AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Aşağıdaki deneyin genel amacı, FM tabanlı tek moleküllü kuvvet spektroskopisi kullanarak füzyon proteini bağlanma ortaklarının mekanik özelliklerini ve katlanma durumlarını incelemektir. Bu, ikinci adım olarak iyi tanımlanmış çekme geometrisi elde etmek için protein bağlama ortaklarının bir cam slayt ve bir A FM konsol üzerinde kovalent olarak hareketsiz hale getirilmesiyle elde edilir. Cam yüzey, reseptör ligand bağlanmasının kurulmasına izin veren konsol ile girintilidir.

Daha sonra, konsol, tek tek protein alanlarını açmak ve reseptör ligandını ilişkilendirmek için sabit bir hızda geri çekilir ve polimer elastikiyet modellerinde ortaya çıkan, açılma yolu boyunca enerji bariyerleri olarak işlev gören üçüncül yapısal elemanları ortaya çıkaran karmaşık sonuçlar elde edilir. Bağlanma ortakları hakkında daha fazla kinetik ve enerjik bilgi, kinetik modellerin dinamik kuvvet spektrumuna uydurulmasıyla elde edilebilir. Bu prosedürün genel amacı, kuvvet altındaki proteinlerin açılma yollarını incelemektir.

Bu yöntem, proteinlerin mekanik stabilitesi hakkında fikir verebilir. Erişilebilir bir dosya grubu ile tasarlanabilen herhangi bir protein reseptör ligand sistemine uygulanabilir. Bu yöntemi ilk kez kullanan araştırmacılar zorlanıyor çünkü zamanlama çok önemli ve konsolları kullanmak zor olabilir.

Bu yöntem, çok alanlı bir proteinin nasıl ortaya çıktığı gibi biyofizik alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. İki x 24 milimetre çapında, 0.5 milimetre kalınlığında cam kapak, A-P-T-F-E tutucusuna kayar, ardından sonikasyon. Kapak, 15 dakika boyunca 50 ila 50 etanol ve ultra saf su karışımında kayar.

Sonikasyon tamamlandığında, kapak fişlerini ultra saf suyla durulayın ve 30 dakika boyunca bir piranha çözeltisinde aşındırın. 30 dakika sonra, kapak fişlerini çıkarın ve ultra saf suyla durulayın ve hafif bir nitrojen akışı altında kurutun. Sonraki daldırma: Kapak, etanol, ultra saf su ve üç amino propil dimetil ahoy karışımından 45'e beşe bir oranında kayar.

Daldırma numunelerini oda sıcaklığında 60 dakika boyunca dakikada yaklaşık 50 dönüşte bir çalkalayıcıya yerleştirin. Daha sonra kapak fişini sırayla %100 etanole batırın, ardından her biri iki kez ultra saf suya batırın. Yine, kapak kızaklarını hafif bir nitrojen akışı altında kurutun.

Kuruduktan sonra, kapak fişlerini 80 derecelik bir fırında 30 dakika pişirin. Silikon konsol uçlarının amino izasyonunu gerçekleştirmek için kullanılmayan lamele fişlerini Argonne altında altı haftaya kadar saklayın. İlk önce dört silikon konsolu temiz bir cam kaydırak üzerine yerleştirin ve 15 dakika boyunca UV ozon ile muamele edin.

Daha sonra konsolları üç dakika daldırın ve 50 ila 50 etanol çözeltisi ve üç amino propil dimetil oksi İlen'i %25 ultra saf su ile birlikte daldırın. Daha sonra, konsolları toluen, etanol ve ultra saf su fırınlarında 60 saniye boyunca sırayla durulayın. Son durulamadan sonra konsolları RIN'ler arasında filtre kağıdı üzerinde dikkatlice kurulayın.

Konsolları temiz bir cam kaydırak üzerine yerleştirin ve 80 derecede 30 dakika pişirin. Önce çapını genişletmek için 200 mikrolitrelik bir pipet ucunun ucunu keserek ve ardından her 1,5 mililitrelik mikro tüpe 100 mikrolitre stok boncuk çözeltisi pipetleyerek iki T TEP diss sülfür indirgeyici boncuk hazırlayın. Daha sonra, TEP boncuk bulamacı OTT'lerine bir mililitre TBS ekleyin ve mikro tüpü kısaca girdaplayarak boncukları durulayın.

Daha sonra numuneleri 850 Gs'de üç dakika santrifüjleyerek boncukları peletleyin. Süpernatanı bir mikro pipetle dikkatlice çıkarın ve atın ve boncukları bir mililitre TBS ile iki kez daha durulayın. Durulamalar arasında santrifüjleme, son durulamadan sonra yapılır, TEP boncuklarına bir ila iki oranında mililitre başına üç miligramda konsantre bir protein çözeltisi ekleyin ve hava kabarcıklarının girmesini önlemek için bulamacı bir mikro pipet ucuyla karıştırarak hafifçe karıştırın.

Daha sonra protein TEP boncuk bulamaç karışımını 2,5 saat boyunca bir döndürücü üzerine yerleştirin. Yüzeydeki birincil amin gruplarını protonlamak için amino gözleri, konsolları ve kapak fişlerini 8.5 pH'ta sodyum bate tamponunda 45 dakika bekletin. Daha sonra N-H-S-P-E-G malam tozunu oda sıcaklığına ısıtın ve 210 mikrolitresini 25 mikromolar'da sodyum boy sekiz tamponunda girdaplayarak hazırlayın.

Çözüm, NHS'nin son derece kısa yarı ömrü nedeniyle mümkün olduğunca çabuk kullanılmalıdır. PH 8.5'te, 30 mikrolitrelik N-H-S-P-E-G malam çözeltisi damlacıklarını bir Petri kabına ve 90 mikrolitreyi diğer her cam kapak kızağına hızlı bir şekilde bırakın. Konsolları dikkatlice 30 mikrolitrelik damlacıkların içine yerleştirin.

Ardından, N-H-S-P-E-G malam çözeltisi ile bir sandviç oluşturmak için damlacık olmadan kapak fişini N-H-S-P-E-G malam çözeltisi olan bir tanesine çevirin. Ortada, konsolları ve kapak kızaklarını N-H-S-P-E-G MALAM çözeltisi ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. TEP boncuğunu ve indirgenmiş protein çözeltisini 100 GS'de bir dakika santrifüjleyin ve snat'ı toplayın.

Daha sonra, protein çözeltisini TBS ile seyreltin. Yüzey konjugasyonu sırasında mililitre başına 0,5 ila iki miligram aralığında bir protein konsantrasyonu hedefleyin. Daha sonra konsolları durularken ve astarları kapatırken azaltılmış ve seyreltilmiş protein çözeltilerini birkaç dakika bir kenara koyun.

Kapak fişlerini üç ardışık ultra saf su kabında durulayın. Kağıdı filtrelemek için kenarlara dikkatlice dokunarak kapak kızaklarından kalan sıvıyı çıkarın. Ardından, kapak fişlerini A FM cihazı ile uyumlu uygun bir numune tutucuya monte edin ve kalan sıvıyı hafif bir nitrojen akışı altında kurutun.

20 mikrolitre seyreltilmiş protein solüsyonunu kapak kızaklarının ortasına bir damlacık olarak uygulayın. Daha sonra konsolları üç ardışık ultra saf su kabında durulayın, ardından ikinci seyreltilmiş protein çözeltisinin 30 mikrolitrelik damlacıkları ile durulayın. Pegile örtü kızaklarını ve konsolları, ilgili seyreltilmiş protein çözeltileri ile oda sıcaklığında bir ila iki saat boyunca bir nem odasında inkübe edin.

Daha sonra, kapak fişlerini bir mililitre TBS ile en az 10 kez durulamak için bir pipet kullanın ve ardından ölçüme kadar TBS'de saklayın. Ayrıca, bağlanmamış proteinleri çıkarmak ve bunları TBS'de saklamak için TBS içeren üç ardışık beher kullanarak konsolları durulayın. İşlevselleştirilmiş, konsol ve cam kızakları, sıvılarda ölçüm için uygun olan ve Z pieto'da saniyede yaklaşık 200 ila 5.000 nanometre erişilebilir bir hız aralığını destekleyen bir A FM modeline monte edin.

Kutuyu monte ederken, havaya maruz kalmayı en aza indirirken, lazer ışınının doğru şekilde ayarlanmasının ardından tüm süreç boyunca yüzeylerin tamponla kaplı kaldığından emin olun. Herhangi bir sapma etkisini azaltmak için sistemin en az 30 dakika dengelenmesine izin verin ve gerekirse yeniden ayarlayın. Ardından, uyumun başarılı bir şekilde bağlanması üzerine ölçüm yapmaya başlayın.

Burada gösterilen kaydedilen kuvvet mesafesi izlerini çift olarak kullanın. Karakteristik bir tepe deseni sergileyin. İzdeki her zirve, bir protein alt alanının açılmasını temsil eder ve son tepe reseptör ligand kompleksinin ayrışmasına karşılık gelir.

Kaydedilen kuvvet mesafesi izleri daha sonra kuvvet kontur uzunluk uzayına dönüştürüldü ve bir bariyer pozisyonu histogramında birleştirildi. Veriler, yaklaşık 89 nanometrelik bir kontur uzunluğu artışını göstermektedir ve bu, uyumlu liman işçisinin ve etkileşimin enerji manzarasını araştırmak için xin alanının açılımına açık bir şekilde atanabilir. Dört farklı havuzlama hızında toplam 186 veri izi elde edildi.

Büyük mavi daireler olarak gösterilen ortaya çıkan dinamik kuvvet spektrumu, belirli bir yükleme hızında en olası kopma kuvvetlerini temsil eder. Bu değerler daha sonra Bell Evans modeline uyduruldu, uyum, daha önce yayınlanan sonuçlarla iyi bir uyum içinde bulunan Koff ve delta X için değerler verdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu tekniğin deneysel kısmı sekiz ila dokuz saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü takiben, bağlanma için çok önemli olan amino asitleri belirlemek için bir takip deneyinde bölgeye özgü mutajenez gerçekleştirilebilir. Bu teknik, tek molekül biyofiziği alanındaki araştırmacıların protein katlanma manzaralarını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bunu, bilinen mekanik olarak en kararlı protein sistemleri arasında yer alan selüloz SOE'lerin mekanik özelliklerini incelemek için kullanıyoruz.

Bu videoyu izledikten sonra, protein reseptörü ligand çiftleri üzerinde tek molekül kuvvet spektroskopisinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.