Drosophila Gelişimi ve Üremesi

Drosophila melanogaster, gelişim ve üreme çalışmalarında model organizma olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır. Drosophila, yaşam döngüsü olarak bilinen süreçte birkaç gelişim evresinden geçer ve her evre gelişimsel araştırmalar için benzersiz bir platform sunar. Bu videoda, genetik çaprazlamanın nasıl kurulacağı da dahil olmak üzere Drosophila gelişim ve üremesinin temellerini sunacak ve bu araştırmaların yara iyileşmesinden davranışa kadar uzanan süreçlerin anlaşılmasına nasıl uygulanabileceğini tartışacağız.

Öncelikle, Drosophila yaşam döngüsünü ele alalım. Drosophila gelişimin 4 ana aşamasından geçer: embriyo, larva, pupa ve ergin.

Embriyo, yaklaşık 0.5 mm uzunluğunda ve oval şekilli döllenmiş bir yumurtadır. Döllenmeden hemen sonra embriyo, büyüme olmaksızın hızlı mitotik bölünmelere uğrar. Zigotik çekirdek dokuz tur çekirdek bölünmesi geçirir ancak sitokinez gerçekleşmez; böylece sinsityal blastoderm adı verilen çok çekirdekli bir hücre oluşur. Sinsityal blastodermdeki tüm çekirdekler ortak bir sitoplazmayı paylaştığından, proteinler serbestçe difüze olarak morphogen gradyanları oluşturabilir; bu gradyanlar, sineğin vücut planının ve münferit organ ile dokuların örüntülenmesinin belirlenmesi için önemlidir. 10. çekirdek bölünmesinden sonra çekirdekler, sinsityal blastodermin periferisine göç eder. Döllenmeden yaklaşık 3 saat sonra gerçekleşen 13. çekirdek bölünmesi turunun ardından, sinsityal blastodermdeki 6000 çekirdek bireyselleşerek hücresel blastodermi oluşturur. Hücresel blastoderm tek bir hücre tabakası içerir ve gastrülasyon olarak bilinen bir süreçle karmaşık, çok tabakalı bir yapıya dönüşür. Gastrülasyon sırasında, hücre şekli değişiklikleri tek tabakanın invajinasyonlarını tetikler ve nihayetinde endoderm, mezoderm ve ektoderm germ tabakalarını oluşturur. Endoderm bağırsakları, mezoderm kasları ve kalbi, ektoderm ise epidermisi ve merkezi sinir sistemini meydana getirir. 24 saat sonra embriyolar larva olarak yumurtadan çıkar.

Larvalar beyaz renklidir ve solucan benzeri segmentli vücutlara sahiptirler. Sürekli beslenerek ıslak gıdaların içinde sürünürler, bu da hızlı büyümeye yol açar. Larvalar üç aşamadan geçer: 24 saat süren birinci instar, bir 24 saat daha süren ikinci instar ve 48 saat süren üçüncü instar. Her aşama arasında deri değişimi (molting) gerçekleşir. Pupasyon için hazır olduklarında, üçüncü instar larvalar besin kaynaklarını terk ederek bir flakonun kenarı gibi sert bir yüzeye tutunurlar.

Pupalar hareketsizdir; başlangıçta yumuşak ve beyaz renklidirler ancak zamanla sertleşerek kahverengiye dönerler. Dört günlük bir süre boyunca larval dokular dejenere olur ve ergin dokular oluşur. Eklosyon, pupa evresinin sonunu işaretler ve sinekler ergin olarak ortaya çıkar.

Eklosyondan 8 saat sonra erginler cinsel olarak reseptif hale gelir ve çiftleşmeye başlar, böylece yaşam döngüsü yeniden başlar.

Tam yaşam döngüsü 25 °C'de yaklaşık 10 gün sürer, ancak sıcaklıktan etkilenebilir. Örneğin, 18 °C'de yaşam döngüsü yaklaşık 19 gün, 29 °C'de ise yaşam döngüsü sadece 7 gündür.

Gelişim boyunca, patern oluşumunun dikkatli genetik düzenlemesi vücut planını oluşturur ve bireysel dokular ile organları belirler. Önemli olanı, anterior-posterior aksının kurulması organizmanın baştan kuyruğa yönelimini tanımlar ve birkaç gen grubu tarafından düzenlenir.

İlk olarak, maternal etki genleri oosite sağlanır ve dişiden miras alınır. Bunlar, embriyonun anterior ve posterior kısımlarının başlangıçta belirlenmesi için sinsityal blastodermde önemlidir. Özellikle, bicoid geni baş ve toraks dahil olmak üzere embriyonun anterior kısmını tanımlarken, nanos geni abdomen dahil olmak üzere posterior kısmı tanımlar.

İkinci olarak, maternal etki genleri tarafından düzenlenen segmentasyon genleri, gap genlerini ve pair rule genlerini içerir. Gap genleri, embriyoyu geniş bir şekilde alt bölümlere ayırarak anterior-posterior aksı boyunca segmentli bir vücut planı oluşturur. Pair rule genleri, anterior-posterior aksına dik çizgili bir patern şeklinde eksprese edilerek embriyoyu daha küçük segmentlere ayırır. Ardından, engrailed gibi segment polarite genleri, her segment içindeki hücre kaderlerini belirlemeye başlar.

Son olarak, homeotik genler kanatlar ve bacaklar gibi belirli anatomik yapıların tanımlanmasından sorumludur. İlginç bir şekilde, kromozom üzerindeki genlerin sırası, anterior-posterior aksı boyunca nasıl eksprese edildiklerini yansıtır.

Drosophila, bir ömür boyu binlerce döl üretebilen son derece fertil organizmalardır. Dişiler günde yüzlerce yumurta bırakır ve çiftleşme gerçekleştikten çok sonra bile yumurtaları döllemeye devam ederler.

Drosophila aynı zamanda cinsel dimorfik organizmalardır, yani dişiler fenotipik olarak erkeklerden farklıdır. Özellikle, erkekler dişilerden daha küçüktür; koyu renkli harici genitalyumlara ve alt abdomenlerinde daha fazla siyah pigmente sahiptirler. Erkekler ayrıca, kopülasyon sırasında dişiye tutunmak için kullandıkları, ön bacaklarında sex comb adı verilen bir kıl kümesine sahiptirler. Bu belirgin fenotipik farklar, erkekleri dişilerden ayırt etmeyi çok kolaylaştırır ve bu durum özellikle genetik bir çaprazlama kurulurken oldukça faydalıdır.

Drosophila ile çaprazlama kurmak, genetiği incelemek için yararlı bir tekniktir. Haydi başlayalım!

Çaprazlama kurmanın ilk adımı, hangi erkekle çiftleşeceğini tam olarak kontrol edebilmek için istenen genotipteki bakire dişileri toplamaktır. Drosophila sinekleri, eclosion'dan sonraki ilk 8 saat boyunca çiftleşemezler, bu nedenle çok genç yetişkinlerin toplanması bakireliği garanti eder. Yeni eklüzyona uğramış dişileri toplamak için, tüm yetişkinlerden kurtulmak amacıyla viyali morga boşaltın. Her 3-4 saatte bir, viyali yeni eklüzyona uğramış yetişkinler için kontrol edin ve kullanıma hazır olana kadar dişileri erkeklerin bulunmadığı yeni bir viyale toplayın. Bakire dişiler, çok açık vücut renkleri ve abdomenlerinde mekonium olarak bilinen koyu bir leke ile tanımlanır.

Çaprazlamaya başlamaya hazır olduğunuzda, istediğiniz genotiplerdeki 4-6 erkek ile 4-6 bakire dişiyi tarihlenmiş bir besin viyali içinde birleştirin ve 25° C sıcaklık ile %60 nemde saklayın. 3-4 gün sonra larvalar oluşacak ve ebeveynlerin progeny ile çiftleşmesini önlemek için ebeveynler yeni bir viyale aktarılmalıdır. Yaklaşık 10 gün sonra yeni döl ortaya çıkacak ve fenotipleri incelenebilecektir.

Drosophila araştırmacılarının kullandığı araçlardan biri, genetik rekombinasyonu önleyen ve bir sineğin doğru genotipini belirlemede yararlı olan kıvrık kanatlar (curly wings) gibi genetik belirteçler içeren balancer kromozomlarıdır. İki farklı mutasyon için heterozigot sinekler elde etmek istiyorsanız, mutasyon #1'e sahip ve balancer kromozomu CyO üzerinden taşınan bir stok ile yine CyO üzerinden dengelenmiş mutasyon #2'ye sahip ikinci bir stoğu çaprazlayabilirsiniz. Kıvrık kanatlar olmadan ortaya çıkan tüm progeny, her iki mutasyon için de heterozigottur.

Drosophila araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir diğer araç, araştırmacıların belirli bir dokuda bir geni eksprese etmelerine veya knockdown yapmalarına olanak tanıyan UAS-GAL4 sistemidir. GAL4, dokuya özgü bir promotör tarafından yönlendirilen bir maya transkripsiyon faktörüdür ve UAS, ilgilenilen genin ekspresyonunu kontrol eden Upstream Activating sequence'dir (Yukarı Akış Aktive Edici sekans). Dokuya özgü GAL4 transgenine sahip bir sineği, ilgilenilen geninizin doğrudan aşağı akışında olduğu bir UAS transgenine sahip bir sinekle çaprazladığınızda, GAL4 proteini UAS'ye bağlanır ve istediğiniz genin ekspresyonunu yönlendirir. Örneğin, pupada kanat disklerine özgü olan apterous-GAL4 ile UAS-GFP çaprazlandığında, GFP spesifik olarak bu hücrelerde eksprese edilir.

Drosophila gelişimi ve üremesini incelemek için kullanılabilecek birçok uygulama vardır. Bu uygulamalardan biri davranışsal analizlerdir; özellikle de kur yapma davranışı. Kur yapma sırasında erkek, kendini dişiye doğru yönlendirir ve ön bacaklarıyla dişiye vurarak onu takip eder. Dişi alıcıysa, erkeğin üzerine çıkmasına izin verir. Erkek, abdomenini kıvırarak seminal sıvıyı dişiye aktarır; bu süreç kopülasyon olarak bilinir. Çeşitli mutantlarda kur yapma davranışlarının analizi, davranışın genetik kontrolüne dair içgörü sağlar.

Drosophila gelişimi, canlı görüntüleme yoluyla incelenebilen, birçok hücre hareketini ve şekil değişimini içeren son derece dinamik bir süreçtir. Örneğin, embriyogenez sırasındaki dorsal kapanma, birçok hücre tipinin koordinasyonunu içeren ve epitelyumdaki bir boşluğun fermuar benzeri bir şekilde kapanmasıyla gerçekleşir. Gelişim sırasındaki dorsal kapanma, klinik etkileri olabilecek yara kapanmasını incelemek için sıklıkla bir model olarak kullanılır.

...sırasındaki süreçleri anlamak için kullanılan üçüncü bir uygulama Drosophila bu gelişme, bireysel genlerin aktivitesini baskılayan ve geniş ölçekli ters genetik taramalarda kullanılabilen RNA interferansıdır. Örneğin, embriyolara dsRNA enjekte edilebilir ve böylece gen baskılamasının organ gelişimi gibi süreçler üzerindeki etkisi değerlendirilebilir. Burada, RNA interferansı, trake gelişimi sırasında füzyon için önemli olan bir geni ortaya çıkarmıştır.

JoVE'nin Drosophila melanogaster üreme ve gelişimi giriş videosunu izlediniz. Bu videoda şunları gözden geçirdik: gelişimin her aşamasına dair detaylar dahil olmak üzere Drosophila yaşam döngüsü. Ayrıca, genetiği incelemek ve bir çaprazlama kurmak için Drosophila'nın üreme yeteneklerinin nasıl kullanılacağını öğrendik. Son olarak, Drosophila gelişimi ve üremesinin davranış, yara kapanması ve organ gelişimi gibi karmaşık süreçleri anlamak için nasıl faydalı olduğunu öğrendik.