Name: Yerinde Sıvıda Biyolojik Montajlar TEM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Keşfedin, sıvı ortamda biyolojik montajların nanometre çözünürlükle görüntülenmesi için TEM tabanlı bir yöntemi. Rotavirus partiküllerinin dinamik davranışlarını inceleyerek viral yapıların ve etkileşimlerinin anlaşılmasına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Virginia Tech Carilion Araştırma Enstitüsü Direktörü Dr. Michael J. Friedlander'ı araştırma çabalarımızı teşvik etmek için kabul ediyorlar. Bu proje S.M.M ve D.F.K.'ye geliştirme fonları ve kısmen Virginia Tech Kritik Teknoloji ve Uygulamalı Bilim Enstitüsü'nün Nano-Bio girişimi tarafından desteklendi.

1. Benzeşim Yakalama Cihazları Hazırlayın16
<ol><li>Silikon nitrür E-çiplerini 2 dakika boyunca 15 ml aseton ve ardından 2 dakika boyunca 15 ml metanol(Şekil 1A)inkübe ederek temizleyin. Talaşların laminer hava akışı altında kurumasına izin verin.</li>
	<li>Kurutulmuş talaşları 150 °C'de 1,5 saat boyunca ısıtılmış bir karıştırma plakasında (karıştırmadan) kuluçkaya bırakın, ardından kullanmadan önce oda sıcaklığına soğumalarını bekleyin.</li>
	<li>%25 kloroform içermek için küçük cam tüplerde lipit karışımları oluşturmak için Hamilton şırınnalarını kullanın, Kloroformda %55 DLPC (1,2-dilauroyl-fosfokolin) ve toplam 40 μl hacim için kloroformda (1 mg/ml) %20 Ni-NTA lipid (1,2-dioleoyl-iminodiacetic acid-succinyl-nikel tuzu).</li>
	<li>Nemli bir Petri kabındaki bir Parafilm parçasına her 15 μl Milli-Q su damlasına karışımın 1 μl'lik bir aliquotunu uygulayın (Şekil 1B). Örnekleri en az 60 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatır.</li>
</ol>2. Makromolekülleri Yakalayın17
<ol><li>Monolayer örneğinin üzerine 150 nm entegre ara parça içeren bir E-çip yerleştirin ve 1 dakika kuluçkayayatırın (Şekil 1C).</li>
	<li>Çipi numuneden yavaşça kaldırın ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 3 μl'lik bir Protein A. Incubate ekleyin (Şekil 1D).</li>
	<li>Whatman #1 filtre kağıdını kullanarak fazla damlayı blot ve hemen 3 μl aliquot antikor çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 1 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Bir Hamilton şırıngı kullanarak fazla çözeltiyi çıkarın ve hemen 50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 ve 10 mM CaCl2içeren tampon çözeltiye 1 μl'lik bir rotavirüs DLPs (0.1 mg /ml) ekleyin. Oda sıcaklığında en az 2 dakika kuluçkaya yatır. DLL'lerin hazırlanması daha önce açıklanmıştır18.
</li>
</ol>3. Mikroakışkan Hazneyi Monte Edin ve Yerinde Numune Tutucuyu Yükleyin
<ol><li>Viral örneği içeren ıslak E-çipi mikroakışkan numune tutucunun ucuna yükleyin. 1 dakika boyunca ikinci bir düz E-çipi kızdırma deşarjı, daha sonra ara parça yongasının üzerine yüklenir(Şekil 2, paneller 1-5).</li>
	<li>Alternatif olarak, biyolojik makromoleküllerin kontrastını artırmak için, ıslak numuneye ikinci E çipi yerleştirmeden önce ıslak örneklere ağır metal lekesi(örneğin% 0,2 uranil format) eklenebilir. Bununla birlikte, numuneyi içeren E-çipin kontrast reaktifini eklemeden önce Milli-Q suyu ile yıkanması gerekecektir.</li>
	<li>3 pirinç vida ile tutucu içinde mekanik olarak tutulan kapalı bir muhafaza oluşturmak için tüm montajı bir araya getirin(Şekil 2, paneller 6-8).</li>
	<li>Montajdan sonra, tutucuyu TEM içine yerleştirmeden önce turbo pompalı kuru pompa istasyonu kullanılarak tutucunun ucu10 -6 Torr'a pompalanır.</li>
</ol>4. İletim Elektron Mikroskobu Kullanarak Sıvıda Görüntüleme
<ol><li>Yerinde numune tutucuyu LaB6 filamenti ile donatılmış ve 120 kV'da çalışan bir İletim Elektron Mikroskobuna (FEI Company) yükleyin.</li>
	<li>TEM filamentini açın ve numuneyi sütunda -15° ila +15° ileri geri eğmek için yalpalama işlevini kullanarak mikroskop aşamasının ösantrik yüksekliğini numuneye göre ayarlayın. Bu prosedür, sıvı haznesinin uygun kalınlığını hesaba katmaya yardımcı olmak için z yönünde aşamayı ayarlar. Bu adım ayrıca görüntüleri kaydederken doğru bir büyütmenin kullanılmasını sağlar.</li>
	<li>Önce mikroakışkan odanın kenarları boyunca ve köşe bölgelerinde görüntüleri kaydedin. Bu alanlar genellikle en ince çözümü içerir. CCD kamera kullanarak düşük doz koşullarında (1-3 elektron/ş2)örneklerin görüntülerini kaydedin. 6.000X - 30.000X nominal büyütme kullanın.</li>
	<li>Akışkan odanın kenarına odaklanarak uygun defokus değerini belirleyin. Görüntüleri 30.000X büyütmede kaydetmek için -1,5 μm değerini kullanın. Kalın çözelti ile karşılaşılırsa veya numune hazırlanmasında kontrast maddesi kullanılmazsa, -2 ila -4 μm aralığında daha yüksek defokus değerleri kullanın.</li>
	<li>Deneyler boyunca çözeltinin mikroakışkan haznede bulunduğundan emin olmak için, kabarcıklar cihaz içindeki sıvıda oluşana kadar elektron ışınını odaklayın.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+atomic+resolution+structural+determination+by+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).</li>
<li>Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+interactions+in+bovine+papillomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Subunit interactions in bovine papillomavirus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Unwin, P. N., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+determination+by+electron+microscopy+of+unstained+crystalline+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens.</a> J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Cryo-negative staining.</a> Micron. 29, 145-160 (1998).</li>
<li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186, 407-414 (1974).</li>
<li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biol.+Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects.</a> Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184, 77-78 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).</li>
<li>Ring, E. A., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).</li>
<li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336, 61-64 (2012).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+gold+nanoparticle+uptake+in+live+cells+with+liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).</li>
<li>Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+with+a+liquid+flow+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy with a liquid flow cell.</a> J. Microsc. 242, 117-123 (2011).</li>
<li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+affinity+capture+devices-a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rsc.+Adv%22%5BJournal%5D)">The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).</li>
<li>Gilmore, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+assemblies+in+a+nanoscale+biosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere.</a> Lab Chip. 13, 216-219 (2013).</li>
<li>Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+bovine+rotavirus+cores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of bovine rotavirus cores.</a> J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+using+electron+cryomicroscopy+and+single-particle+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bayesian+view+on+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Bayesian view on cryo-EM structure determination.</a> J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).</li>
<li>Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Affinity+Grid%3A+a+pre-fabricated+EM+grid+for+monolayer+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification.</a> J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).</li>
</ol>

Yazar Madeline J. Dukes, Protochips, Inc.'in bir çalışanıdır.

Sunduğumuz çalışmada, rotavirüs DLP'lerini mikroakışkan bir platforma bağlamaya yönelik benzeşim yakalama yaklaşımını çalıştık. Bu, sıvı bir mikroçevrinde makromoleküler komplekslerin yerinde görüntülenmesini sağladı. Yakalama yaklaşımı, diğer mikroakışkan görüntüleme teknikleri açısından önemlidir, çünkü görüntüleri sıvı olarak kaydederken ortaya çıkan büyük difüzif sorunları reddetmek için biyolojik örnekleri görüntüleme penceresine lokalize eder. Bununla birlikte, protokolümüzdeki en kr...

<a href="https://app.jove.com/t/6605">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/50936">10.3791/50936</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/50936">In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid</a>. The Representative Results and References sections were&#160;updated.

Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Biyologların ve mühendislerin ortak amacı moleküler makinelerin iç işleyişini anlamaktır. İletim Elektron Mikroskopları (TEM'ler), bu karmaşık ayrıntıları atoma yakın çözünürlük1-2'degörselleştirmek için ideal araçlardır. Bir TEM'in yüksek vakum sistemini sürdürmek için, biyolojik numuneler tipik olarak vitreus buz 3 ,şekerler4,ağır metal tuzları5veya6'nınbir kombinasyonunun ince filmlerine gömülür. Sonuç olarak, gömülü örneklerin görüntüleri dinamik süreçlerin yalnızca sınırlı anlık görüntülerini ortaya çıkabilir.
Çevresel sıvı odalarında nemlendirilmiş biyolojik örneklerin korunması için erken girişimler Parsons ve meslektaşları tarafından diferansiyel pompalama aşamaları kullanılarak gerçekleştirilendir. Lekesiz katalaz kristallerinin elektron kırınım desenleri, hidratlı bir durumda 3 şçözünürlüğe başarıyla kaydedildi7-8. Ek olarak, faza ayrılmış lipit alanları insan eritrositlerinin hidratlı zarlarında incelenebilir9-10. Bununla birlikte, sıvının yayılmasından ve elektron ışınlarına müdahalesinden kaynaklanan hareket, ciddi çözünürlük kaybına neden oldu ve yakın zamana kadar biyolojik örnekler kullanılarak daha fazla deney yapılmaya çalışılamamıştır.
Mikro ölçekli bir çevre odası oluşturmak için yarı iletken mikroçipleri kullanan yeni geliştirilen mikroakışkan numune tutucular tanıtıldı. Bu cihazlar, numuneleri bir TEM sütunu11-12'yeyerleştirilmişken sıvı halde muhafaza edebilir. TEM görüntülemedeki bu teknik atılım, araştırmacıların ilk kez moleküler düzeydeki ilerici olayları görüntülemelerini sağladı13. Deneyler artık EM sütunu14-15içinde gerçekleştirilebildiği için bu yeni modaliteyi"yerinde moleküler mikroskopi" olarak adlandırıyoruz. Bu yöntemin genel amacı, nanometre çözünürlüğünde dinamik davranışlarını gözlemlemek için biyolojik montajları sıvı içinde görüntülemektedir. Geliştirilen tekniğin arkasındaki mantık, gerçek zamanlı gözlemleri kaydetmek ve biyolojik makinelerin yeni özelliklerini çözümde incelemektir. Bu metodoloji, hücresel ve moleküler biyolojide daha geniş amaçlar için TEM kullanımını genişletir12-16.
Mevcut video makalesinde, piyasada bulunan bir mikroakışkan numune tutucuyu birleştirmek ve kullanmak için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Bu özel tutucular, dakika hacimlerini içeren bir sıvı odası oluşturmak için entegre aralayıcılarla üretilen silikon nitrür mikroçiplerini kullanır. İnce, şeffaf pencereler görüntüleme amacıyla mikroçiplere kazınır12. Bir TEM kullanarak sıvıdaki simian rotavirüs çift katmanlı partikülleri (DLL'ler) incelemek için mikroakışkan tutucunun doğru kullanımını gösteriyoruz. DLP'ler gibi biyolojik montajların görüntüleme sırasında büyük mesafelerde hızla yayılmasına izin vermek için, onları mikroakışkan odanın yüzeyine bağlamak için Benzeşim Yakalama yaklaşımını16. Bu moleküler yakalama adımı, biyolojik örneklerin sıvı içinde görüntülenmesi için alternatif tekniklere göre büyük bir avantaja sahiptir, çünkü aşağı akış işleme rutinleri için kullanılacak görüntülerin elde edilmesine izin verir. Mikroakışkan görüntüleme ile birlikte kullanılan bu yakalama adımı prosedürlerimize özgüdür17. TEM veya mikroakışkan görüntüleme odalarını kullanarak yapısal biyoloji uygulamaları kullanan okuyucular, moleküler düzeyde dinamik gözlemler nihai hedef olduğunda benzeşim yakalama tekniklerinin kullanımını düşünebilirler.

<table><tbody><tr><td>E-çipler, ara çip</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPB-52TBD</td><td>400 & mu; m x 50 & mu; m pencere</td></tr><tr><td>E-çip, üst çip</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPT-45W</td><td>400 ve mu; m x 50 & mu; m penceresi</td></tr><tr><td>Ni-NTA lipid</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>790404P</td><td>Toz form</td></tr><tr><td>DLPC (12:0) lipid</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850335P</td><td>Toz form</td></tr><tr><td>Hacimsel şişeler&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-812A; 20-812C</td><td>1 ml; 5 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Hamilton Şırıngalar</td><td>Hamilton Co.</td><td>80300, 80400</td><td>1-10 ve mu; l; 1-25 &mu; l</td></tr><tr><td>Whatman #1 filtre kağıdı</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>100 adet, 90 mm</td></tr><tr><td>Cam Petri kapları</td><td>Corning</td><td>70165-101</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Cam Pastör pipetleri</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>14673-010</td></tr><tr><td>Cam kültür tüpleri</td><td>VWR</td><td>47729-566</td><td>6 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Kloroform&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>12550</td><td>100 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Onun etiketli Protein A</td><td>Abcam, Inc.</td><td>ab52953</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Milli-Q su sistemi</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>Z00QSV001</td><td>Ultra Saf Su</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ekipman&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poseidon In situ numune tutucu</td><td>Protochips, Inc.</td><td></td><td>&nbsp; FEI uyumlu</td></tr><tr><td>FEI Spirit BioTwin TEM</td><td>FEI Co.</td><td></td><td>120 kV</td></tr><tr><td>Eagle 2k HS CCD kamera</td><td>FEI Co.</td><td></td><td>10&nbsp; &Aring;/30.000X</td></tr><tr><td>Gatan 655 Kuru pompa istasyonunda</td> piksel örneklemesi <td>Gatan, Inc.</td><td></td><td>Pompa tutucu ucu 10-6&nbsp; aralığı</td></tr><tr><td>PELCO easiGlow, kızdırma deşarj ünitesi</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td></td><td>&nbsp; Negatif polarite modu:</td></tr><tr><td>Isotemp ısıtmalı karıştırma plakası</td>, <td>Fisher Scientific</td><td></td><td>150 &gtm'ye kadar ısı; 1,5 saat için C</td></tr></tbody></table>

yerinde sıvıda biyolojik montajlar tem

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Araştırmacılar, biyolojik varlıkları incelemek ve yeni malzemeleri değerlendirmek için düzenli olarak İletim Elektron Mikroskoplarını (TEM' ler) kullanırlar. Burada, bu aletler için ek bir uygulama açıklıyoruz - viral montajları sıvı bir ortamda görüntülemek. Biyolojik yapıları görselleştirmenin bu heyecan verici ve yeni yöntemi, yakın zamanda geliştirilen mikroakışkan bazlı bir numune tutucuyu kullanır. Video makalemiz, bir TEM içindeki sıvı örnekleri görüntülemek için bir mikroakışkan tutucunun nasıl birleştirılacağını ve kullanılacağını göstermektedir. Özellikle simian rotavirüs çift katmanlı partikülleri (DLP' ler) model sistemimiz olarak kullanıyoruz. Ayrıca, sıvı odasının yüzeyini GÖRÜNTÜLEME penceresine DLP'leri bağlayan benzeşim biyofilmleri ile kaplama adımlarını da açıklıyoruz. Bu, montajları 3D yapı belirlemeye uygun bir şekilde görüntü oluşturmamızı sağlar. Böylece, doğal bir sıvı ortamda subviral parçacıkların ilk bakışını sunuyoruz.

Parlama deşarjı yapılan E-çipler kullanılarak sıvıdaki DLL'lerin temsili görüntüleri (Şekil 3A), benzeşim yakalama cihazlarında zenginleştirilmiş DLL'lere kıyasla, muhtemelen difüzyon nedeniyle belirli bir görüntüleme alanında daha az DLL göstermektedir (Şekil 3B). Görüntüleme odasına uranil format eklenmesi, numunenin kontrastını ve dolayısıyla çözeltideki bireysel DLL'lerin görünürlüğünü arttırır(Şekil 3C, üst panel). Daha iyi kontrast, daha önce açıklandığı gibi parça...

Burada, viral kompleksleri bir iletim elektron mikroskobu kullanarak nanometre çözünürlüğünde sıvı olarak görüntüleme prosedürünü açıklıyoruz.

Yerinde Sıvıda Biyolojik Montajlar TEM

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Bu prosedürün genel amacı, biyolojik düzeneklerin ve sıvıların nanometre çözünürlükte dinamik davranışlarını gözlemlemek için görüntüleme yapmaktır. Bu işlem, öncelikle makromoleküllerin mikroçip yüzeyine tutunmasını sağlayarak sıvı içindeki difüzyonu önlemek amacıyla, afinite yakalama yüzeyine sahip silikon nitrür mikroçipler hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, rotavirüs partiküllerini toplamak için biyolojik örneklerin mikroçip üzerine yüklenmesidir.Ardından, virüs partiküllerini içeren mikroçip bir kontrast ajanla yıkanır ve daha sonra mikroakışkan numune tutucuya yerleştirilir. Son adım, sıvı numuneyi çevreleyen kapalı bir kap oluşturmak için üst çipi ve ön plakayı yerleştirmektir. Son olarak, sıvı mikro odacık içindeki virüs örneğinin özelliklerini ortaya çıkarmak için TEM ile görüntüler kaydedilir.Bu tekniğin sıvı içindeki yapıları incelemeye yönelik mevcut diğer yöntemlere göre temel avantajı, mikroçiplerde kullanılan afinite yakalama kaplaması sayesinde numunelerimizin görüntüleme sırasında geniş mesafelere hızla yayılmamasıdır. Bu tekniğin etkileri, dinamik nano makinelerin çözelti içindeki değişimlerini ilk kez görebilmemiz nedeniyle, nanopartikül tabanlı ilaç taşıma sistemlerinin veya viral patojenlere karşı aşı geliştirme süreçlerinin gerçek zamanlı değerlendirmelerine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem biyolojik makromoleküllerin görselleştirilmesine dair içgörüler sağlayabildiği gibi, elektrokimya uygulamaları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Bu yöntemin görsel bir gösterimi kritik öneme sahiptir; çünkü afinite yakalama cihazlarının hazırlanması ve mikroakışkan numune tutucunun yüklenmesi, deneyimli olmayan kullanıcılar için sorun teşkil edebilir. Başlamak için, silikon nitrür çipleri önce 15 mililitre asetonda iki dakika, ardından 15 mililitre metanolda iki dakika inkübe ederek temizleyin.Üretim sürecinde kullanılan artık fotoresist kalıntılarını gidermek için, çiplerin laminar hava akışı altında hızla kurumasını sağlayın. Kuruma işlemi tamamlandıktan sonra, çipleri 150 °C'ye ısıtılmış bir plaka üzerinde 1,5 saat boyunca inkübe edin. Ardından oda sıcaklığına soğumalarını bekleyin.Ardından, küçük bir cam tüp içerisinde lipid karışımını hazırlamak için Hamilton şırıngaları kullanın. Önce %25 kloroform ekleyin, ardından 1 mg/mL konsantrasyonunda kloroform içinde %55 DLPC ekleyin. Son olarak, ayrı bir şırınga kullanarak, toplam hacim 40 µL olacak şekilde 1 mg/mL konsantrasyonunda kloroform içinde %20 nikel NTA lipid ekleyin.Ardından, 100 x 15 milimetrelik bir cam Petri kabının içine sığacak şekilde bir parça param kesin ve param yüzeyine dokuz adet 15 µL Milli Q su damlası ekleyin. Her bir 15 µL Milli Q su damlasının üzerine 1 µL lipid karışımı alikotu uygulayın ve damlaların yüzeyinde bir lipid tek katmanı oluşurken plakayı nemli bir ortamda, buz üzerinde en az 60 dakika bekletin. Tek katman damlasının üzerine 150 nm entegre ara parçasına sahip bir EIP yerleştirin ve bunları bir dakika boyunca birlikte inkübe edin.Ardından, çipi damlacıktan nazikçe kaldırın ve 0,01 mg/mL konsantrasyondaki hist etiketli protein A'dan üç µL'yi doğrudan çip yüzeyine ekleyin. Çipi ve protein A'yı oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, fazla sıvıyı Watman 1 numaralı filtre kağıdı kullanarak emdirin ve hemen 0,01 mg/mL konsantrasyondaki IgG antikor çözeltisinden üç µL ekleyin.Numuneyi oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edin. Ardından, fazla çözeltiyi bir Hamilton şırıngası kullanarak uzaklaştırın ve derhal HEAPS tampon çözeltisi içinde 0,1 mg/mL konsantrasyonda rotavirüs çift katmanlı partiküllerinden bir µL'lik bir aliquot ekleyin ve çipi oda sıcaklığında en az iki dakika inkübe edin. İkinci bir düz IP, bir dakika boyunca glow discharge uygulanarak hazırlanır; önce numune haznesinin ucuna O-ringler yerleştirilerek bir ST.Stereoscope yardımıyla mikroakışkan hazne monte edilir.Ardından, viral numune içeren ıslak E IP'yi mikroakışkan numune tutucunun ucuna yerleştirin. Sonrasında, glow discharge düz EIP'yi numunenin üzerine ekleyin ve tüm düzeneği, tutucu içerisinde üç pirinç vida ile mekanik olarak sabitlenmiş sızdırmaz bir muhafaza oluşturacak şekilde birbirine sıkıştırın. Montajın ardından, tutucunun ucunu 10⁻⁶ tor seviyesine kadar vakumlayın.Numune tutucuyu TEM içerisine yerleştirmeden önce turbo pompalı kuru pompalama istasyonu kullanarak, 120 kilovolt ile çalışan lab six filamanlı bir transmisyon elektron mikroskobuna I iki numune tutucusunu yükleyin. Ardından TEM filamanını açın ve wobbler fonksiyonunu kullanarak numuneyi -15 derece ile +15 derece arasında ileri geri eğerek mikroskop tablasının merkez yüksekliğini numuneye göre ayarlayın. Kolonda, mikroakışkan kanalın kenarları ile köşe bölgelerinde 6.000 ile 30.000 kat büyüklüğünde görüntüler kaydedin.Bir angstrom kareye bir ila üç elektron düşen düşük doz koşullarında, CCD kamera kullanarak ilk görüntüyü alın. Akışkan haznesinin kenarına odaklanarak uygun defocus değerini belirleyin. Genel olarak, çözeltinin mikroakışkan hazne içinde kaldığından emin olmak için 30.000 kat büyütmede görüntü kaydetmek üzere eksi 1,5 mikrometre defocus değeri kullanın.Deneyler boyunca, cihaz içindeki sıvıda kabarcıklar oluşana kadar elektron demetini odaklayın. Burada gösterilen görüntü, angstrom kare başına beş elektron şiddetinde iki dakika sonra alınmıştır. Beş dakika sonra, glov boşalması ve mikroçip bağları nedeniyle daha fazla kabarcık oluşmuştur.Muhtemelen difüzyon nedeniyle çözeltide çok az sayıda çift katmanlı partikül görülmektedir. Buna karşılık, afinite ile dekore edilmiş mikroçiplerde çift katmanlı partiküller zenginleşmiştir; burada gösterilenler, kontrast ajan içeren sıvı içindeki çift katmanlı partiküllerin temsili görüntüleri ve bir 3D rekonstrüksiyonudur. Rekonstrüksiyonun çapı 80 nanometredir.Çift katmanlı partiküllerin ve sıvının sınıf ortalamaları, dış yüzeyleri boyunca belirgin özellikler ortaya çıkardı. Münferit paneller 110 nanometredir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, E IPS'yi numune tutucunun ucuna ortalamayı ve tutucuyu elektron mikroskobuna yerleştirmeden önce PrepU yapmayı hatırlamak önemlidir.Bu prosedürün ardından, elektron demetinin viral komplekslerin fonksiyonel kapasitesini ne ölçüde etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak için transkripsiyonel aktivitenin değerlendirilmesi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, afinite yakalama cihazlarının nasıl üretileceği, bunların moleküler adaptörlerle nasıl dekore edileceği, virüs örneklerinin mikroakışkan TEM tutucusuna nasıl yükleneceği ve örneklerin standart mikroskopi prosedürleri kullanılarak nasıl görüntüleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Viral patojenlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve BSL iki patojenlerle prosedürler gerçekleştirilirken eldiven ve koruyucu gözlük kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

in-situ-tem-of-biological-assemblies-in-liquid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz bir transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak sıvı yoluyla görüntüleme sağlayan bir kendi kendine yeten bir sıvı hücre, geliştirdik. Sıvılarda nanoparçacıkların Dinamik süreçleri alt nanometre çözünürlükte gerçek zamanlı olarak ortaya çıkabilmektedir.

Sıvı Hücre Transmisyon Elektron Mikroskobu kullanarak Sıvılarda Malzemelerin Dinamik Süreçler Revealing

Bu makale bir biyofilm in situ uçuş zaman ikincil iyon kütle spektrometresi sulu durumda, kimyasal eşleştirmesi bir mikrosıvısal reaktör, sıvı vakum arabirimi analiz için sistemi tarafından etkinleştirilmiş için için büyüyen bir yöntem sunar. Shewanella Corynebacterium Bay-1 yeşil Floresans protein ile bir model olarak kullanıldı.

Situ Shewanella Corynebacterium MR1 biyofilmler SALVI ve ToF-SIMS tarafından karakterizasyonu

Biz gerçek zamanlı görüntüleme ve boehmite parçacıklar deiyonize su elemental kompozisyon analizi için bir yordam situ içinde sıvı Taramalı elektron mikroskobu ile mevcut.

Situ Su sıvı SEM kullanarak Boehmite parçacıklar karakterizasyonu

Burada deneysel protokoller gerçek zamanlı gözlem kendinden montajlı işlem için tanıtmak sıvı hücreli transmisyon elektron mikroskobu kullanarak.

Hücre içi sıvı iletim elektron mikroskobu nano tanecikleri, kendinden montajlı takibi için

Bir foto-optik in situ mikroskopi cihazı doğrudan hücre süspansiyon tek hücrelerin boyutunu izlemek için geliştirilmiştir. Gerçek zamanlı ölçüm, foto-optik sterilize edilebilir probun otomatik görüntü analizine dahil edilerek gerçekleştirilir. Morfolojik değişiklikler büyüme durumuna ve yetiştirme koşullarına bağımlılıkla birlikte ortaya çıkmaktadır.

In Situ Biyoproseslerde Tek Hücreli Morfolojinin Gerçek Zamanlı Tayini İçin Mikroskopi

Haucl4 habercisi çözeltisi altın nanokrystals In situ elektron mikroskobu için grafen destekli mikrowell sıvı hücrelerin hazırlanması için bir protokol sunulmuştur. Ayrıca, gözlenen dağlama ve büyüme dinamiklerini ölçmek için bir analiz rutini sunulmaktadır.

Situ şanzıman elektron mikroskobu Için Graphene destekli Mikrowell sıvı hücrelerinin hazırlanması

Burada, yaygın olarak kullanılan birkaç numune hazırlama yöntemini detaylandırırken in situ TEM kapalı hücreli gaz reaksiyonu deneyleri yapmak için bir protokol sunuyoruz.

İletim Elektron Mikroskobunda In Situ Kapalı Hücreli Gaz Reaksiyonlarının Gerçekleştirilmesi

Mevcut protokol, bir ışık aydınlatma sistemi ile iletim elektron mikroskobu (TEM) modifikasyonlarını, sıvı hücrelerin üretimini ve bakteri hücreleri ile bir fotosensitizör arasındaki ışık kaynaklı etkileşimlerin yerinde TEM gözlemlerini açıklamaktadır. Numune hazırlama yöntemleri, elektron ışını hasarı ve görüntüleme de tartışılmaktadır.

Sıvı-Yumuşak Madde Etkileşiminin Gözlemlenmesi için Işık Kaynaklı In Situ İletim Elektron Mikroskobu

Burada, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak nano ölçekte sıvı-EM ve kriyo-EM analizi için uygun virüs düzenekleri hazırlamak için protokoller açıklanmaktadır.

Sıvı ve Buzdaki Virüs Düzeneklerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesinin İlerlemesi

Kriyo-STEM tomografisi, bozulmamış hücrelerin organellerini gömme, kesitleme veya diğer invaziv preparatlar olmadan görselleştirmek için bir araç sağlar. Elde edilen 3D çözünürlük şu anda birkaç nanometre aralığında, birkaç mikrometrelik bir görüş alanı ve 1 μm mertebesinde erişilebilir bir kalınlık ile.

Kriyo-STEM Tomografi ile Organellerin In Situ Görüntülenmesi

Keşfedin, sıvı ortamda biyolojik montajların nanometre çözünürlükle görüntülenmesi için TEM tabanlı bir yöntemi. Rotavirus partiküllerinin dinamik davranışlarını inceleyerek viral yapıların ve etkileşimlerinin anlaşılmasına katkı sağlar.

Yerinde Sıvıda Biyolojik Montajlar TEM

Daha fazla video keşfet