Name: Larva Zebra Balıklarında İskelet Kası Defektlerinin Bikırılma ve Dokunma-Uyandırma Kaçış Yanıtı Deneyleri ile Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Keşfedin zebra balığı larvalarında iskelet kası defektlerini bikırılma ve dokunma-uyandırma kaçış yanıtı deneyleriyle analiz etme yöntemlerini. Bu invaziv olmayan teknikler kas bütünlüğünü canlı olarak değerlendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Behzad Moghadaszadeh'e çift kırılma görüntülerinin nicelleştirilmesindeki harika yardımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, ABD Musküler Distrofi Derneği (MDA201302) ve Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü (R01 AR044345) tarafından finanse edildi ve ayrıca A Foundation Building Strength, Cure CMD ve AUism Charitable Foundation'dan cömert destek aldı. VAG, Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü'nden K01 AR062601 tarafından desteklenmektedir ve LLS, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü'nden F31 NS081928 tarafından desteklenmektedir.

1. İskelet Kası Yapısının Birefringence ile İn vivo Analizi
<ol>
	<li>Beslenmeden sonra öğleden sonra geç saatlerde istenen zebra balığı hatlarının erkek(ler)ini dişi(ler)inden ayıran çiftleşme kafesleri hazırlayın.
	<ol>
		<li>Dişileri daha büyük göbekleri ve hafif mavi/beyaz renkleriyle ve erkekleri ince vücut şekilleri ve pembe/sarı tonlarıyla ayırt edin.</li>
		<li>Çift yönlü çaprazlamalarda (bir erkek ve bir kadın) başarı sadece %50 civarında olabilir. Daha yüksek bir başarı oranı için, bir erkeği 2-3 dişiyle çiftleştirin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ertesi sabah ışığın başlamasından kısa bir süre sonra kafes ayırıcıları çıkarın ve balığın rahatsız edilmeden yumurtlamasına izin verin.</li>
	<li>Tankın dibine yeterli sayıda döllenmiş yumurta bırakıldığında yumurtaları bir süzgeç kullanarak toplayın.</li>
	<li>Süzgeci balık suyuyla durulayarak embriyoları derin bir Petri kabına aktarın ve ana balığı tanklarına geri koyun. Embriyo tabaklarını 28,5 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>O gün veya ertesi sabah daha sonra cansız yumurtaları ve kalıntıları temizleyin ve daha fazla büyüme için embriyoları kuluçka makinesine geri koyun.</li>
	<li>Embriyolar / larvalar, döllenmeden 3-7 gün sonra (dpf) çift kırılmayı gözlemlemek için uygun yaşa ulaşır, çünkü 3 dpf'den önceki sonuçlar potansiyel olarak sınırlı kontrasttan muzdarip olabilir. Yabani tip embriyolar, döllenmeden 48-60 saat sonra (hpf) koryonlarından çıkar ve ardından vücut ekseni düzleşir. Geç yumurtadan çıkan vahşi tip veya mutant embriyolar manuel dekoryonasyon gerektirebilir.
	<ol>
		<li>Keskin forseps ile koryonda nazikçe bir yırtık yapın ve embriyonun düşmesi için ters çevirin.</li>
		<li>Teste başlamadan önce dekoryonlu embriyoların düzleşmesine izin verin.</li>
		<li>Doğru konumlandırılmalarına yardımcı olmak için embriyoları trikare (balık suyunda% 0.04) ile uyuşturun.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Polarize ışığın açısını ayarlamak için döndürülebilen polarize bir lense sahip bir diseksiyon mikroskobu takın (Şekil 1A).</li>
	<li>Dekoryonlu, anestezi uygulanmış embriyo (lar) ı doğrudan vücudun lateral ekseni boyunca ikinci bir polarize lensin üzerine yerleştirin. İkinci lens, mikroskop sahnesinde üst lensin altına yerleştirilmelidir (Şekil 1B). Plastik, kırılan ışığın iletimi için uygun bir ortam olmadığından, çift kırılma testi sırasında herhangi bir noktada plastik Petri kapları kullanmayın.</li>
	<li>İki merceğin polarizasyon eksenleri birbirinden 90° yönlendirilene ve arka plan tamamen karanlık olana kadar ilgilenilen embriyo görünürken üst merceği döndürün.</li>
	<li>Testin optimum çıktısı, balığın iki polarize lens arasındaki oryantasyonuna bağlıdır. Mümkün olduğunca düz yattıklarından emin olmak için balıkları hareket ettirin.
	<ol>
		<li>Balık kavisliyse, yalnızca bu düz yönelime sahip segmentler polarize ışığı geçecek ve çift kırılma sergileyecektir. Bu gibi durumlarda, düz alanlardaki çift kırılmayı ölçün ve vahşi tip balıklarda karşılık gelen alanın çift kırılmasını kaydedin (örneğin, hem vahşi tip hem de mutant balıklarda somitler 1-10).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Balığın iki kırılmalı fenotipini gözlemleyin.
	<ol>
		<li>Oldukça organize iskelet kasına sahip vahşi tip balıklar, miyofilamentlere paralel ışığın kırılma indisi, bu yapılara dik olan polarize ışıktan daha yüksek olduğundan, parlak çift kırılma gösterir.</li>
		<li>Dejeneratif olmayan bir miyopati veya gelişimsel bir kusuru düşündüren düzensiz iskelet kasına sahip balıklar tipik olarak iki kırılmada genel bir azalma gösterir.</li>
		<li>Kas distrofisinin karakteristiği olan düzensiz iskelet kası olan balıklar, genellikle normal kas mimarisinin parlak alanları arasında kas dejenerasyonunu temsil eden koyu alanlar ile yama benzeri bir çift kırılma paterni sergiler.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aynı pozlama ayarlarında ve büyütmede polarize ışık altında vahşi tür ve mutant balıkların görüntülerini çekerek çift kırılmayı ölçün. Görüntüleri .tiff dosyaları olarak kaydedin.
	<ol>
		<li>Çift kırılma görüntülerini ImageJ yazılımında açın (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>).</li>
		<li>Her görüntü için, araç çubuğundan "Poligon Seçimleri" seçeneğini kullanarak vücudun etrafına bir çizgi çizerek zebra balığı kasının alanını seçin.</li>
		<li>Görüntü için gerekli istatistikleri seçmek için "Analiz Et" açılır menüsü altındaki "Ölçümleri Ayarla"yı kullanın.
		<ol>
			<li>Minimum seçim, "Alan", "Ortalama gri değer" ve "Minimum ve maksimum gri değer" kutularının işaretli olmasını gerektirir.</li>
			<li>Maksimum >255 gri değeri, piksel doygunluğunu gösterir. Bu nedenle, maksimum gri değerleri 255'ten küçük olan görseller kullanın.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Seçilen alanla ortalama yoğunluğu normalleştirin ve her çift kırılma görüntüsü için aynı niceleme prosedürünü tekrarlayın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Dokunma ile Uyarılmış Kaçış Davranışı Testi
<ol>
	<li>Uygun zebra balığı hatlarının çiftleşme çiftlerini ayarlayın ve yukarıda 1.1-1.5 adımlarında açıklandığı gibi embriyoları toplayın.</li>
	<li>Döllenmeden 2-7 gün sonra, dekoryonlu embriyoları / larvaları ayrı ayrı derin bir Petri kabına veya çok kuyulu plakaların odalarına yerleştirin.</li>
	<li>Bir seferde sadece bir embriyo ile çalışarak, embriyoyu bir SPOT RT3 dijital kamera sistemi veya benzeri bir Nikon SMZ1500 stereomikroskobun görüş alanında ortalayın ve sıralı görüntülemeye başlayın.
	<ol>
		<li>Hem vahşi tip hem de mutant balıklar için aynı görüntüleme sıklığı kullanılmalıdır. Daha düşük hızlar genellikle vahşi tür balıkların hızlı yüzmelerini yakalamak için yeterli olmayacağından, >30 Hz kare hızları önerilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kuyruğa bir böcek iğnesi ile dokunarak embriyoya mekanosensoriyel uyaranlar verin.</li>
	<li>Embriyo yüzmeyi bıraktığında veya görüş alanından yüzerek çıktığında görüntülemeyi durdurun.</li>
	<li>SPOT 5.1 Advanced yazılımını kullanarak ardışık görüntüleri bir video dosyasına dönüştürün veya zaman atlamalı görüntülerin tek tek karelerini çevrimdışı olarak analiz edin. Benzer yazılım paketleri arasında Open Lab, NIS Elements veya ücretsiz olarak kullanılabilen ImageJ (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" title="">http://rsbweb.nih.gov/ij/) bulunur</a>.</li>
	<li>Birden fazla embriyoda dokunma ile uyarılmış yanıtı gerçekleştirerek yüzme davranışını ölçün.
	<ol>
		<li>Bu, yüzme müsabakasının başlangıç ve bitiş noktalarını işaretlemek için yazılım veya metrik bir cetvel kullanarak embriyoların sabit bir zaman aralığında yüzebildikleri mesafenin ortalaması alınarak elde edilebilir.</li>
		<li>Her deney tekrarı için yeni bir embriyo ile testi gerçekleştirerek embriyoların zamanla dokunma uyaranına alışmasını önleyin. Vahşi tip ve güvenilir mutant modellerdeki davranışlar yüksek oranda tekrarlanabilir olma eğilimindedir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130, 5851-5860 (2003).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).</li>
<li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+%CE%B12-deficient+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+myotubularin+function+results+in+T-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5 (2), e1000372(2009).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis. Model Mech. 5 (3), 389-396 (2012).</li>
<li>Ferrante, M. I., Kiff, R. M., Goulding, D. A., Stemple, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troponin+T+is+essential+for+sarcomere+assembly+in+zebrafish+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Troponin T is essential for sarcomere assembly in zebrafish skeletal muscle.</a> J. Cell Sci. 124 (4), 565-577 (2011).</li>
<li>Hawkins, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ATPase-dependent+chaperoning+activity+of+Hsp90a+regulates+thick+filament+formation+and+integration+during+skeletal+muscle+myofibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The ATPase-dependent chaperoning activity of Hsp90a regulates thick filament formation and integration during skeletal muscle myofibrillogenesis.</a> Development. 135 (6), 1147-1156 (2008).</li>
<li>Barbazuk, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+syntenic+relationship+of+the+zebrafish+and+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The syntenic relationship of the zebrafish and human genomes.</a> Genome Res. 10 (9), 1351-1358 (2000).</li>
<li>Schapira, G., Dreyfus, J. C., Joly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+flow+birefringence+of+myosin+as+a+result+of+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changes in the flow birefringence of myosin as a result of muscular atrophy.</a> Nature. 170 (4325), 494-495 (1952).</li>
<li>Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+behavioral+characteristics+of+the+startle+response+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Psychobiol%22%5BJournal%5D)">The development and behavioral characteristics of the startle response in zebrafish.</a> Dev. Psychobiol. 7, 47-60 (1974).</li>
<li>Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mauthner-initiated+startle+response+in+teleost+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Mauthner-initiated startle response in teleost fish.</a> J. Exp. Biol. 66, 65-81 (1977).</li>
<li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+relatively+relaxed+mutants+have+a+ryanodine+receptor+defect%2C+show+slow+swimming+and+provide+a+model+of+multi-minicore+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease.</a> Development. 134 (15), 2771-2781 (2007).</li>
<li>Wallace, G. Q., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+muscle+degeneration%2C+regeneration%2C+and+repair+in+the+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of muscle degeneration, regeneration, and repair in the muscular dystrophies.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 37-57 (2009).</li>
<li>Granato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+controlling+and+mediating+locomotion+behavior+of+the+zebrafish+embryo+and+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva.</a> Development. 123, 399-413 (1996).</li>
<li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+birefringence+readily+measures+the+level+of+muscle+damage+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (4), 785-788 (2012).</li>
<li>Low, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM7+is+required+within+zebrafish+sensory+neurons+for+the+activation+of+touch-evoked+escape+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TRPM7 is required within zebrafish sensory neurons for the activation of touch-evoked escape behaviors.</a> J. Neurosci. 31 (32), 11633-11644 (2011).</li>
<li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+identified+motoneurones+and+co-ordination+of+primary+and+secondary+motor+systems+during+zebrafish+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Function of identified motoneurones and co-ordination of primary and secondary motor systems during zebrafish swimming.</a> J. Physiol. 403, 73-89 (1988).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Primer nöromüsküler bozukluklar geleneksel olarak distrofik veya distrofik olmayan süreçler olarak sınıflandırılır. Kas distrofileri, miyofiber dejenerasyonu ve ardından tekrarlanan rejenerasyon turları ile karakterize edilir, bu da sonuçta fibroz ve yağ dokusu14 ile değiştirilen bir son aşama sürecine yol açar. Distrofik olmayan miyopatiler, aksine, nekroz veya rejeneratif değişikliklerle ilişkili değildir, ancak düzensiz miyofiberlere ve genel iskelet kası zayıflığına neden olur.
...

<table><tbody><tr><td>Trikain </td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Fischer Scientific</td><td>0875711Z</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Fischer Scientific</td><td>100189-588</td><td></td></tr><tr><td>Böcek pimi</td><td>Fischer Scientific</td><td>S67375</td><td></td></tr><tr><td>Polarize lensler</td><td>Ritz Kamera</td><td>Quantaray Tristar Optik C-PL 72mm</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Fischer Bilimsel</td><td>Isotemp İnkübatör Modeli 630D</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>SMZ 1500</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Arıza Tespit Cihazları A.Ş.</td><td>SPOT RT3</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme yazılımı</td><td>Teşhis Cihazları A.Ş.</td><td>SPOT 5.1 İleri Düzey</td><td></td></tr></tbody></table>

larva zebra balıklarında İskelet kası defektlerinin bikırılma ve dokunma-uyandırma kaçış yanıtı deneyleri ile analizi

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebra balığı (Danio rerio), memelilerde yüksek genomik ve yapısal koruma nedeniyle kas distrofileri1-3, konjenital miyopatiler4,5 ve sarkomerik düzenektekibozulmalar 6,7 dahil olmak üzere iskelet kasını etkileyen insan hastalıklarını modellemek için özellikle etkili bir araç haline gelmiştir. Zebra balığında kas düzensizliği ve lokomotif bozukluğu, döllenmeden sonraki ilk birkaç gün içinde hızlı bir şekilde değerlendirilebilir. Zebra balıklarında iskelet kası kusurlarını karakterize etmeye yardımcı olan iki tahlil, çift kırılma (yapısal) ve dokunma ile uyarılmış kaçış tepkisidir (davranışsal).
Çift kırılma, ışığın düzenli maddeden geçerken döndürüldüğü fiziksel bir özelliktir, örneğin kas sarkomerlerinin sahte kristal dizisi9. Gelişimin erken dönemlerinde yarı saydam zebra balığı larvalarında kas bütünlüğünü değerlendirmek için basit, invaziv olmayan bir yaklaşımdır. Yüksek derecede organize iskelet kasına sahip vahşi tip zebra balığı, iki polarize ışık filtresi arasında görselleştirildiğinde karanlık bir arka planın ortasında çok parlak görünürken, kas mutantları, modelledikleri birincil kas bozukluğuna özgü çift kırılma modellerine sahiptir. Kas distrofilerini modelleyen zebra balıkları, miyofiber dejenerasyonu ve ardından tekrarlanan rejenerasyon turları ile karakterize hastalıklar, polarize ışık altında iskelet kasında dejeneratif koyu lekeler sergiler. Distrofik olmayan miyopatiler nekroz veya rejeneratif değişikliklerle ilişkili değildir, ancak düzensiz miyolifler ve iskelet kası güçsüzlüğü ile sonuçlanır. Miyopatik zebra balığı tipik olarak, sarkomerlerin düzensizliğini yansıtan çift kırılmada genel bir azalma gösterir.
Dokunma ile uyarılmış kaçış testi, dokunsal stimülasyon10-12'ye yanıt olarak bir embriyonun yüzme davranışını gözlemlemeyi içerir. Yabani tip larvalarla karşılaştırıldığında, mutant larvalar sıklıkla zayıf bir kaçış kasılması gösterir, ardından yavaş yüzme veya larvaları kısa bir mesafeden daha fazla itemeyen başka bir tür bozulmuş hareket görülür12. Bu tahlillerin avantajı, aynı balık türündeki hastalık ilerlemesinin birkaç gün boyunca in vivo olarak izlenebilmesi ve çok sayıda balığın daha yüksek omurgalılara göre kısa sürede analiz edilebilmesidir.

Çift kırılma (birefringence), canlı zebra balığı embriyolarındaki miyofibriller organizasyonun durumunu aydınlatmak için etkili ve noninvaziv bir analiz yöntemi olarak kullanılabilir. Yabanıl tip zebra balıklarının yanı sıra iskelet kası gelişimi ve fonksiyonu için kritik olan genlerin ekspresyonu azalmış zebra balıklarına örnekler sunulmuştur. 5 dpf'deki yabanıl tip zebra balıkları, miyofilamanların düzenli dizilimi nedeniyle polarize ışık altında yüksek derecede çift kırılmalı iskelet kasları sergiler (Şekil 2A...

Zebra balığı artık kas distrofilerini, konjenital miyopatileri ve ilgili nöromüsküler hastalıkları modellemek için yerleşik ve güçlü bir araçtır. Çift kırılma ve dokunma ile uyarılmış kaçış davranışı, zebra balığı embriyolarının erken gelişim sırasında kas düzensizliği ve lokomotif bozukluğunun derecesini belirlemek için kullanılan iki yaygın noninvaziv testtir.

Larva Zebra Balıklarında İskelet Kası Defektlerinin Bikırılma ve Dokunma-Uyandırma Kaçış Yanıtı Deneyleri ile Analizi

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Bu prosedürün genel amacı, yarı saydam zebra balığı larvalarında miyofibriler organizasyonun derecesini değerlendirmek ve her iki yöntem için taktil stimülasyona yanıt olarak yüzme mesafelerini nicelendirmektir. Bu, öncelikle zebra balıklarının çiftleştirilmesi ve ardından kas yapısını değerlendirmeye yönelik analizinin ikinci adımında canlı yumurtaların toplanmasıyla gerçekleştirilir. Kaplamalı, anestezi uygulanmış bir zebra balığı embriyosu, balığın vücudunun lateral ekseni boyunca yönlendirilmesi ve mümkün olduğunca düz bir konumda olması için bir stereo mikroskop tablası üzerindeki iki polarize lensin arasına doğrudan yerleştirilir.Ardından çift kırılımlılık görselleştirilir ve kas bütünlüğü nicelendirilir. Dokunma ile uyarılan kaçış deneyesinin ikinci adımında, kaplamalı tek bir larva derin bir Petri kabına yerleştirilir ve ardından stereo mikroskobun görüş alanının merkezine getirilir. Bir böcek iğnesiyle kuyruğa dokunularak larvalara hafif bir duyusal uyarı verilir ve hayvanın tepkisi, embriyo yüzmeyi bırakana veya görüş alanının dışına çıkana kadar görüntülenir.Sonuç olarak, kas organizasyonundaki farklılıklar ve lokomotor yanıtlar nicel olarak belirlenebilir. Bu non-invaziv tekniklerin temel avantajları, çok sayıda balığın hızla analiz edilebilmesi ve aynı balıktaki iskelet kası defektlerinin birkaç gün boyunca in vivo olarak izlenebilmesidir. Polarize lenslerin kurulumunun ve larvaların uygun yönlendirmeyle konumlandırılmasının görsel gösterimleri, başarının sağlanması açısından kritik öneme sahiptir.Bu analizlerle birlikte, çiftleşen yetişkin balıklardan toplanan tüm kuluçkalardaki canlı olmayan yumurtaları temizleyin. Bunlar genellikle çıplak gözle beyaz ve opak görünür veya mikroskop altında düzensiz hücrelerden oluşan koyu bir küme şeklinde görülür; embriyoları döllenmeden üç ila yedi gün sonra daha fazla gelişim için inkübatöre geri yerleştirin. İlgilenilen embriyo koriyonunun içinde kalmışsa, embriyonun koriyonunda nazikçe bir yırtık oluşturmak için bir çift keskin pens kullanın ve ardından embriyo dışarı düşene kadar onu ters çevirin.Kaplanmış embriyoların doğru şekilde konumlandırılmasına yardımcı olmak için onları trica ile anestezi edin ve ardından polarize ışık açısını ayarlamak için döndürülebilen polarize bir lens ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobunu hazırlayın. Embriyolar düzleştiğinde, mikroskop tablasına üst lensin hemen altına ikinci bir polarize lens yerleştirin ve embriyoları doğrudan bu ikinci lensin üzerine koyun. Ardından, incelenen her bir embriyo vücudunun lateral ekseni boyunca konumlandırılmalıdır.Arka plan tamamen karanlık olana ve iki lensin polarizasyon ekseni birbirine 90 derece dik konuma gelene kadar, ilgilenilen embriyo görünür durumdayken üst lensi döndürün. Balıkların mümkün olduğunca düz yattıklarından emin olmak için onları hareket ettirin. Eğer bir balık kıvrılmışsa, yalnızca düz konumdaki segmentler polarize ışığı geçirecek ve parlağıyansıtmaya (birefringence) konu olacaktır.Şimdi, vahşi tip balığın çift kırılma (birefringence) fenotipini gözlemleyin. Yüksek düzeyde organize olmuş iskelet kasları, miyofilamanlara paralel olan ışığın kırılma indisinin, bu yapılara dik olan polarize ışıktan daha yüksek olması nedeniyle parlak çift kırılma gösterir. Nörodejeneratif bir miyopatiyi veya gelişimsel bir kusuru düşündüren organize olmamış iskelet kasa sahip balıklar, genellikle genel bir çift kırılma azalması sergiler.Kas distrofisinin karakteristiğidir. Genellikle, normal kas mimarisinin parlak alanları arasında kas dejenerasyonunu temsil eden karanlık alanlarla birlikte, yama benzeri bir çift kırılma (birefringence) paterni sergilerler. Çift kırılmanın miktarını belirlemek için balığın polarize ışık altında görüntülerini toplayın.Görüntüleri tiff dosyaları olarak kaydedin. Çift kırılma (birefringence) görüntülerini bir görüntü işleme yazılım programında açın. Burada gösterildiği gibi ImageJ kullanılıyorsa, her görüntü için öncelikle, ölçüm yapılacak zebra balığı kas alanını belirlemek amacıyla poligon seçim aracını kullanarak balığın gövdesinin etrafına bir hat çizin.Ardından, analiz açılır menüsü altından, görüntü için gerekli istatistikleri seçmek üzere ölçümleri ayarla seçeneğini belirleyin. Döllenmeden iki ila yedi gün sonrası için dokunma ile uyarılan kaçış davranışı testi düzeneğini kurmak amacıyla alan ortalama gri değeri ile minimum ve maksimum gri değeri kutucuklarını işaretleyin. Kaplaması yapılmış ilgili balıkları, her seferinde yalnızca bir embriyo ile çalışarak, derin Petri kaplarına tek tek yerleştirin.Balığı, dijital kamera sistemiyle donatılmış bir stereo mikroskobun görüş alanına ortalayın ve 30 hertz veya daha yüksek kare hızlarını kullanarak sıralı görüntüleme işlemine başlayın. Ardından, bir böcek iğnesi kullanarak embriyonun kuyruğuna dokunup mekanik duyusal uyarıyı verin; embriyo yüzmeyi bıraktığında veya görüş alanının dışına çıktığında görüntülemeyi durdurun. Son olarak, sıralı görüntüleri bir video dosyasına dönüştürün veya zaman ayarlı (time-lapse) görüntülerin tekil karelerini analiz edin.Çevrimdışı çift kırılma, canlı zebra balığı embriyolarındaki miyofibriler organizasyonun durumunu aydınlatmak için etkili, noninvaziv bir analiz yöntemi olarak kullanılabilir; döllenmeden sonra beşinci gündeki vahşi tip zebra balıkları, miyofilamanlarının düzenli dizilimi nedeniyle polarize ışık altında oldukça belirgin iskelet kasları sergiler. Buna karşılık, distroglikan veya DAG1 genindeki patojenik bir mutasyon için homozigot olan aynı yaştaki embriyolar, kas dejenerasyonu alanlarına işaret eden yamalı bir çift kırılma sergiler. Bu yama benzeri patern ve erken gelişim boyunca kas dejenerasyonunun hızlı ilerlemesi, diğer distrofik balık modelleriyle tutarlıdır.Döllenmeden beş gün sonraki distrofik DAG one mutantlarının çift kırılımlılığının (birefringence) nicelendirilmesi, parlaklığın, yabani tip kardeşlerinde görülen maksimum çift kırılımlılığın %27,9 ± 5,3'üne kadar önemli ölçüde azaldığını belirlemiştir. Bu azalma, döllenmeden üç gün sonraki miyopatik mtm one morfantlarında gözlemlenen %52,4 ± 5,5'lik azalmadan daha şiddetlidir. Miyopatik balık modelleri, ana aksiyal iskelet kaslarında genellikle miyofibriler organizasyon bozukluğu olduğu ancak dejeneratif değişikliklerin kanıtı bulunmadığı için, yabani tipe kıyasla çift kırılımlılıkta genel bir azalma gösterme eğilimindedir. Dokunma odaklı kaçış davranışları, iskelet kası hastalığına sahip zebra balığı modellerinin lokomotor kusurlar ve yüzme zorlukları sergilediğini kanıtlamak için kullanılabilir.Bu ilk video, vahşi tip zebra balıklarında dokunma ile tetiklenen kaçış davranışı analizini göstermektedir. Döllenmeden beş gün sonra, normal larvaların çok hızlı bir şekilde uzaklaştıklarına dikkat edin. Dokunmaya tepki olarak, bu ikinci videoda, birinci gün larvalarının dokunma ile tetiklenen kaçış davranışı kaydedilmiştir.Döllenmeden sonraki beşinci gündeki mutant embriyoların dokunmaya karşı bozulmuş bir yanıt sergilediğine ve uyarılma sonrası görüş alanından çıkamadıklarına dikkat edin. Videolar daha sonra, DAG one mutantlarının taktil uyarılara yanıt olarak vahşi tip kontrollere kıyasla bozulmuş hareket sergilediğini doğrulamak için kare kare analiz edilmiştir. Her iki embriyo tipinin sabit bir zaman aralığında hareket edebildiği mesafelerin ortalaması alınmış ve bu durum DAG one mutantlarında azalmış motor fonksiyonu olduğunu göstermiştir.Bu teknikler bir kez ustalıkla öğrenildiğinde, kısa bir süre içinde çok sayıda balık üzerinde uygulanabilir; bu durum, yüksek kapasiteli kimyasal veya mutajenez taramaları yürütürken kritik öneme sahiptir. Bu prosedürün ardından, iskelet kasındaki kusurlar moleküler ve yapısal düzeylerde incelemek için immünohistokimya veya elektron mikroskobisi gibi daha invaziv yaklaşımlar uygulanabilir.

analysis-skeletal-muscle-defects-larval-zebrafish-birefringence-touch

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Larval Zebrafish'lerde Birefringence ve Dokunma-uyandıran Kaçış Tepkisi Testleriyle İskelet Kas Kusurlarının Analizi

Bu videoda, zebra balığı larvalarının dokunma uyaranlarına verdiği tepkiyi ölçen dokunma-uyarma tepkisi testi açıklanmaktadır.

Kaçış Tepkisi Testi: Zebra Balığı Larvalarının Dokunma Uyaranlarına Tepkisini İncelemek İçin Bir Yöntem

Video, zebra balığı larvalarının kaçınma ve timotaksis testini anlatıyor. Video, zebra balığı larvalarının görsel caydırıcı uyarana yanıt olarak davranışlarını inceler.

Zebra Balığı Kaçınma ve Timotaksis Deneyi: Caydırıcı Görsel Uyarana Yanıt Olarak Larva Davranışını İncelemek İçin Yüksek Verimli Bir Yöntem

Zebra balığı iskelet kası bozuklukları insan modellemek için ortaya çıkan bir sistemdir. Biz embriyonik ve larva zebrafish iskelet kası myofibers izole etmek için hızlı ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, tek bir iskelet kas lifi morfolojisi çalışma için uygun olan yüksek yoğunluklu miyofiberde oluşan hazırlama, protein hücre içi lokalizasyonu ve kas fizyolojisi verir.

Disosiye Müstahzarlar gelen Embriyonik ve larval Zebra balığı İskelet myofibers Analizi

Kuvvet ölçümleri geliştirme, yaralanma, hastalık, tedavi ya da kimyasal toksisite nedeniyle kas fonksiyonu değişiklikleri göstermek için kullanılabilir. Bu video, Zebra balığı larva gövde kas bir maksimal kasılma sırasında güç ölçmek için bir yöntem ortaya koymaktadır.

Zebra balığı Larva kas fonksiyonu değerlendirmek için daralma sırasında Kuvvet Ölçümü

Zebra balığı larvalarının mikromanipülasyon ve elektroretinografi tekniklerini kullanarak elektroretinografik (ERG) analizi için bir yöntem sunuyoruz. Bu, zebra balığı larvalarının in vivo görsel işlevini test etmek için basit ve anlaşılır bir yöntemdir.

Zebra balığı Larva Görsel Tepki Elektroetinogram Analizi

Bu çalışmada, zebra balığı larvaları üzerinde Evans Mavi Boya (EBD) analizi yapmak için basit bir yöntem açıklıyoruz.  Bu teknik, iskelet kası bütünlüğünün karakterizasyonu ve zebra balığı kas distrofisi modellerinin tanımlanması için güçlü bir araçtır ve yeni terapötiklerin geliştirilmesi için değerli bir yöntemdir.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

Zebra balığı, kas fonksiyonlarını ve hastalıklarını incelemek için mükemmel bir modeldir. Erken embriyogenez sırasında zebra balığı düzenli kas kasılmalarına başlar ve ritmik yüzme davranışı üretir ve bu da kas bozulduğunda değişir. Burada, yüzme performansını kas fonksiyonunun bir ölçüsü olarak incelemek için dokunma ile uyarılmış bir tepki ve hareket testini açıklıyoruz.

Dokunmatik uyarılmış Yanıt ve Hareket Deneyleri kullanarak Zebra balığı kas Performans ve fonksiyonunu değerlendirmek için

Burada, DEPDC5 geninin geçici inhibisyonundan kaynaklanan bir zebra balığı epilepsi modelinin geliştirilmesi ve karakterizasyonu için bir protokol sunuyoruz.

Zebra balığı epilepsi modelinde davranışsal ve fizyolojik analiz

İskelet kas rejenerasyonu, kas distrofisi gibi birçok kas hastalığında bozulan doku yerleşik kas kök hücreleri tarafından yönlendirilir ve bu da kasın yenilenememesi ile sonuçlanır. Burada, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesinin incelenmesini sağlayan bir protokol açıklıyoruz.

Kas Hastalığının Zebra Balığı Modellerinde Kas Yenilenmesinin İncelenmesi

Mikrodolaşımında gözlem için yeni bir çok yönlü bir yöntem sunulmuştur. Bu uzun vadeli bir gözlem için uygun olduğu düşünülen ve pharmacophysiological veya moleküler biyolojik müdahaleler ile birlikte.

İskelet kas-içi hayati Mikroskopi in vivo Mikro sirkülasyon Ölçümü

Keşfedin zebra balığı larvalarında iskelet kası defektlerini bikırılma ve dokunma-uyandırma kaçış yanıtı deneyleriyle analiz etme yöntemlerini. Bu invaziv olmayan teknikler kas bütünlüğünü canlı olarak değerlendirmeyi sağlar.

Larva Zebra Balıklarında İskelet Kası Defektlerinin Bikırılma ve Dokunma-Uyandırma Kaçış Yanıtı Deneyleri ile Analizi

Daha fazla video keşfet