Name: AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Keşfedin AFM tabanlı tek-molekül kuvvet spektroskopisi ile cellulosome reseptör-ligand sistemlerinin mekanik özelliklerini ve katlanma durumlarını. Bu yöntem biyofizik araştırmalarında protein etkileşimlerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Avrupa Araştırma Konseyi'nin Hermann Gaub'a verdiği ileri düzey hibeden fon sağlandığını kabul ediyor. Michael A. Nash, Society in Science - The Branco Weiss Fellowship programından sağlanan fonu minnetle kabul eder. Yazarlar, Weizmann Bilim Enstitüsü'nden Edward A. Bayer, Yoav Barak ve Daniel B. Fried'e bu çalışmada kullanılan proteinleri cömertçe sağladıkları için teşekkür eder. Yazarlar yararlı tartışmalar için Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner ve Stefan W. Stahl'a teşekkür eder.

<ol><li>Bayer, E. A., Belaich, J. P., Shoham, Y., Lamed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellulosomes%3A+Multienzyme+machines+for+degradation+of+plant+cell+wall+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The cellulosomes: Multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides.</a> Annu. Rev. Microbiol. 58, 521-554 (2004).</li>
<li>Bayer, E. A., Lamed, R., White, B. A., Flint, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Cellulosomes+to+Cellulosomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rec%22%5BJournal%5D)">From Cellulosomes to Cellulosomics.</a> Chem. Rec. 8 (6), 364-377 (2008).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986).</li>
<li>Garcı́a, R., Perez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+atomic+force+microscopy+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamic atomic force microscopy methods.</a> Surf. Sci. Rep. 47 (6), 197-301 (2002).</li>
<li>Engel, A., Müller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+single+biomolecules+at+work+with+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Observing single biomolecules at work with the atomic force microscope.</a> Nat. Struct. Biol. 7 (9), 715-718 (2000).</li>
<li>Li, H., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Mechanics%3A+From+Single+Molecules+to+Functional+Biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Protein Mechanics: From Single Molecules to Functional Biomaterials.</a> Acc. Chem. Res. 43 (10), 1331-1341 (2010).</li>
<li>Florin, E. -L., Moy, V. T., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+forces+between+individual+ligand-receptor+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs.</a> Science. 264 (5157), 415-417 (1994).</li>
<li>Oberhauser, A., Hansma, P., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+unfolding+of+titin+under+force-clamp+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (2), 468-472 (2001).</li>
<li>Puchner, E. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+function%3A+probing+proteins+with+AFM-based+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Force and function: probing proteins with AFM-based force spectroscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19 (5), 605-614 (2009).</li>
<li>Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J., Gaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+unfolding+of+individual+titin+immunoglobulin+domains+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM.</a> Sci. 276 (5315), 1109-1112 (1997).</li>
<li>Stahl, S. W., Nash, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+dissection+of+the+high-affinity+cohesin%E2%80%93dockerin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin–dockerin complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (50), 20431-20436 (2012).</li>
<li>Boland, T., Ratner, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+hydrogen+bonding+in+DNA+nucleotide+bases+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of hydrogen bonding in DNA nucleotide bases by atomic force microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5297-5301 (1995).</li>
<li>Morfill, J., Kühner, F., Blank, K., Lugmaier, R. A., Sedlmair, J., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-S+Transition+in+Short+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">B-S Transition in Short Oligonucleotides.</a> Biophys. J. 93 (7), 2400-2409 (2007).</li>
<li>Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+mechanics+of+single+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules.</a> Nat. Struct. Biol. 6 (4), 346-350 (1999).</li>
<li>Severin, P. M. D., Zou, X., Gaub, H. E., Schulten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+methylation+alters+DNA+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cytosine methylation alters DNA mechanical properties.</a> Nucleic Acids Res. 39 (20), 8740-8751 (2011).</li>
<li>Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li>
<li>Giannotti, M. I., Vancso, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Single+Synthetic+Polymer+Chains+and+Polysaccharides+by+AFM-Based+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Single Synthetic Polymer Chains and Polysaccharides by AFM-Based Force Spectroscopy.</a> Chem. Phys. Chem. 8 (16), 2290-2307 (2007).</li>
<li>Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Stretched+Single+Polymers%3A+Atomic-Force-Microscope+Experiments+Versus+Ab-Initio+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory.</a> Phys. Rev. Lett. 94 (4), 10-1103 (2005).</li>
<li>Nash, M. A., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Adhesion+of+a+Stimuli-Responsive+Oligo%28ethylene+glycol%29+Copolymer+to+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Adhesion of a Stimuli-Responsive Oligo(ethylene glycol) Copolymer to Gold.</a> ACS Nano. 6 (12), 10735-10742 (2012).</li>
<li>Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscapes+of+receptor-ligand+bonds+explored+with+dynamic+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy.</a> Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).</li>
<li>Morfill, J., Neumann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-based+Analysis+of+Multidimensional+Energy+Landscapes%3A+Application+of+Dynamic+Force+Spectroscopy+and+Steered+Molecular+Dynamics+Simulations+to+an+Antibody+Fragment%E2%80%93Peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Complex.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Force-based Analysis of Multidimensional Energy Landscapes: Application of Dynamic Force Spectroscopy and Steered Molecular Dynamics Simulations to an Antibody Fragment–Peptide.</a> Complex. J. Mol. Biol. 381 (5), 1253-1266 (2008).</li>
<li>Ortiz, C., Hadziioannou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropic+Elasticity+of+Single+Polymer+Chains+of+Poly%28methacrylic+acid%29+Measured+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Entropic Elasticity of Single Polymer Chains of Poly(methacrylic acid) Measured by Atomic Force Microscopy.</a> Macromolecules. 32 (3), 780-787 (1999).</li>
<li>Bustamante, C., Marko, J. F., Siggia, E. D., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropic+Elasticity+of+l-phage+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Entropic Elasticity of l-phage DNA.</a> Science. 265 (5178), 1599-1600 (1994).</li>
<li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28 (26), 8759-8770 (1995).</li>
<li>Puchner, E. M., Franzen, G., Gautel, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+Proteins+by+Their+Unfolding+Pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Comparing Proteins by Their Unfolding Pattern.</a> Biophys. J. 95 (1), 426-434 (2008).</li>
<li>Livadaru, L., Netz, R. R., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+Response+of+Discrete+Semiflexible+Polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching Response of Discrete Semiflexible Polymers.</a> Macromolecules. 36 (10), 3732-3744 (2003).</li>
<li>Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based%2C+site-specific+and+covalent+immobilization+of+biomolecules+for+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments.</a> Nat. Protoc. 5 (6), 975-985 (2010).</li>
<li>Gumpp, H., Stahl, S. W., Strackharn, M., Puchner, E. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastable+combined+atomic+force+and+total+internal+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Ultrastable combined atomic force and total internal fluorescence microscope.</a> Rev. Sci. Instrum. 80 (6), 063704 (2009).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+force+microscope+springs+optimized+for+optical-beam+deflection+and+with+tips+made+by+controlled+fracture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Scanning force microscope springs optimized for optical-beam deflection and with tips made by controlled fracture.</a> J. Appl. Phys. 76 (1), 172 (1994).</li>
<li>Cook, S. M., Lang, K. M., Chynoweth, K. M., Wigton, M., Simmonds, R. W., Schäffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17 (9), 2135-2145 (2006).</li>
<li>Proksch, R., Schäffer, T. E., Cleveland, J. P., Callahan, R. C., Viani, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite+optical+spot+size+and+position+corrections+in+thermal+spring+constant+calibration%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Finite optical spot size and position corrections in thermal spring constant calibration.</a> Nanotechnology. 15 (9), 1344-1350 (2004).</li>
<li>Ainavarapu, S. R. K., Brujic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contour+Length+and+Refolding+Rate+of+a+Small+Protein+Controlled+by+Engineered+Disulfide+Bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Contour Length and Refolding Rate of a Small Protein Controlled by Engineered Disulfide Bonds.</a> Biophys. J. 92 (1), 225-233 (2007).</li>
<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Molecular+Fingerprints+in+Single+Molecule+Force+Spectroscopy+Using+Pattern+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition.</a> Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+strength+of+molecular+adhesion+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic strength of molecular adhesion bonds.</a> Biophys. J. 72 (4), 1541-1555 (1997).</li>
<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+by+mechanical+triangulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protein structure by mechanical triangulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Rates+and+Activation+Free+Energies+from+Single-Molecule+Pulling+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments.</a> Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).</li>
<li>Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+widespread+nonlinear+force+spectra+of+intermolecular+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi deneylerinden anlamlı veriler elde etmek için iyi tanımlanmış ve tekrarlanabilir çekme geometrileri elde etmek çok önemlidir. Burada kullanılan protokol, tanımlanmış bir çekme geometrisinde protein komplekslerinin bölgeye özgü immobilizasyonu ile sonuçlanır.
Bu çalışmada kullanılan konsollar, kuvvet hassasiyetleri ve sudaki yüksek rezonans frekansları nedeniyle seçilmiştir. Ayrıca, yaklaşık 10 nm'lik küçük uç eğriliği, çoklu etkileşim olasılığının azalması n...

Selülozomlar, bitki hücre duvarı lignoselülozunu çözünür oligosakkaritlere verimli bir şekilde depolimerize etmek için evrimleşmiş anaerobik selülolitik bakterilerin (örneğin C. thermocellum) yüzeyinde görüntülenen büyük multienzim kompleksleridir1. Selülozomların merkezi bir özelliği, yüksek afiniteli kohezite-dockerin etkileşimidir. En belirgin paradigmada, çeşitli bakteriyel enzimlerin C-terminal ucunda yüksek oranda korunmuş bir 60-75 amino asit tip I dockerin modülü görüntülenir. Docker modülü, enzimlerin sinerjik kombinasyonlarının, tip I dockerin modülüne özgü kohezin alanlarının bir poliproteinini içeren katalitik olmayan iskele proteini ('iskele') üzerine montajını yönlendirir. Daha yüksek seviyelerde, selülozom mimarisi çok karmaşık hale gelebilir, yapıları hücre yüzeyine sabitleyen ve çoklu iskele içeren dallı yapıların montajına izin veren alternatif kohezin ve dockerin çiftlerini (örneğin tip II, tip III) içerebilir2. Çeşitli kohezin-dockerin tipleri, ilgili yapılara sahip olmalarına rağmen, istenmeyen iskeleler veya diğer selülozom üreten bakteri türlerinden gelen bileşenlerle çapraz reaktiviteyi baskılayan diferansiyel bağlanma özgüllükleri sergiler. Biyoinformatik yaklaşımlar genetik düzeyde binlerce benzersiz selülozomal bileşeni başarıyla tanımlamış olsa da, nispeten az sayıda protein yapısı bilinmektedir ve kohezin-dockerin özgüllüğünün belirlenmesinde iş başında olan mekanizmalar, yapısal biyoloji araştırmalarının aktif bir alanı olmaya devam etmektedir.
Binnig ve arkadaşları tarafından atomik kuvvet mikroskobunun (AFM) icadından bu yana.3, temassız görüntüleme, salınım modu görüntüleme4 ve tek moleküllü kuvvet spektroskopisi (SMFS) 5,6 dahil olmak üzere çeşitli AFM operasyonel modları geliştirilmiş ve sürekli iyileştirilmiştir. SMFS, tek tek proteinleri7-11, nükleik asitleri12-15 ve sentetik polimerleri16-19 doğrudan araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniğe dönüşmüştür. Reseptör-ligand bağlanmasını araştırmak için tipik bir SMFS deneyinde20,21, bir AFM konsol ucu, bağlanma ortaklarından biri ile modifiye edilirken, düz bir cam yüzey tamamlayıcı bağlama ortağı ile modifiye edilir. Modifiye edilmiş konsol, yüzeyle temas ettirilerek ortakların bağlanmasına izin verilir. Konsolun tabanı daha sonra sabit hızda geri çekilir ve kuvvet, optik kol sapma yöntemi kullanılarak ölçülür. Ortaya çıkan kuvvet-mesafe veri izleri, bağlanma kurulmuşsa testere dişi benzeri tepeler sergiler. Bağlanma ortaklarının birden fazla protein alanına kaynaştığı durumlarda, kuvvet-mesafe izindeki her bir zirve, tek bir protein alanının veya katlanmış alt alanın açılmasıyla ilişkilendirilebilirken, son zirve, protein bağlanma arayüzünün yırtılmasına karşılık gelir. Kuvvete dayanıklı elemanların spesifik konumları, ilgilenilen çeşitli protein alanlarını tanımlamak için parmak izi olarak kullanılabilir. Bu yöntem, protein katlanması ve stabilizasyonunda yer alan önemli amino asitleri sorgulamak için kullanılabilir. SMFS deneylerinde gözlemlenen karakteristik kuvvet uzama davranışını tedavi etmek için literatürde birçok model bildirilmiştir. En yaygın olarak kullanılan modeller arasında serbest mafsallı zincir (FJC) model22, sonsuz mafsallı zincir (WLC) model18,23-25 ve serbestçe dönen zincir (FRC) model25,26 bulunur.
Önceki çalışmamız11'de, kohezin ve dockerin modüllerinin etkileşimini araştırmak için tek moleküllü kuvvet spektroskopisi kullandık. Burada, enzim-dockerin ve CBM-kohezin protein yapıları ile cam yüzey ve konsol fonksiyonelizasyonu için deneysel bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, veri toplama ve analiz prosedürlerini içeren AFM tabanlı bir SMFS protokolü sunuyoruz. Açıklanan protokol diğer moleküler sistemlere kolayca genelleştirilebilir ve yüksek afiniteli reseptör ligand çiftleri ile ilgilenen araştırmacılar için özellikle yararlı olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropil dimetil etoksisilan</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB110423</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa NHS-PEG-maleimid</td><td>Rapp Polimer</td><td>13 5000-65-35</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Disülfür indirgeyici jel</td><td>Thermo Scientific, Pierce</td><td>77712</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/pierce">www.thermoscientific.com/pierce</a></td></tr><tr><td>Tris(hidroksimetil)aminometan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLever mini silisyum nitrür konsollar</td><td>Olympus</td><td>BL-AC40TS-C2</td><td>Yumuşak partiler</td></tr><tr><td>XYZ Piezoelektrik aktüatörler</td><td>Physik Instrumente GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kızılötesi " geniş spektrum" IR lazer</td><td>Superlum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D AFM Kontrol Cihazı</td><td>İltica Araştırması</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6.31</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Veri toplama ve analizi</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH Metre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum borat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cımbız</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapak gözlükleri</td><td>Thermo Scientific, Menzel-Gl&auml; ser</td><td></td><td>24 mm çap, 0,5 mm kalınlık</td></tr><tr><td>PTFE numune tutucu</td><td></td><td></td><td>ısmarlama</td></tr><tr><td>Sonikatör banyosu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td>analitik saflık</td></tr><tr><td>Sülfürik asit (konsantre)</td><td></td><td></td> <td>analitik saflık</td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit (% 30)</td><td></td><td></td> <td>analitik saflık</td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toluen</td><td></td><td></td><td>analitik saflık</td></tr><tr><td>Filtre kağıdı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam slaytlar Mikrotüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotüpler için uygun</td><td>santrifüj</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Döndürücü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beherler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optik mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

afm-tabanlı tek-molekül kuvvetleri spektroskopisi ile cellulosome reseptör-ligand sistemleri araştırılması

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes lignoselülozik alt tabakaların sindirimi anaerobik bakteri ve mantar bir alt kümesi tarafından kullanılan ayrı çoklu enzim kompleksleridir. Katalitik olmayan iskele proteine ​​enzimlerin montaj etkileşim cohesin ve dockerin modülleri içeren ilgili reseptör-ligand çifti bir aile arasındaki etkileşimler ile yönlendirilir. Konvansiyonel dökme yöntemleri ile doğru off-rate ölçümlerini engel olabilir nanomolar aralığında düşük pikomolar DİSOSİASYON sabitler, içinde ve kohezinin dockerin modüller sonuçlar arasında son derece güçlü bağlama. Atomik kuvvet mikroskopu ile tek molekül kuvvet spektroskopisi (SMFs) zorlamak için bireysel biyomoleküllerin tepki ölçer ve diğer tek molekül manipülasyon yöntemleri (örneğin optik cımbız) aksine, yüksek afiniteli reseptör-ligand etkileşimlerini incelemek için uygun olduğu için yüksek kuvvet rejimi (&gt; 120 pN) prob kabiliyetini. Burada Cellul eğitim için tam bizim protokol mevcuttek-molekül düzeyinde protein osomal meclisleri. Yerel cellulosome türetilen bir protein topoloji kullanarak, modül cohesin (CBM-cohesin) füzyon proteinleri, bir sistein artığı da erişilebilir bir serbest tiyol grubu ile her bir bağlama enzim dockerin ve karbohidrat ile çalışmıştır. Biz yüksek yakınlık kompleksi için ayrıntılı bağlama parametrelerini elde etmek için bizim ölçüm ve veri analizi prosedürü ile birlikte, sitemiz-spesifik yüzey immobilizasyon protokol mevcut. Biz tek subdomain açılımı güçleri, karmaşık kopma kuvvetleri, off-oranları kinetik ve iyi bağlayıcı potansiyel genişlikleri ölçmek nasıl gösterilmektedir. Multidomain selülolitik komplekslerinin topluluğundan sorumlu-cohesin dockerin etkileşimi karakterize etmede, bu yöntemlerin başarılı bir uygulama daha da tarif edilmektedir.

C. thermocellum'dan alınan bir tip I kohezin-dockerin çiftini incelemek için açıklanan prosedürü kullandık. Kohezin-dockerin çiftinin başarılı bir şekilde bağlanmasının ardından, kaydedilen kuvvet-mesafe izleri karakteristik pik desenleri göstermiştir. Tipik bir iz Şekil 4a'da gösterilmiştir. İzdeki her bir pik, bir protein alt alanının açılmasını temsil ederken, son pik reseptör-ligand kompleksinin ayrışmasına karşılık gelmektedir.
Bu çalışmada incelenen CBM-kohesin-...

Selülozomlar, selülozu sindirmek için tasarlanmış multienzim kompleksleridir. AFM tabanlı SMFS, selülozomla ilişkili protein düzeneklerinin mekanik özelliklerini ve katlanma konfigürasyonunu incelemek için kullanıldı. Selülozom montajında yer alan bireysel reseptör-ligand komplekslerinin etkileşimlerini incelemek için protein immobilizasyonu, veri toplama ve veri analizi için eksiksiz bir iş akışı sunuyoruz.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, FM tabanlı tek molekül kuvvet spektroskopisi kullanarak füzyon protein bağlama ortaklarının mekanik özelliklerini ve katlanma durumlarını incelemektir. Bu, ikinci bir adım olarak, iyi tanımlanmış bir çekme geometrisi elde etmek amacıyla protein bağlama ortaklarının bir cam lam üzerine ve bir AFM konsoluna kovalent olarak immobilize edilmesiyle gerçekleştirilir. Cam yüzey, reseptör-ligand bağlanmasının kurulmasını sağlayan konsol ile bastırılır.Ardından, tekil protein domenlerini açmak ve reseptör ligand kompleksini ilişkilendirmek için konsol sabit bir hızla geri çekilir; böylece polimer elastikite modellerinde ortaya çıkan ve açılma yolu boyunca enerji bariyerleri olarak işlev gören üçüncül yapısal elementleri açığa çıkaran sonuçlar elde edilir. Bağlanma ortakları hakkında daha fazla kinetik ve enerjik bilgi, kinetik modellerin dinamik kuvvet spektrumuna uydurulmasıyla elde edilebilir. Bu prosedürün genel amacı, proteinlerin kuvvet altındaki açılma yollarını incelemektir.Bu yöntem, proteinlerin mekanik stabilitesi hakkında içgörü sağlayabilir. Erişilebilir bir dosya grubu ile mühendisliği yapılabilen herhangi bir protein reseptör ligand sistemine uygulanabilir. Bu yöntemi ilk kez kullanan araştırmacılar, zamanlamanın kritik olması ve konsolların (cantilever) kullanımının zor olabilmesi nedeniyle güçlük çekebilirler.Bu yöntem, çok bölgeli bir proteinin nasıl açıldığı gibi biyofizik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlamak için, 24 mm çapında ve 0,5 mm kalınlığında iki adet cam lamelleti bir PTFE tutucuya yerleştirin; ardından lamelleri %50 etanol ve %50 ultra saf su karışımı içerisinde 15 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun.Sonikasyon tamamlandığında, lamel örtülerini ultrapure su ile durulayın ve 30 dakika boyunca piranha çözeltisinde dağlayın. 30 dakika sonra lamel örtülerini çıkarın, ultrapure su ile durulayın ve hafif bir azot akışı altında kurutun. Ardından lamel örtülerini, etanol, ultrapure su ve üç amino propil dimetil ahoy içeren 45:5:1 oranındaki bir karışıma daldırın.Daldırma örneklerini, oda sıcaklığında, yaklaşık 50 devir/dakika hızda 60 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin. Ardından, lamelin sırasıyla %100 etanol ve ardından ultrapure su içerisine ikişer kez daldırılmasını sağlayın. Lamelleri tekrar hafif bir nitrojen akımı altında kurutun.Kuruduktan sonra, lamelleri 80 °C sıcaklıktaki fırında 30 dakika boyunca pişirin. Kullanılmayan lamelleri, silikon konsol uçlarının aminoizasyonunu gerçekleştirmek için argon altında altı haftaya kadar saklayın. Öncelikle dört adet silikon konsolu temiz bir cam lam üzerine yerleştirin ve bunları 15 dakika boyunca UV ozon ile işleme tabi tutun.Ardından konsolları, %50 etanol ve %50 üç amino propil dimetil oksisilen çözeltisi ile %0,25 ultrapure su karışımında üç dakika boyunca bekletin. Daha sonra konsolları sırasıyla toluen, etanol ve ultrapure su içeren beherlerde 60 saniye boyunca durulayın. Son durulamadan sonra konsolları filtre kağıdı üzerinde dikkatlice kurulayın.Konsol kollarını temiz bir cam lam üzerine yerleştirin ve 80 °C'de 30 dakika boyunca pişirin. Önce 200 µL'lik bir pipet ucunun ucunu keserek çapını genişletip ardından her bir 1,5 mL'lik mikrotüpe 100 µL stok boncuk çözeltisi pipetleyerek iki adet TEP diss sülfür indirgeyen boncuk hazırlayın. Ardından, TEP boncuk bulamacı içeren tüplere 1 mL TBS ekleyin ve mikrotüpü kısa süreli vorteksleyerek boncukları durulayın.Ardından, örnekleri 850 Gs'de üç dakika santrifüj ederek boncukları çöktürün. Süpernatantı bir mikro pipetle dikkatlice çekip atın ve boncukları bir mililitre TBS ile iki kez daha yıkayın. Yıkamalar arasında santrifüj işlemi uygulayın; son yıkamadan sonra, TEP boncuklarına bir ila iki oranında, mililitre başına üç miligram konsantrasyonda bir protein çözeltisi ekleyin ve hava kabarcığı oluşumunu önlemek için süspansiyonu bir mikro pipet ucuyla karıştırarak nazikçe harmanlayın.Ardından, protein TEP boncuk süspansiyon karışımını bir rotatora yerleştirip 2,5 saat bekletin. Yüzeydeki primer amin gruplarını deprotonize etmek için amino göz konsollarını ve örtü lamellerini 8,5 pH değerindeki sodyum bat tamponunda 45 dakika boyunca bekletin. Daha sonra N-H-S-P-E-G malam tozunu oda sıcaklığına getirin ve sodyum boy sekiz tamponu içerisinde vorteksleyerek 25 µM konsantrasyonda 210 µL hazırlayın.NHS'nin son derece kısa yarı ömrü nedeniyle çözelti mümkün olduğunca hızlı kullanılmalıdır. pH 8.5'te, N-H-S-P-E-G malam çözeltisinden 30 µL damlacıkları hızlıca bir Petri kabına ve 90 µL'yi her iki cam lamellein üzerine damlatın. Kantilevleri dikkatlice 30 µL'lik damlacıkların içine yerleştirin.Ardından, damlacık bulunmayan lamelin tersini, N-H-S-P-E-G malam çözeltisi bulunan bir lamelin üzerine kapatarak N-H-S-P-E-G MALAM çözeltisi ile bir sandviç yapısı oluşturun. Ardından, konsol kirişleri ve lamelleri N-H-S-P-E-G MALAM çözeltisi içinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. TEP boncuğu ve indirgenmiş protein çözeltisini 100 GS hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı toplayın.Ardından, protein çözeltisini TBS ile seyreltin. Yüzey konjugasyonu sırasında 0.5 ile iki mg/mL arasında bir protein konsantrasyonu hedefleyin. Daha sonra, konsantrasyonu azaltılmış ve seyreltilmiş protein çözeltilerini, konsol ve lamel temizliği yaparken birkaç dakika boyunca kenara ayırın.Lamelleri, üç ardışık ultrapure su beheri içerisinde durulayın. Lamellerin kenarlarına dikkatlice filtre kağıdı değdirerek kalıntı sıvıları uzaklaştırın. Ardından lamelleri AFM cihazı ile uyumlu uygun bir numune tutucuya yerleştirin ve kalıntı sıvıları hafif bir nitrojen akımı altında kurutun.Seyreltilmiş protein çözeltisinden 20 µL'lik bir damlayı lamelin merkezine uygulayın. Ardından konsolları (cantilevers), sırayla üç farklı ultra saf su beheri ile durulayın ve ardından ikinci seyreltilmiş protein çözeltisinden 30 µL'lik damlalar ekleyin. Pegillenmiş lamelleri ve konsolları, ilgili seyreltilmiş protein çözeltileri ile birlikte oda sıcaklığında bir nem odasında bir ila iki saat boyunca inkübe edin.Ardından, bir pipet kullanarak lamelleri bir mililitre TBS ile en az 10 kez durulayın ve ardından ölçüme kadar TBS içinde saklayın. Ayrıca, bağlanmamış proteinleri uzaklaştırmak için konsolları (cantilevers) TBS içeren üç ardışık beher kullanarak durulayın ve onları da TBS içinde saklayın. Fonksiyonelleştirilmiş konsolu ve cam lamelleri, sıvılarda ölçüme uygun olan ve Z piyezosunda yaklaşık 200 ile 5.000 nanometre/saniye arasında erişilebilir bir hız aralığını destekleyen bir AFM modeline yerleştirin.Montaj sırasında havaya maruz kalmayı en aza indirin; lazer ışınının doğru ayarlanmasının ardından, tüm süreç boyunca yüzeylerin tampon çözelti ile kaplı olduğundan emin olun. Herhangi bir kayma etkisini azaltmak için sistemin en az 30 dakika boyunca dengelenmesini bekleyin ve gerekirse yeniden ayar yapın. Ardından, kohezyonun başarılı bir şekilde bağlanmasını takiben ölçümleri almaya başlayın.Burada gösterilen kaydedilmiş kuvvet-mesafe izleri, karakteristik bir pik paterni sergilemektedir. İzdeki her bir pik, bir protein alt alanının açılmasını temsil ederken, son pik reseptör-ligand kompleksinin ayrışmasına karşılık gelir.Kaydedilen kuvvet-mesafe izleri daha sonra kuvvet-kontur uzunluğu uzayına dönüştürülmüş ve bir bariyer konum histogramında birleştirilmiştir. Veriler, kohezif docker ve etkileşiminin enerji manzarasını incelemek amacıyla xin domaininin açılmasına kesin olarak atfedilebilen yaklaşık 89 nanometre tutarında bir kontur uzunluğu artışı göstermektedir. Dört farklı çekme hızında toplam 186 veri izi elde edilmiştir.Büyük mavi dairelerle gösterilen sonuç dinamik kuvvet spektrumu, belirli bir yükleme hızındaki en olası kopma kuvvetlerini temsil eder. Bu değerler daha sonra Bell Evans modeline uydurulmuş ve bu uyum sonucunda, daha önce yayınlanmış sonuçlarla iyi bir uyum içinde olduğu tespit edilen Koff ve delta X değerleri elde edilmiştir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, deney kısmı sekiz ila dokuz saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedürün ardından, geliştirme işlemi tamamlandıktan sonra bağlanma için kritik olan amino asitleri belirlemek amacıyla takip eden bir deneyde bölgeye özgü mutajenez gerçekleştirilebilir. Bu teknik, tek molekül biyofiziği alanındaki araştırmacıların protein katlanma manzaralarını keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Biz bu yöntemi, bilinen mekanik olarak en kararlı protein sistemleri arasında yer alan selüloz SOE'lerinin mekanik özelliklerini incelemek için kullanıyoruz.Bu videoyu izledikten sonra, protein reseptör ligand çiftleri üzerinde tek molekül kuvvet spektroskopisinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

investigating-receptor-ligand-systems-cellulosome-with-afm-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Çok çeşitli tek molekülleri kovalent olarak bir AFM ucuna bağlamak için bir protokol sunulmuştur. Bu moleküllerin katı mesnetler ve biyo-arayüzler üzerindeki yapışma kuvvetini ve serbest enerjisini belirlemek için prosedürler ve örnekler verilmiştir.

Atomik Kuvvet Spektroskopi Tek Molekül Yapışma incelenmesi

Desteklenen lipid çift katmanlarının hazırlanması ve atomik kuvvet mikroskobu ve kuvvet spektroskopisi kullanılarak karakterizasyonu için bir protokol açıklıyoruz.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Tek bir T lenfositinde kuvvet regülasyonlu tek reseptör-ligand bağlanma kinetiğini ve kalsiyum sinyalinin gerçek zamanlı görüntülemesini aynı anda ölçmek için bir teknik açıklıyoruz.

Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal

Burada bir atomik kuvvet mikroskopu (AFM) ile tek bir molekül kuvveti spektroskopi ölçümleri ile iyi tanımlanmış bir inorganik yüzey ve ya peptitler veya amino asitler arasındaki etkileşimlerin kuvvetini ölçmek için bir protokol mevcut. ölçümü ile elde edilen bilgiler, daha peptid inorganik madde interfazda anlamak önemlidir.

Tek Molekül Kuvvetleri Spektroskopisi kullanarak İnorganik Malzemelerle Amino Asitler ve Peptitler Etkileşimi içine Trendleri

Biz ayrıntılı yordamlar ve mekanik özellikleri ve mekanik unfolding yollar tek protein moleküllerinin bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için stratejileri açıklar. Ayrıca seçim ve bloklama iyi tek protein molekülü kayıtları için bir başvuru olarak temsilcisi sonuçları göster.

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

Bu iletişim kuralı ile örneklenir bir heterobifunctional silane Bağlantı Aracısı atomik kuvvet mikroskobu dayalı tek molekül kuvvet spektroskopisi için tasarlanmış silikon-oksit yüzeyler için proteinlerin immobilizasyon kovalent açıklar RrgA etkileşim (pilus-1 İpucu adhesin, S. pneumoniae) fibronektin ile.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

Biz immunolojik çalışmalar için tek bir T hücresi ve boncuk parçacık ile Atomic Force mikroskop (AFM) konsol functionalize bir protokol sunuyoruz. AFM tarafından tek çifti T hücreli dendritik hücre bağlayıcılığı araştırması ve makrofajların gerçek zamanlı hücresel tepkisi ile AFM tarafından floresans görüntüleme ile tek bir katı parçacığın izlenmesi için prosedürler gösterilmektedir.

Tek-T hücreleri veya tek parçacık Immünolojik tek hücreli kuvvet spektroskopisi ile Atomic Force mikroskop Cantilevers functionalization

Burada, protein monomerini kontrollü bir dizi ile protein polimeri oluşturan enzimler tarafından biraraya getirmek ve tek moleküllü kuvvet spektroskopisi çalışmaları için yüzeyde hareketsiz hale getirmek için bir protokol sokuyoruz.

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Prob moleküllerinin atomik kuvvet mikroskobuna kovalent bağlanması (AFM) kantilever uçları fiziksel özelliklerinin araştırılması için gerekli bir tekniktir. Bu bize yüksek tekrarlanabilirlik ile AFM tabanlı tek molekül kuvvet spektroskopisi ile polimerlerin germe kuvveti, desorpsiyon kuvveti ve uzunluğu belirlemenize olanak sağlar.

AFM tabanlı Kuvvet Spektroskopisi için Tek Moleküllerin Kovalent Eki

Bu protokol, yüzlerce mikrobiyal hücre üzerinde AFM ölçümlerini otomatikleştirmeyi amaçlamaktadır. İlk olarak, mikroplar PDMS damga mikroyaplarına hareketsiz hale getirilir ve daha sonra yüzlerce hareketsiz hücre üzerinde kuvvet spektroskopisi ölçümleri otomatik olarak yapılır.

Yüzlerce C. albicans Hücresinde Biyo-Atomik Kuvvet Mikroskop Ölçümlerinin Otomasyonu

Atomik Kuvvet Mikroskopisi-Kızılötesi Spektroskopi (AFM-IR), bakteriyel çalışmalar için güçlü bir platform sağlayarak nano ölçekli çözünürlük elde etmeyi sağlar. Her ikisi de, hücre altı değişikliklerin haritalandırılması (örneğin, hücre bölünmesi üzerine) ve kimyasal bileşimin karşılaştırmalı çalışmaları (örneğin, ilaç direncinden kaynaklanan) bakterilerde tek bir hücre düzeyinde yapılabilir.

Atomik Kuvvet Mikroskopisi, Tek Bakteri Kimyasını Araştırmak için Bir Araç Olarak Kızılötesi Spektroskopi ile Birleştirildi

Keşfedin AFM tabanlı tek-molekül kuvvet spektroskopisi ile cellulosome reseptör-ligand sistemlerinin mekanik özelliklerini ve katlanma durumlarını. Bu yöntem biyofizik araştırmalarında protein etkileşimlerini anlamaya yardımcı olur.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Daha fazla video keşfet