınmaya ml; geçirgen destek başına 3 kuyu hazırlar. </li><li> Geçirgen desteklerin üst ve alt haznelerden ortam aspire. </li><li> Steril forseps kullanılarak, aşama 5.1 &#39;de hazırlanan 24 plaka için geçirgen destek aktarın. Kuyudan kuyuya destekleri aktararak geçirgen özelliği destekleyip üç kez yıkayın. </li><li> Bakteriyel inokulum kullanılacak ise, steril bir 25 mm derin doku kültürü çanağı içinde geçirgen destek ters. Bir kimyasal çekicidir (örneğin, N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF) ya da IL-8) kullanılacak ise, 5.6 adıma geçin. </li><li> Canlı veya öldürülen Bact ile deneyler içinerial uyarı, 60 ul RPMI-(sahte enfeksiyon) veya bakteriyel aşı aşama 3.5 de hazırlanan (6 x 10 6 CFU) ile her bir geçirgen destek apikal yan inoküle. Tabağına yerleştirin ve kapağı, 1 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> , 24 oyuklu, düşük bağlanma plakasına oyuk RPMI-başına 0,6 ml ilave et; geçirgen destek oyuk başına 1 hazırlar. RPMI-to PMN girişi numaralandırmak 0.5 ml içeren 3 kuyu hazırlayın. <ol><li> Bir kimyasal çekicidir bakterilerin yerine kullanılıyorsa, aşama 5.6 &#39;de hazırlanan 24 oyuklu plaka RPMI-in 0.6 ml kemoatraktan ekleyin. </li></ol></li><li> 24-iyi düşük eki plaka içine doğru geçirgen destekler. </li><li> Her bir geçirgen desteğin üst haznesine (bazolateral taraf), aşama 4.9 de hazırlanan 0.1 ml PMN (10 6 PMN) ekleyin. Doğrudan 500 ul ihtiva eden gözlere 100 ul RPMI-PMN ekleyin. 1 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Steril forseps kullanarak, hafifçe kazıyınKuyunun kenarına karşı geçirgen destek zar apikal taraftan ek PMN kaldırmak ve daha sonra desteğin imha etmek. </li><li> Yavaşça 1000 ul pipet ucu ile de her bir alt kazıma ile PMN toplayın ve mikrofüj tüpler için PMN süspansiyonlar aktarın. </li><li> Hemasitometre kullanarak PMN Enumerate. </li><li> Alt haznede PMN toplam sayısını hesaplamak için, 6000 1 mm 2&#39;de PMN sayısı (100 nl) çarpın. PMN sayısı 10 6 giriş PMN normalize gibi veri girişi PMN bir yüzdesi olarak belirtilir, ya da olabilir. </li></ol>

<ol><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+chamber+in+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Orientation chamber in chemotaxis.</a> Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).</li>
<li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration%3A+implications+in+mediating+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li>
<li>Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+migration+of+neutrophils%3A+mechanisms+and+implications+for+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).</li>
<li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+human+neutrophil+migration+and+function+by+uropathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria.</a> Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).</li>
<li>Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YbcL+of+uropathogenic+Escherichia+coli+suppresses+transepithelial+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration.</a> Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).</li>
<li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+indoleamine+2%2C3-dioxygenase+by+uropathogenic+bacteria+attenuates+innate+responses+to+epithelial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection.</a> J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).</li>
<li>Haraoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+and+resistance+to+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection.</a> J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).</li>
<li>Billips, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+innate+immune+response+in+the+bladder+by+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).</li>
<li>Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+the+human+leukocyte+enzymes+myeloperoxidase+and+eosinophil+peroxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase.</a> J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).</li>
<li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li>
<li>Säve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+adenosine+A2A+receptors+inhibits+neutrophil+transuroepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration.</a> Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).</li>
<li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kültürlü bir mesane epitel hücre çizgisi ve yeni izole edilmiş insan PMN kullanarak, transuroepithelial nötrofil göçü bir in vitro bir model oluşturduk. Bu model idrar yolu enfeksiyonu (İYE) sırasında doğal immün yanıt, tipik UPEC 9 nedeniyle son derece yaygın bir bakteriyel enfeksiyon karmaşıklığı incelemek başlayan vesile olmuştur. Mesane ya da sistit enfeksiyon esnasında, mesane lümenine PMN işe bakteri açıklık 10 için gereklidir. Bir enflamatuar yanıtın karşısında bir dayanak oluşturma...

Vücuttaki hücrelerin hareketi, çoğunlukla uzun mesafeler boyunca, büyüme ve gelişmesi, yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkisi için gereklidir. Hücre göç karmaşık ve sinyal iletim ve sitoskeletal bileşenlerinin yeniden düzenlenmesi de dahil olmak üzere birçok farklı süreçlerin koordinasyonunu gerektirir. Hücreler tanımlanmış kimyasal geçişlerini (kemotaksı) doğru rastgele (kemokinezinin) hareket olarak yapabilirsiniz. Birçok teknik in vitro hücre göçü incelemek için geliştirilmiştir. En eski ve en yaygın teknik, Boyden haznesi, bir kemo-çekici maddenin alt bölmeye ve ilgi hücrelerinde yerleştirilen dikey iki odacıklı sistem oluşur, üst bölmede 1 yerleştirilir. Iki bölmeyi ayıran tanımlanan boyutta gözenekleri olan geçirgen filtre boyunca hücrelerin hareketi izlenir. Ek teknikler arasında Zigmond odası 2 ve Dunn odası da dahil olmak üzere, hücre göçü araştırmak için geliştirilmiştir3. Bu toplu yaklaşımlar çok farklı hücre tiplerinin hareketine önemli bakış açısı vermiştir. Kemokinezinin ve kemotaksi temel ilkelerini sorgulama ek olarak, iki odacık tahlilleri hücre dışı matris bileşenleri ve hem de endotelyal ve epitel hücre katmanları üzerinden hücre göçü soruşturma kolaylaştırmıştır. Diğer teknikler üzerinden iki oda sistemlerinin kullanılmasının bir avantajı, gözenekli membranı, kolajen ya da fibrinojen gibi proteinler ile kaplanabilir, ve hücre dışı matris-benzeri bariyer boyunca hücre göçü değerlendirilebilir olmasıdır. Buna ek olarak, kültürlenmiş hücre soyları yetiştirildi ve geçirgen destekler üzerinde farklı olabilir. Endotelyal hücre engeli boyunca hareketini araştırmak için, kültürlenmiş endotelyal hücreleri, geçirgen desteğin üst haznesinde tohumlanır ve büyütülür. Gibi bağışıklık hücreleri gibi hareketli hücreler, en karşısındaki alt rezervuara üst hazne ve göç eklenirfizyolojik apikal-to-bazolateral yönünde endotel bariyer görülmektedir. Bu model kan akışı bağışıklık hücrelerinin ekstravazasyonunu anlamada çok değerli olmuştur. Göç endotel aksine, bir epitel bariyerinden hücrelerinin hareketi tipik olarak bazolateral-apikal yönünde meydana gelir. In vitro olarak, bu etkinlik modellemek amacıyla, araştırmacılar, tohum ve geçirgen desteklerin alt kültürlenmiş epitelyum hücreleri büyür. Hareketli hücrelerin bazolateral-apikal yönü temsil eden epitelyal bariyer boyunca üst hazne ve göç, ilave edilir, izlenir. Transepitelyal göç tür modeller belirgin mukozal yüzeylerinde inflamatuar yanıtlar, özellikle akciğer olanlar ve 4,5 gut anlayışımıza katkıda bulunmuştur. Bunun aksine, idrar yolu epitel boyunca bağışıklık hücresi ticareti daha az dikkat çekmiştir. Bizim understandi ilerletmek içinbir mesane epitelyal bariyer 6 boyunca hareket, (nötrofil PMN) ng üropatojenik Escherichia coli (UPEC) ile enfeksiyon sırasında idrar yollarında doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin nedeniyle, polimorfonükleer lökosit, inceleme sağlayan bir in vitro tahlil, transuroepithelial nötrofil göçü deneyi geliştirilmiştir -8. Transepitelyal göç diğer iki odacıklı modellerinde olduğu gibi, kültürlenmiş insan mesane epitel hücreleri, geçirgen desteğin alt büyüdü ve birleşik epitel tabakalar oluştururlar. Toplardamar kanından izole İnsan nötrofilleri, epitel tabakanın bazolateral tarafına uygulanır ve fizyolojik olarak ilgili bazolateral-apikal yönünde epitel boyunca göç E farklı suşları ile enfeksiyona yanıt olarak ölçülür E. coli ya da kemo-çekici moleküllerinin varlığı. Pek çok araştırma ek hücre tiplerinin yokluğunda, nötrofil hareketi kemokinezinin ve kemotaksis hem odaklı vardı. Bu hesaba enfeksiyon sırasında mesane epitel hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki karmaşık etkileşimler alır gibi transuroepithelial nötrofil göçü deneyi avantajlıdır. Bu uysal in vitro model epitelyal yüzeylerde bağışıklık tepkilerinin ayrıntılı bir araştırma izin vermek için potansiyele sahiptir.

<table><tbody><tr><td>Transwell Kesici Uçlar (i.e.&nbsp; geçirgen destekler)</td> <td>Corning</td><td>3472</td><td>6,5 mm, 3 & mu; m gözenek, polyester membran ek BD</td></tr><tr><td>Vacutainer Kan Alma Tüpleri</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>366480</td><td>16 mm x 100 mm x 10 ml sodyum heparin içeren yeşil kapaklı tüpler</td></tr><tr><td>BD Safety-Lok Kan Alma ve İnfüzyon Seti</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>367281</td><td>21 G x 0.75 inç iğne x 12 tüp</td></tr><tr><td>BD Vacutainer tek kullanımlık, istiflenemeyen tutucu</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>364815</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4876</td><td>Leuconostoc mesenteroides</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS yoğunluk santrifüj çözümünden</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Düşük Bağlantı Plakaları</td><td>Corning</td><td>3473</td><td>24 kuyulu, şeffaf düz tabanlı</td></tr><tr><td>N-Formil-Met-Leu-Phe (fMLF)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506</td>, <td>DMSO'da 10 mM</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan CXCL8 / IL-8</td><td>R& D Systems</td><td>208-IL</td><td>, PBS'de 100 & mu'ya yeniden yapılandırıldı; g/ml</td></tr></tbody></table>

bir kültür mesane epİtelİ karşısında İnsan nötrofil göç kantitatif değerlendirilmesi

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Enflamasyon siteye periferiden bağışıklık hücrelerinin işe herhangi mukozal yüzeyde doğal immün yanıtta önemli bir adımdır. Mesane enfeksiyonu sırasında, polimorfonükleer lökosit (PMN, nötrofiller) kan göç ve mesane epitel dolaşırlar. Nötrofilik yanıt yokluğunda enfeksiyonu gidermek için başarısızlık mesane savunma PMN önemini göstermektedir. Kesesi epitelinin üropatojenik Escherichia coli (UPEC) kolonizasyonunu kolaylaştırmak için, idrar yolu enfeksiyonları (İYE) çoğunluğunun neden olan madde, kısmen tanımlanan çeşitli mekanizmalar kullanılarak akut bir enflamatuar yanıtı ıslatın. Bundan başka ev sahibi ve bakteriyel patojen arasındaki etkileşimi incelemek için, UPEC için tabii immun cevabın bu yönünün bir in vitro modeli geliştirmiştir. Transuroepithelial nötrofil göçü deneyinde, Boyden odasının bir varyasyon, kültürlü mesane epithElial hücreler, geçirgen desteğin alt akmak üzere yetiştirilmektedirler. PMN İnsan toplardamar kanından izole edilir ve mesane epitel hücre katmanlarının bazolateral tarafına uygulanır. Bakteriyel bir enfeksiyon ya da kemo-çekici moleküllere yanıt olarak, fizyolojik olarak ilgili bazolateral-apikal yönü temsil eden PMN geçişi, bir hemositometre kullanılarak numaralandırılmış. Bu model UPEC ve ökaryotik hücreler arası etkileşimleri incelemek için hem de PMN mesane epitel geçişi için moleküler şartları sorgulamak için kullanılabilir. Transuroepithelial nötrofil göçü modeli mesane UPEC için başlangıçtaki inflamatuar cevabın anlayışımızı ilerletmek olacaktır.

Transuroepithelial nötrofil göçü deneyi, çeşitli uyaranlara (Şekil 1B) karşılık olarak kültürlenmiş mesane epitel hücre tabakası boyunca insan PMN göç kantitatif bir değerlendirmesini sağlar. Protokol basit iken, PMN göçünü etkilemeye ve sonuç olarak bu tahlilin tekrarlanabilirliğini etkileyen değişkenler vardır. Teknik ve biyolojik çoğaltır arasındaki değişkenliği azaltmak için geçirgen destek ve PMN hazırlarken önlemler alınmalıdır. Örneğin, yeterli bir birleşik 5637 hücre tek tabakaları ihtiva eden g...

Biz üropatojenik Escherichia coli ile mesane enfeksiyonu sırasında akut inflamatuar yanıtın önemli bir bileşeni taklit eden bir in vitro modeli geliştirmiştir. Transuroepithelial nötrofil göçü deneyi, bakteriyel bir enfeksiyon ya da kemo-çekici maddelere cevap olarak, geçirgen destekler üzerinde kültürlenmiştir, mesane epiteli üzerinde insan nötrofil göçü kantitatif bir değerlendirmesini sağlar.

Bir kültür Mesane EPİTELİ karşısında İnsan Nötrofil Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Bu prosedürün genel amacı, bakteriyel enfeksiyon sırasında veya kemoatraktan moleküllere yanıt olarak mesane epitel bariyeri boyunca nötrofil göçü seviyesini nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle kültürlenmiş mesane epitel hücrelerinin geçirgen destekler üzerinde konfluens aşamasına gelene kadar büyütülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, mesane epitel hücrelerinin çeşitli bakterilerle enfekte edilmesi veya geçirgen desteklerin alt rezervuarına kemoatraktan moleküllerin uygulanmasıdır.Ardından, venöz kandan nötrofiller izole edilir ve geçirgen desteklerin üst rezervuarına uygulanır. Son adım, bir saat sonra alt rezervuardaki nötrofil sayısının bir hemositometre kullanılarak sayılmasıdır. Nihayetinde, transürotelyal nötrofil migrasyon testi, çeşitli uyaranların neden olduğu nötrofil migrasyonundaki farkları değerlendirmek için kullanılır.Bu yöntem, üriner sistem enfeksiyonu sırasındaki doğal bağışıklık yanıtının yönlerini anlamaya yardımcı olabilmesinin yanı sıra, diğer mukoza yüzeylerinde meydana gelen bakteriyel enfeksiyonlar da dahil olmak üzere diğer hastalıkları araştırmak için de kullanılabilir. Bu işlemi, steril pensler kullanarak septik bir teknikle, bir doku kültürü kabininde gerçekleştirin. Geçirgen destekleri, steril 25 milimetre derinliğindeki bir doku kültürü kabına ters çevirerek yerleştirin.En iyi sonuçlar için, 10 alt kültürden daha az kez tripsinize maruz kalmış 5 6 3 7 mesane epitel hücrelerini kullanın. Yazılı metne göre, %95 konfluense ulaşmış 5 6 3 7 hücrelerini içeren 75 santimetrekarelik bir flask kullanın. 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, hücreleri hücre sayımı ile belirlenen mililitre başına 3 milyon hücre konsantrasyonuna gelecek şekilde yaklaşık iki mililitre RPMI artı içerisinde nazikçe resüspande edin.Bir hemositometre kullanarak, membrana temas etmeden her bir geçirgen desteğe 50 µL hücre süspansiyonu uygulayın. Kapağı kabın üzerine kapatın ve kabı dikkatlice 37 °C sıcaklıkta ve %5CO2 ortamında 16 saatten fazla olmamak kaydıyla yerleştirin. Steril pensler kullanarak.Geçirgen destekleri, her kuyucuğunda 0,6 ml RPMI plus içeren 24 kuyucuklu bir plakaya yerleştirin. Plağı 37 °C ve %5 CO2 ortamında inkübe etmeden önce, her geçirgen desteğin üst rezervuarına 0,1 ml RPMI plus ekleyin. Besiyerini her iki günde bir, önce üst rezervuardaki ardından alt rezervuardaki besiyerini aspire ederek yenileyin.Ardından, ters sırada taze RPMI plus uygulayın; alt rezervuara 0,6 milliliters ve ardından üst rezervuara 0,1 milliliters ekleyin. Geçirgen desteklere 5 6 3 7 hücreleri ekildikten yedi gün sonra, üst rezervuarı 0,35 milliliters RPMI ile doldurarak hücrelerin konfluensini değerlendirin.Ayrıca, besiyeri üst ve alt rezervuarlar arasında dengelenmediğinde hücreler yeterince konfluent hale gelmiş demektir. Bakteriyel inokülumu hazırlayın ve metin protokolünde açıklandığı üzere bir doku kültürü davlumbazında yetişkin gönüllülerden kan toplayın. Kanı nazikçe taze, steril 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın.%0,9 Sodyum klorür içinde %3 dekstran'dan eşdeğer miktarda ekleyin. Tüpü, alt tabakayı bozmadan, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca dik konumda inkübe edin. Üst tabakayı dikkatlice aspire edin ve yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.Hücreleri 300 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün ve santrifüjleme sonrası süpernatantı dökün. Hücre peletini, başlangıç kan hacmine eşdeğer miktarda %0,9 sodyum klorür içinde yeniden süspande edin. Ardından, hücre süspansiyonunun altına 10 mililitre yoğunluk santrifüjleme çözeltisi ekleyin.İki faz arasındaki arayüzü koruyarak, kalan kırmızı kan hücrelerini lizlemeden önce süpernatantı uzaklaştırmak için 30 dakika boyunca 400 ×g hızda santrifüjleyin. Hücre peletini 10 mL soğuk %0,2 sodyum klorür içinde resüspande edin; 30 saniye inkübe ettikten sonra izotoniyi yeniden sağlamak için derhal 10 mL soğuk %1,6 sodyum klorür ekleyin. Hücreleri 300 ×g hızda altı dakika santrifüjle peletleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Bu adımları, hücre peleti kırmızı kan hücrelerinden arınmış görünene kadar tekrarlayın.Genellikle, 1000 µL'lik bir pipet kullanılarak üç tur liziz uygulanır. Hücre peletini (esas olarak polimorfonükleer lökositler veya PMN), hücre sayımıyla belirlenen şekilde mililitrede 10 milyon hücre konsantrasyonuna ulaşacak şekilde sıcak RPMI minus içerisinde resüspanse edin. Hücreleri, kullanım anına kadar 37 °C'de tutun; sayım için bir hemositometre kullanın.Sırasıyla tripan mavisi dışlama yöntemiyle değerlendirilen canlılık ve çekirdek morfolojisinin boyama sonrası görselleştirilmesiyle belirlenen saflık, tipik olarak %99'un üzerindedir. Migrasyon testi için yalnızca konfluen 5 6 3 7 hücre tabakaları içeren geçirgen destekler kullanın.Her kuyucuğa bir mililitre ılık RPMI minus ekleyin. Geçirgen destek başına üç kuyucuk hazırlanmış bir 24 kuyucuklu plakada, steril pensler kullanarak geçirgen desteklerin üst ve alt rezervuarlarındaki besiyerini aspire edin. Geçirgen destekleri 24 kuyucuklu plakaya aktarın ve destekleri kuyucuktan kuyucuğa taşıyarak üç kez yıkayın.Bakteriyel bir inokülum kullanılacaksa, geçirgen destekleri steril 25 milimetre derinliğinde bir doku kültürü kabına ters çevirerek yerleştirin. Canlı veya öldürülmüş bakteriyel stimülasyonların kullanıldığı deneyler için, her bir geçirgen desteğin apikal tarafını yalancı enfeksiyon için 60 µL RPMI ile veya hazırlanan bakteriyel inokülum ile inoküle edin. Kabın kapağını kapatın ve %5 CO2 içeren 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.Ardından, 24 kuyucuklu düşük tutunma plakasına, her kuyucuğa 0.6 mililitre RPMI minus ekleyin. Geçirgen destek başına bir kuyucuk hazırlayın. PMN girişini saymak için 0.5 mililitre RPMI minus içeren üç kuyucuk hazırlayın.Alternatif olarak, bakteriler yerine bir kemoatraktan kullanılıyorsa, kemoatraktanı hazırlanmış 24 kuyucuklu plaktaki 0,6 mililitre RPMI minus'a ekleyin. Her iki deney için bir sonraki adım, geçirgen destekleri 24 kuyucuklu düşük tutunmalı plaka içerisine yerleştirmektir. Ardından, hazırlanan PMN'den 0,1 mililitresini her bir geçirgen desteğin üst rezervuarına ekleyin.0,5 mL RPMI minus içeren kuyucuklara doğrudan 0,1 mL PMN ekleyin ve 37 °C'de, %5 CO2 ortamında bir saat boyunca inkübe edin. 1000 µL'lik bir pipet kullanın. Geçirgen desteğin membranının alt kısmını, alt rezervuardaki besiyeri ile steril pensler kullanarak durulayın ve membranı kuyucuğun kenarına nazikçe sürterek temizleyin.Apikal taraftaki fazla PMN'leri uzaklaştırmak için, her kuyucuğun dibini 1000 µL pipet ucuyla nazikçe sıyırarak PMN'leri toplayın. Ardından PMN süspansiyonlarını mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Alt rezervatordaki toplam PMN sayısını hesaplamak için bir hemositometre kullanarak PMN'leri sayın.Bir milimetrekaredeki PMN sayısını 6.000 ile çarpın. Veriler, başlangıç PMN sayısının yüzdesi olarak veya 10⁶'ya normalize edilmiş PMN sayıları olarak raporlanabilir. Bu videoda ana hatları verilen protokole detaylara dikkat ederek PMN girişi sağlamak; bakteriler ve kemoatraktan maddelerin yanı sıra non-patojenik e coli suşu MG 1655 enfeksiyonu dahil olmak üzere uyarılara yanıt olarak gelişen PMN migrasyonunun sayılmasını mümkün kılar.Isıyla öldürülmüş MG 1655 veya bir PEC mutantı, yalancı enfeksiyona veya bir sistit izolatı olan vahşi tip pec suşu UTI 89 ile yapılan enfeksiyona kıyasla anlamlı derecede daha fazla pm n migrasyonu uyandırır. Alt rezervuara kemotaktik çekicilerin, FMLF veya IL sekiz eklenmesi, yalancı işleme göre anlamlı derecede daha fazla PM ve migrasyonla sonuçlanır. Bu videoyu izledikten sonra, kemotaktik stimülilere yanıt olarak nötrofil migrasyonunun epitel bariyer üzerinden nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

quantitative-assessment-human-neutrophil-migration-across-cultured

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz aydınlık intravital mikroskopi, in vivo olarak nötrofil kemoatraktan kaynak yanıt nötrofil göçünü sırasında dinamik nötrofil-endotel hücre etkileşimleri ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Nötrofil intraluminal tarama, fare Cremaster'ın kas dokusu transendoteliyal göç ve kemotaksis zaman lapsed video ImageJ ile fotoğraf ve takip ile görüntülendi.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

Bu makale ilk umblikal damarlar, insan endotel hücreleri izole etmek için bir yordam açıklanır ve sonra akış koşullarında nötrofil göçü incelemek için bu hücreleri nasıl kullanılacağını gösterir. Camın optik karakteristikler ile bir polimer elde edilen bir düşük hacimli akış odası kullanılarak, nadir hücre popülasyonlarının canlı-hücre flüoresan görüntüleme da mümkündür.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Enfeksiyon bölgelerinde aktif endotele nötrofil bağlılık konağın inflamatuvar yanıt ayrılmaz bir bileşenidir. Için izin veren bir nötrofil bağlayıcı bir testtir Bu raporda...

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

Çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik nöral tepe hücre göçü potansiyelinin hassas miktar tayinine izin veren bir ex vivo hücre göçü deneyi mevcut.

Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili

Mukozal bakteriyel enfeksiyona yanıt olarak nötrofil trans-epitel göçü epitel yaralanmasına ve klinik hastalığa katkıda bulunur. Bu fenomeni düzenleyen moleküler mekanizmaların çözülmesine yönelik araştırmaları kolaylaştırmak için transwell filtrelerinde yetişen patojen, insan nötrofilleri ve polarize insan epitel hücre katmanlarını birleştiren bir in vitro model geliştirilmiştir.

Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Bu protokol, sağlam tekrarlanabilirlik ile, bütün haldeki kan, bir damla, insan nötrofil kemotaksisi ölçmek için tasarlanmış bir tahlil göstermektedir. Bu yaklaşım, nötrofil ayrılması için ihtiyaç dışı eden ve deney hazırlama zaman sadece birkaç dakika gerektirir. Mikroakışkan çip bebeklerde veya örnek hacmi sınırlıdır küçük memeliler, zamanla nötrofil kemotaksisinin tekrarlanan ölçü sağlar.

İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Lökositler paraselüler veya transselüler yolu kullanarak endotel tek tabaka çapraz. Biz endojen junctional dağıtım VE-kaderin ve PECAM-1 lökosit transendotelyal göç sırasında fizyolojik akış altında iki âlemden yolları arasında ayrım için takip basit bir deney geliştirildi.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Bu makale, tam kandan alınan çipte nötrofil izolasyonunu ve kemotaks testini tek bir mikroakışkan yonga üzerine entegre ederek hızlı bir nötrofıl kemotaksis tahlilini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır.

Hızla Nötrofil Kemotaksis Analizinde Doğrudan Bir Damla Kan Alınacak Bütünleşik Çip Yöntemi

Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Burada nötrofil göçünü ve infiltrasyonu hem in vivo hem de in vitro olarak değerlendirmek için üç yöntem sayılmaktadır. Bu yöntemler nötrofil göç hedefleyen umut verici terapötik keşfetmek için kullanılabilir.

Farelerde Nötrofillerin Göçü ve İnfiltrasyonunun Saptanması

Bu protokol, mekansal olarak kontrol edilen nötrofil sürüsü sağlayan biyopartikül mikrodizileri üretir. Nötrofillerin göç sırasında serbest bırakıldığı arabuluculara kolay erişim sağlar ve nicel görüntüleme analizine olanak sağlar.

İnsan Nötrofil Swarming in vitro Kemotaktik ve Moleküler Analizi için Biyopartikül Mikrodizileri

Keşfedin mesane epiteli üzerinden insan nötrofil göçünü kantitatif değerlendirme yöntemini. Bu in vitro model, üriner sistem enfeksiyonlarında immün yanıtı incelemek için güvenilir bir platform sunar.

Bir kültür Mesane EPİTELİ karşısında İnsan Nötrofil Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet