AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Aşağıdaki deneyin genel amacı, FM tabanlı tek molekül kuvvet spektroskopisi kullanarak füzyon protein bağlama ortaklarının mekanik özelliklerini ve katlanma durumlarını incelemektir. Bu, ikinci bir adım olarak, iyi tanımlanmış bir çekme geometrisi elde etmek amacıyla protein bağlama ortaklarının bir cam lam üzerine ve bir AFM konsoluna kovalent olarak immobilize edilmesiyle gerçekleştirilir. Cam yüzey, reseptör-ligand bağlanmasının kurulmasını sağlayan konsol ile bastırılır.

Ardından, tekil protein domenlerini açmak ve reseptör ligand kompleksini ilişkilendirmek için konsol sabit bir hızla geri çekilir; böylece polimer elastikite modellerinde ortaya çıkan ve açılma yolu boyunca enerji bariyerleri olarak işlev gören üçüncül yapısal elementleri açığa çıkaran sonuçlar elde edilir. Bağlanma ortakları hakkında daha fazla kinetik ve enerjik bilgi, kinetik modellerin dinamik kuvvet spektrumuna uydurulmasıyla elde edilebilir. Bu prosedürün genel amacı, proteinlerin kuvvet altındaki açılma yollarını incelemektir.

Bu yöntem, proteinlerin mekanik stabilitesi hakkında içgörü sağlayabilir. Erişilebilir bir dosya grubu ile mühendisliği yapılabilen herhangi bir protein reseptör ligand sistemine uygulanabilir. Bu yöntemi ilk kez kullanan araştırmacılar, zamanlamanın kritik olması ve konsolların (cantilever) kullanımının zor olabilmesi nedeniyle güçlük çekebilirler.

Bu yöntem, çok bölgeli bir proteinin nasıl açıldığı gibi biyofizik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlamak için, 24 mm çapında ve 0,5 mm kalınlığında iki adet cam lamelleti bir PTFE tutucuya yerleştirin; ardından lamelleri %50 etanol ve %50 ultra saf su karışımı içerisinde 15 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun.

Sonikasyon tamamlandığında, lamel örtülerini ultrapure su ile durulayın ve 30 dakika boyunca piranha çözeltisinde dağlayın. 30 dakika sonra lamel örtülerini çıkarın, ultrapure su ile durulayın ve hafif bir azot akışı altında kurutun. Ardından lamel örtülerini, etanol, ultrapure su ve üç amino propil dimetil ahoy içeren 45:5:1 oranındaki bir karışıma daldırın.

Daldırma örneklerini, oda sıcaklığında, yaklaşık 50 devir/dakika hızda 60 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin. Ardından, lamelin sırasıyla %100 etanol ve ardından ultrapure su içerisine ikişer kez daldırılmasını sağlayın. Lamelleri tekrar hafif bir nitrojen akımı altında kurutun.

Kuruduktan sonra, lamelleri 80 °C sıcaklıktaki fırında 30 dakika boyunca pişirin. Kullanılmayan lamelleri, silikon konsol uçlarının aminoizasyonunu gerçekleştirmek için argon altında altı haftaya kadar saklayın. Öncelikle dört adet silikon konsolu temiz bir cam lam üzerine yerleştirin ve bunları 15 dakika boyunca UV ozon ile işleme tabi tutun.

Ardından konsolları, %50 etanol ve %50 üç amino propil dimetil oksisilen çözeltisi ile %0,25 ultrapure su karışımında üç dakika boyunca bekletin. Daha sonra konsolları sırasıyla toluen, etanol ve ultrapure su içeren beherlerde 60 saniye boyunca durulayın. Son durulamadan sonra konsolları filtre kağıdı üzerinde dikkatlice kurulayın.

Konsol kollarını temiz bir cam lam üzerine yerleştirin ve 80 °C'de 30 dakika boyunca pişirin. Önce 200 µL'lik bir pipet ucunun ucunu keserek çapını genişletip ardından her bir 1,5 mL'lik mikrotüpe 100 µL stok boncuk çözeltisi pipetleyerek iki adet TEP diss sülfür indirgeyen boncuk hazırlayın. Ardından, TEP boncuk bulamacı içeren tüplere 1 mL TBS ekleyin ve mikrotüpü kısa süreli vorteksleyerek boncukları durulayın.

Ardından, örnekleri 850 Gs'de üç dakika santrifüj ederek boncukları çöktürün. Süpernatantı bir mikro pipetle dikkatlice çekip atın ve boncukları bir mililitre TBS ile iki kez daha yıkayın. Yıkamalar arasında santrifüj işlemi uygulayın; son yıkamadan sonra, TEP boncuklarına bir ila iki oranında, mililitre başına üç miligram konsantrasyonda bir protein çözeltisi ekleyin ve hava kabarcığı oluşumunu önlemek için süspansiyonu bir mikro pipet ucuyla karıştırarak nazikçe harmanlayın.

Ardından, protein TEP boncuk süspansiyon karışımını bir rotatora yerleştirip 2,5 saat bekletin. Yüzeydeki primer amin gruplarını deprotonize etmek için amino göz konsollarını ve örtü lamellerini 8,5 pH değerindeki sodyum bat tamponunda 45 dakika boyunca bekletin. Daha sonra N-H-S-P-E-G malam tozunu oda sıcaklığına getirin ve sodyum boy sekiz tamponu içerisinde vorteksleyerek 25 µM konsantrasyonda 210 µL hazırlayın.

NHS'nin son derece kısa yarı ömrü nedeniyle çözelti mümkün olduğunca hızlı kullanılmalıdır. pH 8.5'te, N-H-S-P-E-G malam çözeltisinden 30 µL damlacıkları hızlıca bir Petri kabına ve 90 µL'yi her iki cam lamellein üzerine damlatın. Kantilevleri dikkatlice 30 µL'lik damlacıkların içine yerleştirin.

Ardından, damlacık bulunmayan lamelin tersini, N-H-S-P-E-G malam çözeltisi bulunan bir lamelin üzerine kapatarak N-H-S-P-E-G MALAM çözeltisi ile bir sandviç yapısı oluşturun. Ardından, konsol kirişleri ve lamelleri N-H-S-P-E-G MALAM çözeltisi içinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. TEP boncuğu ve indirgenmiş protein çözeltisini 100 GS hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı toplayın.

Ardından, protein çözeltisini TBS ile seyreltin. Yüzey konjugasyonu sırasında 0.5 ile iki mg/mL arasında bir protein konsantrasyonu hedefleyin. Daha sonra, konsantrasyonu azaltılmış ve seyreltilmiş protein çözeltilerini, konsol ve lamel temizliği yaparken birkaç dakika boyunca kenara ayırın.

Lamelleri, üç ardışık ultrapure su beheri içerisinde durulayın. Lamellerin kenarlarına dikkatlice filtre kağıdı değdirerek kalıntı sıvıları uzaklaştırın. Ardından lamelleri AFM cihazı ile uyumlu uygun bir numune tutucuya yerleştirin ve kalıntı sıvıları hafif bir nitrojen akımı altında kurutun.

Seyreltilmiş protein çözeltisinden 20 µL'lik bir damlayı lamelin merkezine uygulayın. Ardından konsolları (cantilevers), sırayla üç farklı ultra saf su beheri ile durulayın ve ardından ikinci seyreltilmiş protein çözeltisinden 30 µL'lik damlalar ekleyin. Pegillenmiş lamelleri ve konsolları, ilgili seyreltilmiş protein çözeltileri ile birlikte oda sıcaklığında bir nem odasında bir ila iki saat boyunca inkübe edin.

Ardından, bir pipet kullanarak lamelleri bir mililitre TBS ile en az 10 kez durulayın ve ardından ölçüme kadar TBS içinde saklayın. Ayrıca, bağlanmamış proteinleri uzaklaştırmak için konsolları (cantilevers) TBS içeren üç ardışık beher kullanarak durulayın ve onları da TBS içinde saklayın. Fonksiyonelleştirilmiş konsolu ve cam lamelleri, sıvılarda ölçüme uygun olan ve Z piyezosunda yaklaşık 200 ile 5.000 nanometre/saniye arasında erişilebilir bir hız aralığını destekleyen bir AFM modeline yerleştirin.

Montaj sırasında havaya maruz kalmayı en aza indirin; lazer ışınının doğru ayarlanmasının ardından, tüm süreç boyunca yüzeylerin tampon çözelti ile kaplı olduğundan emin olun. Herhangi bir kayma etkisini azaltmak için sistemin en az 30 dakika boyunca dengelenmesini bekleyin ve gerekirse yeniden ayar yapın. Ardından, kohezyonun başarılı bir şekilde bağlanmasını takiben ölçümleri almaya başlayın.

Burada gösterilen kaydedilmiş kuvvet-mesafe izleri, karakteristik bir pik paterni sergilemektedir. İzdeki her bir pik, bir protein alt alanının açılmasını temsil ederken, son pik reseptör-ligand kompleksinin ayrışmasına karşılık gelir.

Kaydedilen kuvvet-mesafe izleri daha sonra kuvvet-kontur uzunluğu uzayına dönüştürülmüş ve bir bariyer konum histogramında birleştirilmiştir. Veriler, kohezif docker ve etkileşiminin enerji manzarasını incelemek amacıyla xin domaininin açılmasına kesin olarak atfedilebilen yaklaşık 89 nanometre tutarında bir kontur uzunluğu artışı göstermektedir. Dört farklı çekme hızında toplam 186 veri izi elde edilmiştir.

Büyük mavi dairelerle gösterilen sonuç dinamik kuvvet spektrumu, belirli bir yükleme hızındaki en olası kopma kuvvetlerini temsil eder. Bu değerler daha sonra Bell Evans modeline uydurulmuş ve bu uyum sonucunda, daha önce yayınlanmış sonuçlarla iyi bir uyum içinde olduğu tespit edilen Koff ve delta X değerleri elde edilmiştir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, deney kısmı sekiz ila dokuz saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürün ardından, geliştirme işlemi tamamlandıktan sonra bağlanma için kritik olan amino asitleri belirlemek amacıyla takip eden bir deneyde bölgeye özgü mutajenez gerçekleştirilebilir. Bu teknik, tek molekül biyofiziği alanındaki araştırmacıların protein katlanma manzaralarını keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Biz bu yöntemi, bilinen mekanik olarak en kararlı protein sistemleri arasında yer alan selüloz SOE'lerinin mekanik özelliklerini incelemek için kullanıyoruz.

Bu videoyu izledikten sonra, protein reseptör ligand çiftleri üzerinde tek molekül kuvvet spektroskopisinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.