Fizyolojik Akış Koşullarında Sirkülasyon Hücre Kemokin-yönettiği Ekstravazasyon Eğitim Bir Roman Üç boyutlu Akış Odası Cihazı

Aşağıdaki deneyin genel amacı, dolaşımdaki hücrelerin bir kemokin gradyanına doğru yönelimini nicel olarak ölçmektir. Fizyolojik makaslama gerilimi koşulları altında bu işlem; öncelikle kolajen kaplı mikrogözenekli insertler üzerinde bir endotel hücresi tek tabakası kültüre edilerek ve ardından bu insertlerin, kemokinler içeren ayrı bir statik bölmeyi örtecek şekilde bir akış odasına yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, damar sistemindeki fizyolojik koşulları taklit etmek amacıyla hücrelere makaslama gerilimi uygulanır.

İkinci bir adım olarak, lökositler, kök hücreler veya tümör hücreleri gibi ilgilenilen test hücrelerinin 3D sistem içerisinde dolaşıma girmesine izin verilir. Statik bölmedeki içerikler, dolaşımdaki hücreler ile endotel hücreleri arasındaki etkileşimlerin verimliliğini ve dolayısıyla test hücrelerinin endotel tabaka boyunca transmigrasyon hızını etkiler. Ardından, 3D sistem sökülür ve hücre infiltrasyonunu çeşitli modern yöntemler kullanarak kantitatif olarak ölçmek amacıyla alt statik bölmeden transmigre olmuş test hücreleri toplanır; elde edilen sonuçlar, dolaşımdaki test hücrelerinin fizyolojik akış koşulları altında endotel hücreleri ile etkileşime girme ve statik bölmedeki kemokin konsantrasyonuna bağlı olarak dolaşımdan çıkma yeteneğini göstermektedir.

Bu tekniğin, paralel lamina akış odalarının kullanımı ve statik transfer analizleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hem üst bölmedeki kayma gerilmesini hem de alt statik bölmedeki kemosinleri birleştirmesidir. Bu durum, araştırmacıların dolaşımdaki hücrelerin kemosin gradyanına ve fizyolojik akış koşullarına karşı eksternalizasyonunu nicel olarak ölçmelerine olanak tanır. Bu yöntem ayrıca, yerel mikroçevre hücreleri ile endotel hücreleri arasındaki etkileşimin dolaşımdaki hücrelerin ekstravazasyonu üzerindeki etkisini incelemek için de kullanılabilir.

Endotel hücrelerin altında, ayrı bir insert üzerinde ek bir hücre tabakasına yardımcı olarak, prosedür laboratuvarımdan bir teknisyen olan Valentina against rova tarafından gösterilecektir. Başlamak için, deney için gereken insert sayısını hesaplayın ve her bir insert'ü ayrı bir steril Petri kabına yerleştirin. Bireysel kurulumlara bağlı olarak, toplam doz 11 gray değerine ulaşana kadar onları gama ışınlaması ile sterilize edin.

Ardından stok kolajen Tip 1 çözeltisini, 4 °C'de saklanan 0,01 molar hidroklorik asit kullanarak mililitre başına 50 mikrogram olacak şekilde seyreltin ve her bir insert için final çözeltiden 154 mikrolitrelik alikotlar hazırlayın. Daha sonra, bir Eloqua'dan birkaç damlayı dairesel bir düzende insert yüzeyine yerleştirin.

Ardından, insert yüzeyinde tek bir büyük damla oluşturmak için alikotun geri kalanını ekleyin. Pipet ucunun hiçbir noktada inserte değmediğinden ve kollajenin insertin tüm yüzeyini kapladığından, ancak kenarlardan akıp gitmediğinden emin olun. Insert kaplandıktan sonra, Petri kabının kapağını kapatın ve kabı dikkatlice düz bir yüzeye yerleştirin.

İnkübasyonun ardından insertleri oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin, kolajen çözeltisini aspire edin ve membranı 160 µL PBS ile yıkayın. Ardından PBS'yi aspire edin. Kapağı kapatın ve kabı parafilm ile sarın.

İnsertler aynı gün kullanılacaksa, Petri kabını oda sıcaklığında kuru bir yere yerleştirin. Aksi takdirde, kabı dört santigrat dereceye yerleştirin ve inserti yedi gün içinde kullanın. Kültürlenmiş insan göbek kordonu ven endotel hücrelerini kullanımdan hemen önce hasat edin ve mililitrede 2,5 milyon hücre olacak şekilde istenen kültür ortamında yeniden süspande edin.

Hücreleri sayarken, tripan mavisi kullanarak hücre canlılığının %98'den fazla olduğundan emin olun, ardından her bir insert üzerine 160 µL hücre süspansiyonu ekleyin. Bunu, önce kolajen kaplı insert yüzeyine dairesel şekilde birkaç küçük damla yerleştirerek ve ardından hücre süspansiyonunun geri kalanını tek bir büyük damla oluşturacak şekilde dikkatlice ekleyerek yapın. İşlem tamamlandığında, kapakları kapatın ve kapları %5 CO2 içeren 37 °C'deki bir inkübatöre dikkatlice yerleştirerek, hücrelerin membrana tutunması için 30 dakika inkübe edin.

30 dakika sonra plakaları inkübatörden çıkarın ve her bir insert üzerine nazikçe beş mililitre ön ısıtmalı kültür medyumu ekleyin. Insert'in kabın tabanında kaldığından ve medyumla tamamen kaplandığından emin olmaya dikkat edin. Ardından kapakları kapatın ve kapları dikkatlice inkübatör kültürüne geri yerleştirin.

Hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Akış odasını kurmak için öncelikle üst ve alt plakaları birbirine vidalayın. Ardından, plakaları 0,8 mm et kalınlığına ve 1,42 mm iç çapa sahip PVC borular kullanarak gaz değişim ünitesine bağlayın.

Ardından, monte edilen cihazı temiz bir plastik torbaya yerleştirin ve toplam doz 11 gray değerine ulaşana kadar gama radyasyonu ile sterilize edin. Bir sonraki adım, bir inkübatör tepsisini çıkarmak, onu steril bir doku kültürü davlumbazına yerleştirmek ve %70 etanol ile sterilize etmektir. Daha sonra tepsiyi büyük, steril bir peçete ile örtün.

Ardından, cihazı plastik torbadan çıkarın ve steril inkübatör tepsisine yerleştirin. Daha sonra cihazı peristaltik pompaya bağlayın ve pompayı dakikada 0.2 milliliters hızda çalışacak şekilde programlayın. Giriş için kullanılacak steril 15 milliliter tüpün içine, istenilen kültür ortamından beş ila yedi milliliters pipetleyin.

Ardından, tüpün sterilitesini korumak için küçük steril peçeteler kullanarak metal iğneyi tüpten çekip giriş tüpünü çıkıştan ayırın; metal giriş iğnesini besiyeri bulunan 15 milliliter tüpün içine, çıkış tüpünü ise boş 15 milliliter tüpün içine yerleştirin. Sonrasında, akış saat yönünün tersine olacak şekilde pompayı çalıştırın. Negatif basıncın, besiyerini 15 milliliter giriş tüpünden tüpün içine çekmesine izin verin ve besiyeri, cihaza girmeden hemen önce tüpün sonuna ulaştığında pompayı durdurun.

Ardından, tüp plakalarını sökerek cihazı açın ve üst plakayı dikkatlice kaldırın; alt kuyucuklara 1500 ile 1550 µL arası besiyeri pipetleyin ve kuyucukların, alt plakanın 1 ila 2 mm üzerine kadar ulaşan bir hemisfer oluşturacak kadar yeterli besiyeri içerdiğinden emin olun. Sonra, petri kaplarında hazırlanan insertleri alt plakanın kuyucuklarına aktarın. Steril bir pens kullanarak insertlerin altında hava kabarcığı kalmadığından emin olun ve alt plakanın yüzeyinde görünen tüm besiyerini aspire edin.

Ardından üst plakayı tekrar alt plakanın üzerine yerleştirin ve bunları yeniden bağlayın. Vidaları kullanarak peristaltik pompayı hemen çalıştırın ve besiyerinin 3D cihaz boyunca akmasını sağlayın. Plakalar arasındaki boşlukta hava kabarcığı oluşumunu önlemek için cihazın çıkış ucunu kaldırın ve hazneyi bu konumda tutun.

Hazneyi gaz değişim ünitesine bağlayan boruyu, medium gaz değişim ünitesine ulaşana kadar doldurmaya devam edin. Ardından, gaz değişim ünitesine üç mililitre medium ekleyin. Pompayı çalıştırın ve hava kabarcıklarının üniteden çıkmasını sağlayın.

Besiyerinin, üniteden çıkan tüpleri doldurmasını sağlamak için üniteyi yükseltin ve besiyeri sona iki ila üç santimetre kala pompayı durdurun. Tam olarak doldurulduğunda, giriş iğnesini küçük steril peçeteler kullanarak çıkış tüpüne bağlayın. Ardından, besiyerinin saat yönünde gaz değişim ünitesine doğru akması için pompayı tersine çevirin ve kalan tüm hava kabarcıklarının giderildiğinden emin olun.

Pompa tekrar saat yönünün tersine akarken, gaz değişim ünitesine 100 µL test hücresi süspansiyonu ekleyin. Ardından respiratörün kapağını kapatın.

Tepsiyi inkübatöre geri yerleştirin ve test hücrelerinin cihaz içinde 37 °C'de sirküle olmasını sağlayın. İstenen süre dolduğunda, çalışan sistemi içeren tepsiyi inkübatörden çıkarıp çeker ocağa yerleştirin. Pompayı durdurun, giriş ve çıkış hatlarını ayırın ve uçlarını boş steril 15 mL tüplerin içine yerleştirin.

Ardından pompayı çalıştırın ve hücre süspansiyonunu sistemden toplayın. Hücre süspansiyonunu kullanıma kadar buz üzerinde bekletin. Sonrasında, vidaları çıkarıp üst plakayı kaldırarak hazneyi sökün.

Insertleri alt plakadan çıkarın ve boyama veya hücre toplama işlemi için petri kaplarına aktarın. Son olarak, alt kuyucuklardaki hücre süspansiyonunu alın ve 15 milliliter tüplere yerleştirin. Her kuyucuğu 1.5 milliliters besiyeri ile iki kez durulayın ve bunu ilgili tüpüne ekleyin.

Ardından tüpleri 200 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve hücreleri, beraberinde sunulan metin protokolünde listelenenler gibi özel deneysel hedeflere göre işleyin. İşte bu sistem kullanılarak gerçekleştirilebilecek birçok testten birine örnek: Düzenek, beş mikron gözenekli insertler üzerinde büyütülen kemik iliği kaynaklı endotel hücrelerin aynalanmasından oluşur; insertlerin altına 0,5 veya 50 nanograms per milliliter konsantrasyonlarında stromal hücre kaynaklı faktör bir veya SDF one eklenmiştir.

Kemik iliği hücrelerinin 3D sistemde dolaşmasına izin verildi. İnserden göç eden hücreler toplandı ve ardından Metilselüloz medyum içeren plaklarda kültüre edildi. Progenitör hücrelerin koloni oluşturmasını sağlayan hematopoetik büyüme faktörlerinin varlığında, her kuyuktaki progenitör sayısını belirlemek ve sdf'ye doğru göç etme yeteneklerini ortaya çıkarmak için 14 gün sonra koloni sayısı sayıldı.

Biri fizyolojik akış koşulları altında. Statik bölmedeki alt insert üzerinde büyütülen stromal fibroblastlerin eklenmesiyle, sdf eklemesinde (mililitre başına 50 nanogram), sadece SDF tek başına kullanıldığında olduğundan daha fazla hematopoetik hücre dolaşımdan bölmeye göç etmiştir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, tıp ve biyolojik bilimlerin farklı alanlarındaki araştırmacıların dokuya özgü vasküler yatakları in vitro olarak modellemelerine ve dolaşımdaki hücrelerin normal dokulara karşı hastalıklı dokulara göçünü yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmalarına yol açmıştır.