Bir olarak beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cend) olarak gerin

Bu prosedürün genel amacı, travmatik beyin hasarı modeli olarak gerilme yaralanmasının kullanımını göstermektir. Bu işlem, öncelikle mikrodamar endotel hücrelerinin esnek tabanlı kuyucuklarda kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, kültür ortamındaki fetal dana serumu miktarının azaltılmasıyla hücrelerin farklılaştırılmasıdır.

Ardından, hücreler hücre gerdirme cihazı kullanılarak hasara uğratılır. Son adım, hücrelerdeki hasarın derecesini değerlendirmektir. Nihayetinde, beyin endotel hücrelerinde gerilme kaynaklı hasar, kan-beyin bariyerindeki hasarı in vitro ortamda göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin etkileri, denizel beyin endotel hücrelerinin gerilme yaralanmasını kullanarak kan-beyin bariyerinde TBI sırasında meydana gelen gerçek etkiyi modellemesi nedeniyle travmatik beyin hasarının tedavisine kadar uzanmaktadır. Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Dr. Elaine Salvador gösterecektir. Bu prosedüre, denizel beyin mikrovasküler endotel hücrelerini bir T 75 kültür flaskında kültüre ederek başlayın.

Konfluens sağlanana kadar besiyerini haftada iki kez değiştirin. Ardından, hücreleri PBS ile yıkayın. Sonrasında PBS'yi ve tripsini uzaklaştırın.

Hücreleri iki mililitre ılık trypsin EDTA çözeltisi ile analiz edin. Hücreleri 37 °C'de beş dakika boyunca veya hücre tabakası dağılana kadar inkübe edin. Ardından, hücrelerin üzerine sekiz mililitre kültür ortamı ekleyin ve hücreleri ayırmak için flaska birkaç kez hafifçe vurun.

Hücrelerin flasktan tamamen ayrıldığından emin olmak için hücreleri mikroskop altında inceleyin. Ardından, ayrılmış hücrelerin bulunduğu medyumu pipetle yukarı aşağı çekerek karıştırın. Sonrasında hücre süspansiyonunu karıştırmak için flaskı dairesel hareketlerle sallayın.

Hemo sitometreye 20 µL hücre süspansiyonu ekleyin ve hücre sayısını sayın. Hücre yoğunluğunu belirleyin ve kuyucuk başına 20.000 hücre olduğunu görün. Ardından, hücre süspansiyonunu kolajene aktarın.

Önceden kodlanmış altı adet esnek tabanlı kültür plakasına, kuyuk başına toplam 3 mL hacminde ekim yapın. Kültür ortamını haftada iki kez değiştirin ve hücreleri, konfluens gerçekleşene kadar bir hafta boyunca 37 °C'de büyütün.

Hücre diferansiyasyonu için, hücrelerin kültür ortamını diferansiyasyon ortamı ile değiştirin ve hücreleri 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. Bu işlemde, hücre hasar kontrol cihazını açın ve gecikmeyi 50 ms olarak ayarlayın. Ardından, regülatör basıncını 15 PSI'ye ayarlayın ve kaydedilen tepe basıncı stabilize olana kadar tetikleyiciye birkaç kez basın.

Ardından regülatör basıncını istenen değere ayarlayın. Bundan sonra, altı kuyucuklu esnek tabanlı kültür plağını tepsi tutucusuna yerleştirin. Kuyucuk seçicinin doğru kuyucuk boyutuna ayarlandığından emin olun.

Ardından adaptör tıpasını sıkıca yerleştirin, tıpayı bir elinizle sıkıca tutarken diğer elinizle tetiğe basın ve sonrasında oluşan pik basıncı kaydedin. Plakayı hemen istenen süre boyunca 37 °C'lik inkübatöre geri koyun veya DI alım analizi ile gerilme hasarını değerlendirmek için sonraki deneylerde veya değerlendirmelerde hemen kullanın. Hücreler gerildikten hemen sonra, hücre kültürü ortamına sitotoksisite belirteci olarak görev yapan canlılık boyasından 1 mg/mL konsantrasyonunda 30 µL ekleyin.

Laktat dehidrogenaz salınımı yoluyla germe yaralanmasını değerlendirmek için; germe işleminden sonra, hücre kültür ortamından derhal 200 µL alın ve LDH salınımı incelemenize dahil etmek istediğiniz yaralanma sonrası her bir zaman noktası için aynı işlemi uygulayın. Ardından, hücre kültür ortamını bir mikro santrifüjün en yüksek ayarında beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için süpernatantı alın ve sonraki adımlarda kullanın. Çeşitli zaman noktalarından gerekli örnekler alındıktan sonra, LDH assay kitinde bulunan lizis solüsyonunu kullanarak hücreleri lyzleyin. Ardından, kit ile birlikte verilen 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna, assay kitinde bulunan assay ortamından 100 µL ekleyin.

Ardından, 96 kuyucuklu plakanın iki paralel kuyucuğuna 100 µL hücre içermeyen hücre kültür ortamı ekleyin; plakayı 37 °C'de 30 dakika inkübe edin ve absorbansı 492 nm'de okuyun. Burada, normal hücrelerin hasarlı hücrelere karşı ışık mikroskobu incelemesi gösterilmektedir.

Normal, gerilmemiş konfluen hücre monotabakası sıkıca paketlenmiş ve uzamış yapıdadır; hücrelere 1,8 ila 2,0 PSI'lık bir tepe basınç darbesi uygulanarak gerilme sağlandığında, daha az kompakt görünürler. Hücreler 2,5 ila 3,0'lık bir tepe basınç darbesiyle orta derecede hasar gördüğünde, bazılarının şişmiş ve deforme olmuş olduğu görülür. 3,5 ila 4,5 PSI'lık şiddetli bir gerilme ile hücreler büzüşür.

Burada, normal hücrelerin hasarlı hücrelerle karşılaştırıldığı floresan mikroskobik inceleme yer almaktadır. Hücreler, hasardan iki saat sonra canlılık boyası ile işleme tabi tutulmuştur. Bunlar kontrol grubu olan gerilmemiş hücreler, orta derecede gerilmiş hücreler ve şiddetli şekilde gerilmiş hücrelerdir.

Bu şekil, gerilme yaralanması sonrası surnat içine salınan LDH enzimini göstermektedir. Kültür ortamına salınan LDH, gerilme kaynaklı yaralanmadan sonra çeşitli zaman aralıklarında ölçülmüş ve düşük ve orta düzeyde gerilmeye maruz kalan hücrelerden salınabilen toplam L-D-H'nin yüzdesi olarak ifade edilmiştir. Bunlar, gerilmeyen kontrollere ve birbirlerine göre anlamlı bir farklılık göstermemiştir.

Şiddetli şekilde gerilen hücreler, gelişmişliğinin birinci saatindeki orta derecede gerilen örnek hariç, diğer tüm örneklerle karşılaştırıldığında anlamlı derecede daha yüksek miktarda LDH salgılamıştır. Bu teknik, nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların denizel beyin endotel hücrelerinde travmatik beyin hasarını in vitro ortamda incelemelerinin önünü açmıştır.