Name: AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Keşfedin AFM tabanlı tek-molekül kuvvet spektroskopisi ile cellulosome reseptör-ligand sistemlerinin mekanik özelliklerini ve katlanma durumlarını. Bu yöntem biyofizik araştırmalarında protein etkileşimlerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Avrupa Araştırma Konseyi'nin Hermann Gaub'a verdiği ileri düzey hibeden fon sağlandığını kabul ediyor. Michael A. Nash, Society in Science - The Branco Weiss Fellowship programından sağlanan fonu minnetle kabul eder. Yazarlar, Weizmann Bilim Enstitüsü'nden Edward A. Bayer, Yoav Barak ve Daniel B. Fried'e bu çalışmada kullanılan proteinleri cömertçe sağladıkları için teşekkür eder. Yazarlar yararlı tartışmalar için Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner ve Stefan W. Stahl'a teşekkür eder.

<ol><li>Bayer, E. A., Belaich, J. P., Shoham, Y., Lamed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellulosomes%3A+Multienzyme+machines+for+degradation+of+plant+cell+wall+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The cellulosomes: Multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides.</a> Annu. Rev. Microbiol. 58, 521-554 (2004).</li>
<li>Bayer, E. A., Lamed, R., White, B. A., Flint, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Cellulosomes+to+Cellulosomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rec%22%5BJournal%5D)">From Cellulosomes to Cellulosomics.</a> Chem. Rec. 8 (6), 364-377 (2008).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986).</li>
<li>Garcı́a, R., Perez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+atomic+force+microscopy+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamic atomic force microscopy methods.</a> Surf. Sci. Rep. 47 (6), 197-301 (2002).</li>
<li>Engel, A., Müller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+single+biomolecules+at+work+with+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Observing single biomolecules at work with the atomic force microscope.</a> Nat. Struct. Biol. 7 (9), 715-718 (2000).</li>
<li>Li, H., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Mechanics%3A+From+Single+Molecules+to+Functional+Biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Protein Mechanics: From Single Molecules to Functional Biomaterials.</a> Acc. Chem. Res. 43 (10), 1331-1341 (2010).</li>
<li>Florin, E. -L., Moy, V. T., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+forces+between+individual+ligand-receptor+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs.</a> Science. 264 (5157), 415-417 (1994).</li>
<li>Oberhauser, A., Hansma, P., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+unfolding+of+titin+under+force-clamp+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (2), 468-472 (2001).</li>
<li>Puchner, E. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+function%3A+probing+proteins+with+AFM-based+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Force and function: probing proteins with AFM-based force spectroscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19 (5), 605-614 (2009).</li>
<li>Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J., Gaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+unfolding+of+individual+titin+immunoglobulin+domains+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM.</a> Sci. 276 (5315), 1109-1112 (1997).</li>
<li>Stahl, S. W., Nash, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+dissection+of+the+high-affinity+cohesin%E2%80%93dockerin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin–dockerin complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (50), 20431-20436 (2012).</li>
<li>Boland, T., Ratner, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+hydrogen+bonding+in+DNA+nucleotide+bases+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of hydrogen bonding in DNA nucleotide bases by atomic force microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5297-5301 (1995).</li>
<li>Morfill, J., Kühner, F., Blank, K., Lugmaier, R. A., Sedlmair, J., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-S+Transition+in+Short+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">B-S Transition in Short Oligonucleotides.</a> Biophys. J. 93 (7), 2400-2409 (2007).</li>
<li>Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+mechanics+of+single+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules.</a> Nat. Struct. Biol. 6 (4), 346-350 (1999).</li>
<li>Severin, P. M. D., Zou, X., Gaub, H. E., Schulten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+methylation+alters+DNA+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cytosine methylation alters DNA mechanical properties.</a> Nucleic Acids Res. 39 (20), 8740-8751 (2011).</li>
<li>Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li>
<li>Giannotti, M. I., Vancso, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Single+Synthetic+Polymer+Chains+and+Polysaccharides+by+AFM-Based+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Single Synthetic Polymer Chains and Polysaccharides by AFM-Based Force Spectroscopy.</a> Chem. Phys. Chem. 8 (16), 2290-2307 (2007).</li>
<li>Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Stretched+Single+Polymers%3A+Atomic-Force-Microscope+Experiments+Versus+Ab-Initio+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory.</a> Phys. Rev. Lett. 94 (4), 10-1103 (2005).</li>
<li>Nash, M. A., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Adhesion+of+a+Stimuli-Responsive+Oligo%28ethylene+glycol%29+Copolymer+to+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Adhesion of a Stimuli-Responsive Oligo(ethylene glycol) Copolymer to Gold.</a> ACS Nano. 6 (12), 10735-10742 (2012).</li>
<li>Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscapes+of+receptor-ligand+bonds+explored+with+dynamic+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy.</a> Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).</li>
<li>Morfill, J., Neumann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-based+Analysis+of+Multidimensional+Energy+Landscapes%3A+Application+of+Dynamic+Force+Spectroscopy+and+Steered+Molecular+Dynamics+Simulations+to+an+Antibody+Fragment%E2%80%93Peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Complex.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Force-based Analysis of Multidimensional Energy Landscapes: Application of Dynamic Force Spectroscopy and Steered Molecular Dynamics Simulations to an Antibody Fragment–Peptide.</a> Complex. J. Mol. Biol. 381 (5), 1253-1266 (2008).</li>
<li>Ortiz, C., Hadziioannou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropic+Elasticity+of+Single+Polymer+Chains+of+Poly%28methacrylic+acid%29+Measured+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Entropic Elasticity of Single Polymer Chains of Poly(methacrylic acid) Measured by Atomic Force Microscopy.</a> Macromolecules. 32 (3), 780-787 (1999).</li>
<li>Bustamante, C., Marko, J. F., Siggia, E. D., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropic+Elasticity+of+l-phage+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Entropic Elasticity of l-phage DNA.</a> Science. 265 (5178), 1599-1600 (1994).</li>
<li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28 (26), 8759-8770 (1995).</li>
<li>Puchner, E. M., Franzen, G., Gautel, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+Proteins+by+Their+Unfolding+Pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Comparing Proteins by Their Unfolding Pattern.</a> Biophys. J. 95 (1), 426-434 (2008).</li>
<li>Livadaru, L., Netz, R. R., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+Response+of+Discrete+Semiflexible+Polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching Response of Discrete Semiflexible Polymers.</a> Macromolecules. 36 (10), 3732-3744 (2003).</li>
<li>Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based%2C+site-specific+and+covalent+immobilization+of+biomolecules+for+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments.</a> Nat. Protoc. 5 (6), 975-985 (2010).</li>
<li>Gumpp, H., Stahl, S. W., Strackharn, M., Puchner, E. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastable+combined+atomic+force+and+total+internal+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Ultrastable combined atomic force and total internal fluorescence microscope.</a> Rev. Sci. Instrum. 80 (6), 063704 (2009).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+force+microscope+springs+optimized+for+optical-beam+deflection+and+with+tips+made+by+controlled+fracture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Scanning force microscope springs optimized for optical-beam deflection and with tips made by controlled fracture.</a> J. Appl. Phys. 76 (1), 172 (1994).</li>
<li>Cook, S. M., Lang, K. M., Chynoweth, K. M., Wigton, M., Simmonds, R. W., Schäffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17 (9), 2135-2145 (2006).</li>
<li>Proksch, R., Schäffer, T. E., Cleveland, J. P., Callahan, R. C., Viani, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite+optical+spot+size+and+position+corrections+in+thermal+spring+constant+calibration%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Finite optical spot size and position corrections in thermal spring constant calibration.</a> Nanotechnology. 15 (9), 1344-1350 (2004).</li>
<li>Ainavarapu, S. R. K., Brujic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contour+Length+and+Refolding+Rate+of+a+Small+Protein+Controlled+by+Engineered+Disulfide+Bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Contour Length and Refolding Rate of a Small Protein Controlled by Engineered Disulfide Bonds.</a> Biophys. J. 92 (1), 225-233 (2007).</li>
<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Molecular+Fingerprints+in+Single+Molecule+Force+Spectroscopy+Using+Pattern+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition.</a> Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+strength+of+molecular+adhesion+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic strength of molecular adhesion bonds.</a> Biophys. J. 72 (4), 1541-1555 (1997).</li>
<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+by+mechanical+triangulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protein structure by mechanical triangulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Rates+and+Activation+Free+Energies+from+Single-Molecule+Pulling+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments.</a> Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).</li>
<li>Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+widespread+nonlinear+force+spectra+of+intermolecular+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi deneylerinden anlamlı veriler elde etmek için iyi tanımlanmış ve tekrarlanabilir çekme geometrileri elde etmek çok önemlidir. Burada kullanılan protokol, tanımlanmış bir çekme geometrisinde protein komplekslerinin bölgeye özgü immobilizasyonu ile sonuçlanır.
Bu çalışmada kullanılan konsollar, kuvvet hassasiyetleri ve sudaki yüksek rezonans frekansları nedeniyle seçilmiştir. Ayrıca, yaklaşık 10 nm'lik küçük uç eğriliği, çoklu etkileşim olasılığının azalması n...

Selülozomlar, bitki hücre duvarı lignoselülozunu çözünür oligosakkaritlere verimli bir şekilde depolimerize etmek için evrimleşmiş anaerobik selülolitik bakterilerin (örneğin C. thermocellum) yüzeyinde görüntülenen büyük multienzim kompleksleridir1. Selülozomların merkezi bir özelliği, yüksek afiniteli kohezite-dockerin etkileşimidir. En belirgin paradigmada, çeşitli bakteriyel enzimlerin C-terminal ucunda yüksek oranda korunmuş bir 60-75 amino asit tip I dockerin modülü görüntülenir. Docker modülü, enzimlerin sinerjik kombinasyonlarının, tip I dockerin modülüne özgü kohezin alanlarının bir poliproteinini içeren katalitik olmayan iskele proteini ('iskele') üzerine montajını yönlendirir. Daha yüksek seviyelerde, selülozom mimarisi çok karmaşık hale gelebilir, yapıları hücre yüzeyine sabitleyen ve çoklu iskele içeren dallı yapıların montajına izin veren alternatif kohezin ve dockerin çiftlerini (örneğin tip II, tip III) içerebilir2. Çeşitli kohezin-dockerin tipleri, ilgili yapılara sahip olmalarına rağmen, istenmeyen iskeleler veya diğer selülozom üreten bakteri türlerinden gelen bileşenlerle çapraz reaktiviteyi baskılayan diferansiyel bağlanma özgüllükleri sergiler. Biyoinformatik yaklaşımlar genetik düzeyde binlerce benzersiz selülozomal bileşeni başarıyla tanımlamış olsa da, nispeten az sayıda protein yapısı bilinmektedir ve kohezin-dockerin özgüllüğünün belirlenmesinde iş başında olan mekanizmalar, yapısal biyoloji araştırmalarının aktif bir alanı olmaya devam etmektedir.
Binnig ve arkadaşları tarafından atomik kuvvet mikroskobunun (AFM) icadından bu yana.3, temassız görüntüleme, salınım modu görüntüleme4 ve tek moleküllü kuvvet spektroskopisi (SMFS) 5,6 dahil olmak üzere çeşitli AFM operasyonel modları geliştirilmiş ve sürekli iyileştirilmiştir. SMFS, tek tek proteinleri7-11, nükleik asitleri12-15 ve sentetik polimerleri16-19 doğrudan araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniğe dönüşmüştür. Reseptör-ligand bağlanmasını araştırmak için tipik bir SMFS deneyinde20,21, bir AFM konsol ucu, bağlanma ortaklarından biri ile modifiye edilirken, düz bir cam yüzey tamamlayıcı bağlama ortağı ile modifiye edilir. Modifiye edilmiş konsol, yüzeyle temas ettirilerek ortakların bağlanmasına izin verilir. Konsolun tabanı daha sonra sabit hızda geri çekilir ve kuvvet, optik kol sapma yöntemi kullanılarak ölçülür. Ortaya çıkan kuvvet-mesafe veri izleri, bağlanma kurulmuşsa testere dişi benzeri tepeler sergiler. Bağlanma ortaklarının birden fazla protein alanına kaynaştığı durumlarda, kuvvet-mesafe izindeki her bir zirve, tek bir protein alanının veya katlanmış alt alanın açılmasıyla ilişkilendirilebilirken, son zirve, protein bağlanma arayüzünün yırtılmasına karşılık gelir. Kuvvete dayanıklı elemanların spesifik konumları, ilgilenilen çeşitli protein alanlarını tanımlamak için parmak izi olarak kullanılabilir. Bu yöntem, protein katlanması ve stabilizasyonunda yer alan önemli amino asitleri sorgulamak için kullanılabilir. SMFS deneylerinde gözlemlenen karakteristik kuvvet uzama davranışını tedavi etmek için literatürde birçok model bildirilmiştir. En yaygın olarak kullanılan modeller arasında serbest mafsallı zincir (FJC) model22, sonsuz mafsallı zincir (WLC) model18,23-25 ve serbestçe dönen zincir (FRC) model25,26 bulunur.
Önceki çalışmamız11'de, kohezin ve dockerin modüllerinin etkileşimini araştırmak için tek moleküllü kuvvet spektroskopisi kullandık. Burada, enzim-dockerin ve CBM-kohezin protein yapıları ile cam yüzey ve konsol fonksiyonelizasyonu için deneysel bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, veri toplama ve analiz prosedürlerini içeren AFM tabanlı bir SMFS protokolü sunuyoruz. Açıklanan protokol diğer moleküler sistemlere kolayca genelleştirilebilir ve yüksek afiniteli reseptör ligand çiftleri ile ilgilenen araştırmacılar için özellikle yararlı olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropil dimetil etoksisilan</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB110423</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa NHS-PEG-maleimid</td><td>Rapp Polimer</td><td>13 5000-65-35</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Disülfür indirgeyici jel</td><td>Thermo Scientific, Pierce</td><td>77712</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/pierce">www.thermoscientific.com/pierce</a></td></tr><tr><td>Tris(hidroksimetil)aminometan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLever mini silisyum nitrür konsollar</td><td>Olympus</td><td>BL-AC40TS-C2</td><td>Yumuşak partiler</td></tr><tr><td>XYZ Piezoelektrik aktüatörler</td><td>Physik Instrumente GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kızılötesi " geniş spektrum" IR lazer</td><td>Superlum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D AFM Kontrol Cihazı</td><td>İltica Araştırması</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6.31</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Veri toplama ve analizi</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH Metre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum borat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cımbız</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapak gözlükleri</td><td>Thermo Scientific, Menzel-Gl&auml; ser</td><td></td><td>24 mm çap, 0,5 mm kalınlık</td></tr><tr><td>PTFE numune tutucu</td><td></td><td></td><td>ısmarlama</td></tr><tr><td>Sonikatör banyosu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td>analitik saflık</td></tr><tr><td>Sülfürik asit (konsantre)</td><td></td><td></td> <td>analitik saflık</td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit (% 30)</td><td></td><td></td> <td>analitik saflık</td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toluen</td><td></td><td></td><td>analitik saflık</td></tr><tr><td>Filtre kağıdı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam slaytlar Mikrotüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotüpler için uygun</td><td>santrifüj</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Döndürücü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beherler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optik mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

afm-tabanlı tek-molekül kuvvetleri spektroskopisi ile cellulosome reseptör-ligand sistemleri araştırılması

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes lignoselülozik alt tabakaların sindirimi anaerobik bakteri ve mantar bir alt kümesi tarafından kullanılan ayrı çoklu enzim kompleksleridir. Katalitik olmayan iskele proteine ​​enzimlerin montaj etkileşim cohesin ve dockerin modülleri içeren ilgili reseptör-ligand çifti bir aile arasındaki etkileşimler ile yönlendirilir. Konvansiyonel dökme yöntemleri ile doğru off-rate ölçümlerini engel olabilir nanomolar aralığında düşük pikomolar DİSOSİASYON sabitler, içinde ve kohezinin dockerin modüller sonuçlar arasında son derece güçlü bağlama. Atomik kuvvet mikroskopu ile tek molekül kuvvet spektroskopisi (SMFs) zorlamak için bireysel biyomoleküllerin tepki ölçer ve diğer tek molekül manipülasyon yöntemleri (örneğin optik cımbız) aksine, yüksek afiniteli reseptör-ligand etkileşimlerini incelemek için uygun olduğu için yüksek kuvvet rejimi (&gt; 120 pN) prob kabiliyetini. Burada Cellul eğitim için tam bizim protokol mevcuttek-molekül düzeyinde protein osomal meclisleri. Yerel cellulosome türetilen bir protein topoloji kullanarak, modül cohesin (CBM-cohesin) füzyon proteinleri, bir sistein artığı da erişilebilir bir serbest tiyol grubu ile her bir bağlama enzim dockerin ve karbohidrat ile çalışmıştır. Biz yüksek yakınlık kompleksi için ayrıntılı bağlama parametrelerini elde etmek için bizim ölçüm ve veri analizi prosedürü ile birlikte, sitemiz-spesifik yüzey immobilizasyon protokol mevcut. Biz tek subdomain açılımı güçleri, karmaşık kopma kuvvetleri, off-oranları kinetik ve iyi bağlayıcı potansiyel genişlikleri ölçmek nasıl gösterilmektedir. Multidomain selülolitik komplekslerinin topluluğundan sorumlu-cohesin dockerin etkileşimi karakterize etmede, bu yöntemlerin başarılı bir uygulama daha da tarif edilmektedir.

C. thermocellum'dan alınan bir tip I kohezin-dockerin çiftini incelemek için açıklanan prosedürü kullandık. Kohezin-dockerin çiftinin başarılı bir şekilde bağlanmasının ardından, kaydedilen kuvvet-mesafe izleri karakteristik pik desenleri göstermiştir. Tipik bir iz Şekil 4a'da gösterilmiştir. İzdeki her bir pik, bir protein alt alanının açılmasını temsil ederken, son pik reseptör-ligand kompleksinin ayrışmasına karşılık gelmektedir.
Bu çalışmada incelenen CBM-kohesin-...

Selülozomlar, selülozu sindirmek için tasarlanmış multienzim kompleksleridir. AFM tabanlı SMFS, selülozomla ilişkili protein düzeneklerinin mekanik özelliklerini ve katlanma konfigürasyonunu incelemek için kullanıldı. Selülozom montajında yer alan bireysel reseptör-ligand komplekslerinin etkileşimlerini incelemek için protein immobilizasyonu, veri toplama ve veri analizi için eksiksiz bir iş akışı sunuyoruz.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, FM tabanlı tek molekül kuvvet spektroskopisi kullanarak füzyon protein bağlama ortaklarının mekanik özelliklerini ve katlanma durumlarını incelemektir. Bu, ikinci bir adım olarak, iyi tanımlanmış bir çekme geometrisi elde etmek amacıyla protein bağlama ortaklarının bir cam lam üzerine ve bir AFM konsoluna kovalent olarak immobilize edilmesiyle gerçekleştirilir. Cam yüzey, reseptör-ligand bağlanmasının kurulmasını sağlayan konsol ile bastırılır.Ardından, tekil protein domenlerini açmak ve reseptör ligand kompleksini ilişkilendirmek için konsol sabit bir hızla geri çekilir; böylece polimer elastikite modellerinde ortaya çıkan ve açılma yolu boyunca enerji bariyerleri olarak işlev gören üçüncül yapısal elementleri açığa çıkaran sonuçlar elde edilir. Bağlanma ortakları hakkında daha fazla kinetik ve enerjik bilgi, kinetik modellerin dinamik kuvvet spektrumuna uydurulmasıyla elde edilebilir. Bu prosedürün genel amacı, proteinlerin kuvvet altındaki açılma yollarını incelemektir.Bu yöntem, proteinlerin mekanik stabilitesi hakkında içgörü sağlayabilir. Erişilebilir bir dosya grubu ile mühendisliği yapılabilen herhangi bir protein reseptör ligand sistemine uyg

investigating-receptor-ligand-systems-cellulosome-with-afm-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Çok çeşitli tek molekülleri kovalent olarak bir AFM ucuna bağlamak için bir protokol sunulmuştur. Bu moleküllerin katı mesnetler ve biyo-arayüzler üzerindeki yapışma kuvvetini ve serbest enerjisini belirlemek için prosedürler ve örnekler verilmiştir.

Atomik Kuvvet Spektroskopi Tek Molekül Yapışma incelenmesi

Desteklenen lipid çift katmanlarının hazırlanması ve atomik kuvvet mikroskobu ve kuvvet spektroskopisi kullanılarak karakterizasyonu için bir protokol açıklıyoruz.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Tek bir T lenfositinde kuvvet regülasyonlu tek reseptör-ligand bağlanma kinetiğini ve kalsiyum sinyalinin gerçek zamanlı görüntülemesini aynı anda ölçmek için bir teknik açıklıyoruz.

Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal

Biz sıvı genlik modülasyonu (dokunarak modu) atomik kuvvet mikroskobu ile alt nanometre çözünürlüklü görüntüler elde etmek için bir yöntem mevcut. yöntem ticari atomik kuvvet mikroskobu üzerinde gösterilmiştir. Biz parametrelerin seçimlerimizde arkasındaki mantığı açıklamak ve çözünürlük optimizasyonu için stratejiler önermek.

Sıvı olarak Genlik modülasyonu Atomik Kuvvet Mikroskobu ile alt nanometre Çözünürlüklü Görüntüleme

Biz ayrıntılı yordamlar ve mekanik özellikleri ve mekanik unfolding yollar tek protein moleküllerinin bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için stratejileri açıklar. Ayrıca seçim ve bloklama iyi tek protein molekülü kayıtları için bir başvuru olarak temsilcisi sonuçları göster.

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

Bu iletişim kuralı ile örneklenir bir heterobifunctional silane Bağlantı Aracısı atomik kuvvet mikroskobu dayalı tek molekül kuvvet spektroskopisi için tasarlanmış silikon-oksit yüzeyler için proteinlerin immobilizasyon kovalent açıklar RrgA etkileşim (pilus-1 İpucu adhesin, S. pneumoniae) fibronektin ile.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

Biz immunolojik çalışmalar için tek bir T hücresi ve boncuk parçacık ile Atomic Force mikroskop (AFM) konsol functionalize bir protokol sunuyoruz. AFM tarafından tek çifti T hücreli dendritik hücre bağlayıcılığı araştırması ve makrofajların gerçek zamanlı hücresel tepkisi ile AFM tarafından floresans görüntüleme ile tek bir katı parçacığın izlenmesi için prosedürler gösterilmektedir.

Tek-T hücreleri veya tek parçacık Immünolojik tek hücreli kuvvet spektroskopisi ile Atomic Force mikroskop Cantilevers functionalization

Burada, protein monomerini kontrollü bir dizi ile protein polimeri oluşturan enzimler tarafından biraraya getirmek ve tek moleküllü kuvvet spektroskopisi çalışmaları için yüzeyde hareketsiz hale getirmek için bir protokol sokuyoruz.

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Prob moleküllerinin atomik kuvvet mikroskobuna kovalent bağlanması (AFM) kantilever uçları fiziksel özelliklerinin araştırılması için gerekli bir tekniktir. Bu bize yüksek tekrarlanabilirlik ile AFM tabanlı tek molekül kuvvet spektroskopisi ile polimerlerin germe kuvveti, desorpsiyon kuvveti ve uzunluğu belirlemenize olanak sağlar.

AFM tabanlı Kuvvet Spektroskopisi için Tek Moleküllerin Kovalent Eki

Bu protokol, yüzlerce mikrobiyal hücre üzerinde AFM ölçümlerini otomatikleştirmeyi amaçlamaktadır. İlk olarak, mikroplar PDMS damga mikroyaplarına hareketsiz hale getirilir ve daha sonra yüzlerce hareketsiz hücre üzerinde kuvvet spektroskopisi ölçümleri otomatik olarak yapılır.

Yüzlerce C. albicans Hücresinde Biyo-Atomik Kuvvet Mikroskop Ölçümlerinin Otomasyonu

Atomik Kuvvet Mikroskopisi-Kızılötesi Spektroskopi (AFM-IR), bakteriyel çalışmalar için güçlü bir platform sağlayarak nano ölçekli çözünürlük elde etmeyi sağlar. Her ikisi de, hücre altı değişikliklerin haritalandırılması (örneğin, hücre bölünmesi üzerine) ve kimyasal bileşimin karşılaştırmalı çalışmaları (örneğin, ilaç direncinden kaynaklanan) bakterilerde tek bir hücre düzeyinde yapılabilir.

Atomik Kuvvet Mikroskopisi, Tek Bakteri Kimyasını Araştırmak için Bir Araç Olarak Kızılötesi Spektroskopi ile Birleştirildi

Keşfedin AFM tabanlı tek-molekül kuvvet spektroskopisi ile cellulosome reseptör-ligand sistemlerinin mekanik özelliklerini ve katlanma durumlarını. Bu yöntem biyofizik araştırmalarında protein etkileşimlerini anlamaya yardımcı olur.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Daha fazla video keşfet