İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, insan timusundan dendritik hücreleri ve epitel hücrelerini izole etmektir. Bu işlem, öncelikle diseke edilen dokunun mekanik parçalama yoluyla fragmanlara ayrılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, tek hücre süspansiyonu elde etmek için doku fragmanları enzimatik olarak daha fazla sindirilir.

Son olarak, hücre süspansiyonu Percoll ayrıştırması ile düşük yoğunluklu hücre fraksiyonu açısından zenginleştirilir. Nihayetinde, dendritik ve epitelyal hücreler bu fraksiyondan manyetik veya FACS ayıklama yoluyla veya her ikisinin kombinasyonu ile izole edilebilir. Burada sunduğumuz yöntem, insan timusunda bulunan dendritik hücreler ve timik epitelyal hücreler gibi nadir hücre popülasyonlarının başarılı izolasyonu ve ardından incelenmesi için verimli, tekrarlanabilir ve maliyet etkin bir prosedür sağlar.

Laboratuvarımızdan lisansüstü öğrencisi I rotta, prosedürü size gösterecektir. İşleme, timus dokusunu oda sıcaklığındaki steril PBS içeren bir Petri kabına yerleştirerek ve kalıntı kanı durulayarak başlayın. Ardından Petri kabına taze PBS ekleyin; pıhtılaşmış kanları, bağ ve yağ dokularını ve dokunun sağlıklı görünmeyen kısımlarını temizlemek için pens ve makas kullanın.

Timus dokusu temizlendikten sonra, referans için tartın ve ardından dokuyu tekdüze boyutlarda, bir santimetreküplük parçalara bölün. Şimdi parçaların üzerini PBS ile kapatın ve buz üzerine yerleştirin. Daha sonra, timositlerin büyük kısmını uzaklaştırmak ve sindirilecek dokunun toplam hacmini azaltmak için, 10 ila 20 mililitrelik steril bir şırınga pistonunun arkasını kullanarak doku üzerine hızlıca hafif bir basınç uygulayın.

Çözelti gözle görülür şekilde bulanıklaşacaktır. Timositler serbest kaldığında, kabı nazikçe karıştırın ve ardından doku parçalarını yanlışlıkla aspire etmemeye dikkat ederek, timus içeren süpernatantı uzaklaştırmak için bir cam aspiratör kullanın. Tüm doku parçalarını kabın bir kenarında toplamak için steril bir hücre kültürü kazıyıcısı kullanmak, ardından kabı 45 derecelik bir açıyla eğerek kalan süpernatantı aspire etmek faydalı olabilir.

Kabı taze PBS ile durulayın ve PBS nispeten şeffaf hale gelene kadar süpernatant toplamaya devam edin. RPMI ile son bir yıkama yapın ve ardından dendritik hücreleri veya dc'leri izole etmek için doku parçalarını, en azından beş mililitrelik bir pipete girebilecek kadar küçük olacak şekilde, keskin bir makasla mümkün olduğunca ince ince kıyın. İlk olarak, dokunun her beş gramı için 10 mililitre kollajenaz DNA çözeltisi ve 10 mililitre RPMI içeren 50 mililitrelik tüplere 10 grama kadar ağ şeklinde doku parçası yerleştirin.

Ardından doku süspansiyonunu 37 °C'lik bir termal inkübatörde, yavaş rotasyon altında 40 dakika boyunca inkübe edin. Hücreler çözündükçe enzim çözeltisi bulanıklaşacaktır. Digestion işleminin sonunda, doku fragmanlarını çöktürmek için hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında, 110 G'de iki dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı toplayın ve ardından hücre süspansiyonunu peletleyin.

Bu kez süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri 10 ila 50 mililitre tam RPMI içerisinde yeniden süspande edin. Peletin boyutuna bağlı olarak, trypan mavi dışlama yöntemiyle canlı hücre sayısını belirleyin ve ardından timik epitel hücrelerini veya t hücrelerini izole etmek için hücre süspansiyonunu, kapağı gevşek bir şekilde 37 degrees Celsius'ta bekletin. Sonrasında, doku kalıntılarını 10 mililitre taze kolajenaz DNA çözeltisi, 10 mililitre RPMI ve tripsin EDTA karışımı içerisinde yeniden süspande edin.

Doku fragmanlarını 37 °C'de, hafif rotasyon eşliğinde 40 dakika boyunca sindirmeye devam edin. İnkübasyonun son 10 ila 15 dakikasında, tripsini nötralize etmek için bir beşe oranında fetal calf serum ekleyin. Doku fragmanlarını çökelttikten sonra süpernatantı toplayın ve hücre süspansiyonunu tekrar santrifüjle çöktürün.

Bu kez, gevşek pellet'i korumaya dikkat ederek süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın. Canlı hücre sayısını belirledikten sonra, bu hücre süspansiyonunu da 37 °C'ye yerleştirin. Düşük yoğunluklu fraksiyon veya LDF hücrelerini zenginleştirmek için, hücreler santrifüjle çökerken, daha önce DC ve tek hücre zenginleştirmesi için ayrılan hücre süspansiyonlarını pelletleme işlemine başlayın.

1,07 g/mL'lik bir Percoll yoğunluk gradyanı hazırlayın. Bu tabloya göre, her iki peleti de hazırlanan Percoll çözeltisinin 6 mL'sinde 1 × 10⁹ hücreye ulaşacak şekilde resüspanse edin. Hücre çözeltisini homojen bir süspansiyon elde etmek için yeterince karıştırın ve ardından çözeltileri 50 mL'lik Oakridge polikarbonat vidalı kapaklı santrifüj tüplerine aktarın.

Ardından, bir pipet kullanarak her tüpteki perca hücre süspansiyonunun üzerine yavaşça 30 milliliters tam RPMI ekleyin. Katmanları karıştırmamaya dikkat ederek tüpleri sabit açılı rotorlu, önceden soğutulmuş bir santrifüje dikkatlice aktarın ve hücreleri 35 minutes boyunca ayırın. Daha sonra, steril posterior pipetler kullanarak, per call ile medyum arasındaki ara yüzeyde bulunan zenginleştirilmiş düşük yoğunluklu hücre fraksiyonlarını, soğuk tam RPM içeren 50 milliliter tüplere dikkatlice aktarın.

Ardından, hücre başına kalan miktarı seyreltmek için tüpleri ek tam RPMI ile doldururum. Son olarak, zenginleştirilmiş hücreleri iki kez tam RPMI ile yıkayıp ardından pelletini taze besiyerinde süspanse ederim ve canlı hücre sayısını belirlerim. Bu ilk şekilde, az önce gösterildiği gibi, 6 yaşındaki bir çocuktan alınan dokuz santimetrelik oldukça büyük bir doku parçası gösterilmiştir.

Önemli bir ilk adım, dokunun istenmeyen kısımlardan temizlenmesidir. Beyaz oklarla gösterildiği gibi, timus dokusunun tek hücre süspansiyonu elde edilmiş ve düşük yoğunluklu fraksiyon hücreleri için zenginleştirilmiştir. Tipik bir tek hücre süspansiyonu, yoğunluk gradyanlı ayırma sonrası yaklaşık %3 H-L-A-D-R pozitif hücre içerirken, bu oran büyük boyutlu hücrelerde %15 ile %40'a çıkmaktadır.

Yüksek yoğunluklu fraksiyon içindeki düşük yoğunluklu fraksiyon, esas olarak tekdüzeli küçük boyutlu timositlerden oluşur. Timik yapıda bu tür hücreler neredeyse hiç yoktur.

Miyeloid dendritik hücreler, CD 11 C dahil olmak üzere bir dizi yüzey belirtecinin ekspresyonu ile tanımlanabilir. Bu şekil, izolasyon sonrası modifiye edilmiş bir manyetik hücre ayırma protokolü kullanılarak CD 11 C pozitif hücrelerin etkin izolasyonunu göstermektedir. İzole edilen hücrelerin immünboyaması ile belirlendiği üzere, CD 11 C pozitif DC'lerin saflığı %93 idi. Ortalama olarak, izole edilen CD 11 C pozitif hücrelerin geri kazanımı, 10⁹ toplam timik hücre başına 5 × 10⁵ ile 5 × 10⁶ miyeloid dendritik hücre arasındadır.

Bu tabloda; farklı yaş ve doku ağırlıklarına sahip, çeşitli girdi tek hücre süspansiyonları kullanılarak birkaç bireysel timus örneğinden elde edilen temsili verilerin yanı sıra, toplam düşük yoğunluklu fraksiyon hücre sayıları ve ardından gelen CD 11 C pozitif verimi ve saflığı yalnızca antijen sunan hücrelerle zenginleştirilmiş fraksiyonda gösterilmiştir. Hücrelerin yaklaşık %0,5'i CD 45, düşük EPCA pozitif veya CD 45 negatif EPAM pozitif kortikal epitelyal hücrelerdir; medüller epitelyal hücreler ise tripsin ile sindirilmiş CD 45 düşük negatif zenginleştirilmiş stromal hücrelerden sırasıyla epam, düşük CDR iki pozitif ve epam yüksek CD iki negatif olarak ayrıştırılabilir. İnsan timusundan dendritik hücrelerin ve timik epitelyal hücre alt kümelerinin izolasyonu.

Süre hassasiyet arz etmektedir. Ulülasyon işlemi ne kadar hızlı gerçekleşirse, hücrelerin durumu o kadar iyi olur. Bu protokolde uzmanlaşıldığında, dendritik hücreler beş ila altı saat içinde ve timik epitel hücreleri sekiz ila 10 saat içinde izole edilebilir.

Bugün bu videoyu izledikten sonra, dendritik hücrelerin ve timik epitelyal hücrelerin başarılı bir şekilde izolasyonu için insan timus dokusunun nasıl işleneceği konusunda çok iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İzole edilen hücreler, hücreleri daha detaylı karakterize etmek ve biyolojilerini daha iyi anlamak amacıyla, sonraki çalışmalar için birçok farklı alt uygulamada kullanılabilir.