Larva Zebra Balıklarında İskelet Kası Defektlerinin Bikırılma ve Dokunma-Uyandırma Kaçış Yanıtı Deneyleri ile Analizi

Bu prosedürün genel amacı, yarı saydam zebra balığı larvalarında miyofibriler organizasyonun derecesini değerlendirmek ve her iki yöntem için taktil stimülasyona yanıt olarak yüzme mesafelerini nicelendirmektir. Bu, öncelikle zebra balıklarının çiftleştirilmesi ve ardından kas yapısını değerlendirmeye yönelik analizinin ikinci adımında canlı yumurtaların toplanmasıyla gerçekleştirilir. Kaplamalı, anestezi uygulanmış bir zebra balığı embriyosu, balığın vücudunun lateral ekseni boyunca yönlendirilmesi ve mümkün olduğunca düz bir konumda olması için bir stereo mikroskop tablası üzerindeki iki polarize lensin arasına doğrudan yerleştirilir.

Ardından çift kırılımlılık görselleştirilir ve kas bütünlüğü nicelendirilir. Dokunma ile uyarılan kaçış deneyesinin ikinci adımında, kaplamalı tek bir larva derin bir Petri kabına yerleştirilir ve ardından stereo mikroskobun görüş alanının merkezine getirilir. Bir böcek iğnesiyle kuyruğa dokunularak larvalara hafif bir duyusal uyarı verilir ve hayvanın tepkisi, embriyo yüzmeyi bırakana veya görüş alanının dışına çıkana kadar görüntülenir.

Sonuç olarak, kas organizasyonundaki farklılıklar ve lokomotor yanıtlar nicel olarak belirlenebilir. Bu non-invaziv tekniklerin temel avantajları, çok sayıda balığın hızla analiz edilebilmesi ve aynı balıktaki iskelet kası defektlerinin birkaç gün boyunca in vivo olarak izlenebilmesidir. Polarize lenslerin kurulumunun ve larvaların uygun yönlendirmeyle konumlandırılmasının görsel gösterimleri, başarının sağlanması açısından kritik öneme sahiptir.

Bu analizlerle birlikte, çiftleşen yetişkin balıklardan toplanan tüm kuluçkalardaki canlı olmayan yumurtaları temizleyin. Bunlar genellikle çıplak gözle beyaz ve opak görünür veya mikroskop altında düzensiz hücrelerden oluşan koyu bir küme şeklinde görülür; embriyoları döllenmeden üç ila yedi gün sonra daha fazla gelişim için inkübatöre geri yerleştirin. İlgilenilen embriyo koriyonunun içinde kalmışsa, embriyonun koriyonunda nazikçe bir yırtık oluşturmak için bir çift keskin pens kullanın ve ardından embriyo dışarı düşene kadar onu ters çevirin.

Kaplanmış embriyoların doğru şekilde konumlandırılmasına yardımcı olmak için onları trica ile anestezi edin ve ardından polarize ışık açısını ayarlamak için döndürülebilen polarize bir lens ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobunu hazırlayın. Embriyolar düzleştiğinde, mikroskop tablasına üst lensin hemen altına ikinci bir polarize lens yerleştirin ve embriyoları doğrudan bu ikinci lensin üzerine koyun. Ardından, incelenen her bir embriyo vücudunun lateral ekseni boyunca konumlandırılmalıdır.

Arka plan tamamen karanlık olana ve iki lensin polarizasyon ekseni birbirine 90 derece dik konuma gelene kadar, ilgilenilen embriyo görünür durumdayken üst lensi döndürün. Balıkların mümkün olduğunca düz yattıklarından emin olmak için onları hareket ettirin. Eğer bir balık kıvrılmışsa, yalnızca düz konumdaki segmentler polarize ışığı geçirecek ve parlağıyansıtmaya (birefringence) konu olacaktır.

Şimdi, vahşi tip balığın çift kırılma (birefringence) fenotipini gözlemleyin. Yüksek düzeyde organize olmuş iskelet kasları, miyofilamanlara paralel olan ışığın kırılma indisinin, bu yapılara dik olan polarize ışıktan daha yüksek olması nedeniyle parlak çift kırılma gösterir. Nörodejeneratif bir miyopatiyi veya gelişimsel bir kusuru düşündüren organize olmamış iskelet kasa sahip balıklar, genellikle genel bir çift kırılma azalması sergiler.

Kas distrofisinin karakteristiğidir. Genellikle, normal kas mimarisinin parlak alanları arasında kas dejenerasyonunu temsil eden karanlık alanlarla birlikte, yama benzeri bir çift kırılma (birefringence) paterni sergilerler. Çift kırılmanın miktarını belirlemek için balığın polarize ışık altında görüntülerini toplayın.

Görüntüleri tiff dosyaları olarak kaydedin. Çift kırılma (birefringence) görüntülerini bir görüntü işleme yazılım programında açın. Burada gösterildiği gibi ImageJ kullanılıyorsa, her görüntü için öncelikle, ölçüm yapılacak zebra balığı kas alanını belirlemek amacıyla poligon seçim aracını kullanarak balığın gövdesinin etrafına bir hat çizin.

Ardından, analiz açılır menüsü altından, görüntü için gerekli istatistikleri seçmek üzere ölçümleri ayarla seçeneğini belirleyin. Döllenmeden iki ila yedi gün sonrası için dokunma ile uyarılan kaçış davranışı testi düzeneğini kurmak amacıyla alan ortalama gri değeri ile minimum ve maksimum gri değeri kutucuklarını işaretleyin. Kaplaması yapılmış ilgili balıkları, her seferinde yalnızca bir embriyo ile çalışarak, derin Petri kaplarına tek tek yerleştirin.

Balığı, dijital kamera sistemiyle donatılmış bir stereo mikroskobun görüş alanına ortalayın ve 30 hertz veya daha yüksek kare hızlarını kullanarak sıralı görüntüleme işlemine başlayın. Ardından, bir böcek iğnesi kullanarak embriyonun kuyruğuna dokunup mekanik duyusal uyarıyı verin; embriyo yüzmeyi bıraktığında veya görüş alanının dışına çıktığında görüntülemeyi durdurun. Son olarak, sıralı görüntüleri bir video dosyasına dönüştürün veya zaman ayarlı (time-lapse) görüntülerin tekil karelerini analiz edin.

Çevrimdışı çift kırılma, canlı zebra balığı embriyolarındaki miyofibriler organizasyonun durumunu aydınlatmak için etkili, noninvaziv bir analiz yöntemi olarak kullanılabilir; döllenmeden sonra beşinci gündeki vahşi tip zebra balıkları, miyofilamanlarının düzenli dizilimi nedeniyle polarize ışık altında oldukça belirgin iskelet kasları sergiler. Buna karşılık, distroglikan veya DAG1 genindeki patojenik bir mutasyon için homozigot olan aynı yaştaki embriyolar, kas dejenerasyonu alanlarına işaret eden yamalı bir çift kırılma sergiler. Bu yama benzeri patern ve erken gelişim boyunca kas dejenerasyonunun hızlı ilerlemesi, diğer distrofik balık modelleriyle tutarlıdır.

Döllenmeden beş gün sonraki distrofik DAG one mutantlarının çift kırılımlılığının (birefringence) nicelendirilmesi, parlaklığın, yabani tip kardeşlerinde görülen maksimum çift kırılımlılığın %27,9 ± 5,3'üne kadar önemli ölçüde azaldığını belirlemiştir. Bu azalma, döllenmeden üç gün sonraki miyopatik mtm one morfantlarında gözlemlenen %52,4 ± 5,5'lik azalmadan daha şiddetlidir. Miyopatik balık modelleri, ana aksiyal iskelet kaslarında genellikle miyofibriler organizasyon bozukluğu olduğu ancak dejeneratif değişikliklerin kanıtı bulunmadığı için, yabani tipe kıyasla çift kırılımlılıkta genel bir azalma gösterme eğilimindedir. Dokunma odaklı kaçış davranışları, iskelet kası hastalığına sahip zebra balığı modellerinin lokomotor kusurlar ve yüzme zorlukları sergilediğini kanıtlamak için kullanılabilir.

Bu ilk video, vahşi tip zebra balıklarında dokunma ile tetiklenen kaçış davranışı analizini göstermektedir. Döllenmeden beş gün sonra, normal larvaların çok hızlı bir şekilde uzaklaştıklarına dikkat edin. Dokunmaya tepki olarak, bu ikinci videoda, birinci gün larvalarının dokunma ile tetiklenen kaçış davranışı kaydedilmiştir.

Döllenmeden sonraki beşinci gündeki mutant embriyoların dokunmaya karşı bozulmuş bir yanıt sergilediğine ve uyarılma sonrası görüş alanından çıkamadıklarına dikkat edin. Videolar daha sonra, DAG one mutantlarının taktil uyarılara yanıt olarak vahşi tip kontrollere kıyasla bozulmuş hareket sergilediğini doğrulamak için kare kare analiz edilmiştir. Her iki embriyo tipinin sabit bir zaman aralığında hareket edebildiği mesafelerin ortalaması alınmış ve bu durum DAG one mutantlarında azalmış motor fonksiyonu olduğunu göstermiştir.

Bu teknikler bir kez ustalıkla öğrenildiğinde, kısa bir süre içinde çok sayıda balık üzerinde uygulanabilir; bu durum, yüksek kapasiteli kimyasal veya mutajenez taramaları yürütürken kritik öneme sahiptir. Bu prosedürün ardından, iskelet kasındaki kusurlar moleküler ve yapısal düzeylerde incelemek için immünohistokimya veya elektron mikroskobisi gibi daha invaziv yaklaşımlar uygulanabilir.