Bugün size ekmek mayası olarak da bilinen Saccharomyces cerevisiae'den nükleik asitleri nasıl saflaştıracağınızı göstereceğiz. Nükleik asitler DNA veya RNA içerebilir. Bu video, bu moleküllerin faz ayırma ve kromatografi ile maya hücrelerinden izolasyonunu tartışacaktır.
Nükleik asitleri mayadan saflaştırmak için birçok farklı yöntem mevcut olsa da, çoğu aynı başlangıç adımlarını paylaşır.
Maya hücreleri ilk olarak bir plakadan tek bir koloni seçilerek ve YPD ortamına aşılanarak çoğaltılır. Karışım, çalkalanan veya dönen bir inkübatörde gece boyunca 30 ° C'de büyütülmelidir.
Maya hücreleri, verimi optimize etmek için büyümenin orta log aşamasında hasat edilmelidir. Büyümenin log fazındaki maya, 600 nm dalga boyunda ölçüldüğünde genellikle 0.5-1'lik bir optik yoğunluğa veya "OD" değerine sahip olacaktır. Hücreler uygun optik yoğunluğa ulaştığında, bir pelet oluşturmak için santrifüjlenir ve hücrelerin parçalanması için lizis tamponunda yeniden süspanse edilir.
Nükleik asitleri mayadan izole etmenin en zorlu yönlerinden biri, sert hücre duvarlarını bozmaktır. Hücre duvarları, enzimatik ve fiziksel tekniklerin bir kombinasyonu ile yok edilebilir. Hücre duvarının tahrip olması, mayanın standart hücre lizis teknikleri ile parçalanabilen sferoplast adı verilen küresel hücreler oluşturmasına neden olur.
Sferoplastlar tipik olarak hücresel zarları parçalayan sodyum dodesil sülfat veya SDS gibi kimyasal deterjanlarla parçalanır. Hücreler ayrıca homojenize edilebilir. Örneğin, hücrelere cam boncuklar eklenebilir ve hücreler girdaplama ile homojenize edilebilir. Veya hücre duvarları, lizis sürecine yardımcı olmak için bir sonikatör kullanılarak ultra yüksek frekanslı sesle bozulabilir.
Belirtildiği gibi, mayada yapılan tüm nükleik asit saflaştırma prosedürleri, maya hücrelerinin büyütülmesi, hasat edilmesi ve parçalanması için benzer adımlara sahip olacaktır, ancak hücreler parçalandıktan sonra, nükleik asitleri izole etmek için birkaç farklı yöntem kullanılabilir. Nükleik asitler, kolon bağlama veya faz ayırma yoluyla saflaştırılabilir.
DNA ve RNA, silika sütun bağlanması kullanılarak en iyi şekilde izole edilir. Nükleik asitler, anyon değişimi yoluyla kolona bağlanır ve diğer hücresel bileşenlerden ayrıldıktan sonra kolondan ayrılabilir.
Faz ayırma, çözünürlüklerine bağlı olarak belirli proteinleri veya nükleik asitleri saflaştırmak veya konsantre etmek için farklı özelliklere sahip çözeltilerin kullanılabileceği ilkesini kullanır. Kloroform ilavesi, hücre bileşenlerinin bir bulamacını sulu ve organik olmak üzere iki farklı faza ayırır. Organik faz proteinler içerirken, akeos fazı nükleik asitler içerir. DNA daha sonra etanol ilavesiyle organik fazdan çökeltilebilir.
Nükleik asitler, bir kolon bağlama protokolü kullanılarak mayadan izole edilebilir. İlk olarak, hücreler santrifüjleme ile büyütülür ve hasat edilir.
Hücre peleti enzim içeren tamponda yeniden süspanse edilirken, girdaplanır ve hücre duvarları sindirilene kadar inkübe edilirken süpernatan çıkarılır ve atılır. Hücre duvarı sindirimi ve sferoplast oluşumu, enzim tedavisini optimize ederken mikroskopi ile doğrulanabilir. Hücre duvarı sindiriminden sonra, hücrelere lizis tamponu eklenir ve karışım girdaplanır.
Parçalanmış hücreler, enkaz karışımını berraklaştırmak için santrifüjlenmeli, süpernatantta DNA ve küçük partiküller ve çözünür proteinler bırakılmalıdır. Süpernatant bir silika kolonuna yüklenir ve daha sonra santrifüjlemeyi takiben nükleik asitlerin bağlanmasına izin verilir, bu da çözünür safsızlıkların bir kısmını giderir.
Yıkama adımları, bağlı nükleik asitlerden kalan safsızlıkları gidermek için etanol veya yüksek tuz tamponu ile gerçekleştirilir. Son olarak, DNA veya RNA su veya tuz oranı düşük bir tampon ile ayrıştırılır. DNAse ve RNAse enzimlerinden arınmış bir tampon veya su kullandığınızdan emin olun.
Mayadan izole edilen nükleik asitler, özel deneysel hedefinize bağlı olarak çeşitli kullanımlara sahiptir. Mayadan izole edilen DNA, PCR, southern blotting veya restriksiyon enzimi sindirimi dahil olmak üzere bir dizi farklı moleküler biyoloji tekniği için kullanılabilir.
Gen ifadesindeki değişiklikler, bunun gibi gen dizilerini kullanan mikrodizi analizi olarak bilinen bir işlemle tanımlanabilir.
Biri hidrojen peroksite maruz kalmış ve diğeri kontrol olmak üzere iki maya kültürümüz varsa, mRNA bu kültürlerden izole edilebilir ve mikrodizi slaytları üzerinde hibritleştirilebilir. Slaytlar analiz edilir ve oksidatif stres ile modifiye edilen genler tanımlanabilir.
Bu videoda araştırmacılar, gen fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılan genom çapında maya mutantlarından oluşan bir kütüphane hazırlamak için robotik bir sistem kullanıyorlar. Genetik barkod adı verilen özel olarak tasarlanmış dizilerin genlere yerleştirilmesi nedeniyle, mutant suşlardan genomik DNA aynı anda 4.000 ila 6.000 kişiden ekstrakte edilebilir ve mikrodizi analizine veya dizilemeye tabi tutulabilir. Barkod dizilerinin nispi bolluğuna bağlı olarak, her mutantın uygunluğu birden fazla deneysel koşul altında belirlenebilir.
JoVE'nin mayadan nükleik asitleri izole etme hakkındaki videosunu az önce izlediniz. Artık nükleik asitlerin saflaştırılmasının, maya hücrelerinin lizis için nasıl hazırlanacağı ve farklı ekstraksiyon ve izolasyon prosedürlerinin nasıl gerçekleştirileceği gibi temel yönlerini anlamalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Mayayı model sistem olarak kullanmanın birçok avantajından biri, nükleik asitler (DNA ve RNA) dahil olmak üzere büyük miktarlarda biyomakromoleküllerin kültürlenmiş hücrelerden saflaştırılabilmesidir.
Bu video, nükleik asit ekstraksiyonunu gerçekleştirmek için gereken adımları ele alacaktır. Tüm biyomakromoleküllerin izolasyonunda ortak olan ilk adımlar olan maya hücrelerinin büyümesini, hasadını ve parçalanmasını kısaca özetleyerek başlayacağız. Daha sonra, nükleik asitlerin ayrılması için iki benzersiz saflaştırma yöntemini tartışacağız: sütun bağlama ve faz ayırma. Ek olarak, PCR ve southern blotting gibi moleküler biyoloji teknikleri için nükleik asitlerin hazırlanması, çevresel uyaranlara yanıt olarak gen ekspresyonunun nicelleştirilmesi ve büyük miktarlarda rekombinant proteinlerin saflaştırılması dahil olmak üzere bu yöntemlerin laboratuvarda uygulandığı çeşitli yolları göstereceğiz.
Bugün size ekmek mayası olarak da bilinen Saccharomyces cerevisiae'den nükleik asitleri nasıl saflaştıracağınızı göstereceğiz. Nükleik asitler DNA veya RNA içerebilir. Bu video, bu moleküllerin faz ayırma ve kromatografi ile maya hücrelerinden izolasyonunu tartışacaktır.
Nükleik asitleri mayadan saflaştırmak için birçok farklı yöntem mevcut olsa da, çoğu aynı başlangıç adımlarını paylaşır.
Maya hücreleri ilk olarak bir plakadan tek bir koloni seçilerek ve YPD ortamına aşılanarak çoğaltılır. Karışım, çalkalanan veya dönen bir inkübatörde gece boyunca 30 ° C'de büyütülmelidir.
Maya hücreleri, verimi optimize etmek için büyümenin orta log aşamasında hasat edilmelidir. Büyümenin log fazındaki maya, 600 nm dalga boyunda ölçüldüğünde genellikle 0.5-1'lik bir optik yoğunluğa veya "OD" değerine sahip olacaktır. Hücreler uygun optik yoğunluğa ulaştığında, bir pelet oluşturmak için santrifüjlenir ve hücrelerin parçalanması için lizis tamponunda yeniden süspanse edilir.
Nükleik asitleri mayadan izole etmenin en zorlu yönlerinden biri, sert hücre duvarlarını bozmaktır. Hücre duvarları, enzimatik ve fiziksel tekniklerin bir kombinasyonu ile yok edilebilir. Hücre duvarının tahrip olması, mayanın standart hücre lizis teknikleri ile parçalanabilen sferoplast adı verilen küresel hücreler oluşturmasına neden olur.
Sferoplastlar tipik olarak hücresel zarları parçalayan sodyum dodesil sülfat veya SDS gibi kimyasal deterjanlarla parçalanır. Hücreler ayrıca homojenize edilebilir. Örneğin, hücrelere cam boncuklar eklenebilir ve hücreler girdaplama ile homojenize edilebilir. Veya hücre duvarları, lizis sürecine yardımcı olmak için bir sonikatör kullanılarak ultra yüksek frekanslı sesle bozulabilir.
Belirtildiği gibi, mayada yapılan tüm nükleik asit saflaştırma prosedürleri, maya hücrelerinin büyütülmesi, hasat edilmesi ve parçalanması için benzer adımlara sahip olacaktır, ancak hücreler parçalandıktan sonra, nükleik asitleri izole etmek için birkaç farklı yöntem kullanılabilir. Nükleik asitler, kolon bağlama veya faz ayırma yoluyla saflaştırılabilir.
DNA ve RNA, silika sütun bağlanması kullanılarak en iyi şekilde izole edilir. Nükleik asitler, anyon değişimi yoluyla kolona bağlanır ve diğer hücresel bileşenlerden ayrıldıktan sonra kolondan ayrılabilir.
Faz ayırma, çözünürlüklerine bağlı olarak belirli proteinleri veya nükleik asitleri saflaştırmak veya konsantre etmek için farklı özelliklere sahip çözeltilerin kullanılabileceği ilkesini kullanır. Kloroform ilavesi, hücre bileşenlerinin bir bulamacını sulu ve organik olmak üzere iki farklı faza ayırır. Organik faz proteinler içerirken, akeos fazı nükleik asitler içerir. DNA daha sonra etanol ilavesiyle organik fazdan çökeltilebilir.
Nükleik asitler, bir kolon bağlama protokolü kullanılarak mayadan izole edilebilir. İlk olarak, hücreler santrifüjleme ile büyütülür ve hasat edilir.
Hücre peleti enzim içeren tamponda yeniden süspanse edilirken, girdaplanır ve hücre duvarları sindirilene kadar inkübe edilirken süpernatan çıkarılır ve atılır. Hücre duvarı sindirimi ve sferoplast oluşumu, enzim tedavisini optimize ederken mikroskopi ile doğrulanabilir. Hücre duvarı sindiriminden sonra, hücrelere lizis tamponu eklenir ve karışım girdaplanır.
Parçalanmış hücreler, enkaz karışımını berraklaştırmak için santrifüjlenmeli, süpernatantta DNA ve küçük partiküller ve çözünür proteinler bırakılmalıdır. Süpernatant bir silika kolonuna yüklenir ve daha sonra santrifüjlemeyi takiben nükleik asitlerin bağlanmasına izin verilir, bu da çözünür safsızlıkların bir kısmını giderir.
Yıkama adımları, bağlı nükleik asitlerden kalan safsızlıkları gidermek için etanol veya yüksek tuz tamponu ile gerçekleştirilir. Son olarak, DNA veya RNA su veya tuz oranı düşük bir tampon ile ayrıştırılır. DNAse ve RNAse enzimlerinden arınmış bir tampon veya su kullandığınızdan emin olun.
Mayadan izole edilen nükleik asitler, özel deneysel hedefinize bağlı olarak çeşitli kullanımlara sahiptir. Mayadan izole edilen DNA, PCR, southern blotting veya restriksiyon enzimi sindirimi dahil olmak üzere bir dizi farklı moleküler biyoloji tekniği için kullanılabilir.
Gen ifadesindeki değişiklikler, bunun gibi gen dizilerini kullanan mikrodizi analizi olarak bilinen bir işlemle tanımlanabilir.
Biri hidrojen peroksite maruz kalmış ve diğeri kontrol olmak üzere iki maya kültürümüz varsa, mRNA bu kültürlerden izole edilebilir ve mikrodizi slaytları üzerinde hibritleştirilebilir. Slaytlar analiz edilir ve oksidatif stres ile modifiye edilen genler tanımlanabilir.
Bu videoda araştırmacılar, gen fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılan genom çapında maya mutantlarından oluşan bir kütüphane hazırlamak için robotik bir sistem kullanıyorlar. Genetik barkod adı verilen özel olarak tasarlanmış dizilerin genlere yerleştirilmesi nedeniyle, mutant suşlardan genomik DNA aynı anda 4.000 ila 6.000 kişiden ekstrakte edilebilir ve mikrodizi analizine veya dizilemeye tabi tutulabilir. Barkod dizilerinin nispi bolluğuna bağlı olarak, her mutantın uygunluğu birden fazla deneysel koşul altında belirlenebilir.
JoVE'nin mayadan nükleik asitleri izole etme hakkındaki videosunu az önce izlediniz. Artık nükleik asitlerin saflaştırılmasının, maya hücrelerinin lizis için nasıl hazırlanacağı ve farklı ekstraksiyon ve izolasyon prosedürlerinin nasıl gerçekleştirileceği gibi temel yönlerini anlamalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Bugün size ekmek mayası olarak da bilinen Saccharomyces cerevisiae'den nükleik asitleri nasıl saflaştıracağınızı göstereceğiz. Nükleik asitler DNA veya RNA içerebilir. Bu video, bu moleküllerin faz ayırma ve kromatografi ile maya hücrelerinden izolasyonunu tartışacaktır.
Nükleik asitleri mayadan saflaştırmak için birçok farklı yöntem mevcut olsa da, çoğu aynı başlangıç adımlarını paylaşır.
Maya hücreleri ilk olarak bir plakadan tek bir koloni seçilerek ve YPD ortamına aşılanarak çoğaltılır. Karışım, çalkalanan veya dönen bir inkübatörde gece boyunca 30 ° C'de büyütülmelidir.
Maya hücreleri, verimi optimize etmek için büyümenin orta log aşamasında hasat edilmelidir. Büyümenin log fazındaki maya, 600 nm dalga boyunda ölçüldüğünde genellikle 0.5-1'lik bir optik yoğunluğa veya "OD" değerine sahip olacaktır. Hücreler uygun optik yoğunluğa ulaştığında, bir pelet oluşturmak için santrifüjlenir ve hücrelerin parçalanması için lizis tamponunda yeniden süspanse edilir.
Nükleik asitleri mayadan izole etmenin en zorlu yönlerinden biri, sert hücre duvarlarını bozmaktır. Hücre duvarları, enzimatik ve fiziksel tekniklerin bir kombinasyonu ile yok edilebilir. Hücre duvarının tahrip olması, mayanın standart hücre lizis teknikleri ile parçalanabilen sferoplast adı verilen küresel hücreler oluşturmasına neden olur.
Sferoplastlar tipik olarak hücresel zarları parçalayan sodyum dodesil sülfat veya SDS gibi kimyasal deterjanlarla parçalanır. Hücreler ayrıca homojenize edilebilir. Örneğin, hücrelere cam boncuklar eklenebilir ve hücreler girdaplama ile homojenize edilebilir. Veya hücre duvarları, lizis sürecine yardımcı olmak için bir sonikatör kullanılarak ultra yüksek frekanslı sesle bozulabilir.
Belirtildiği gibi, mayada yapılan tüm nükleik asit saflaştırma prosedürleri, maya hücrelerinin büyütülmesi, hasat edilmesi ve parçalanması için benzer adımlara sahip olacaktır, ancak hücreler parçalandıktan sonra, nükleik asitleri izole etmek için birkaç farklı yöntem kullanılabilir. Nükleik asitler, kolon bağlama veya faz ayırma yoluyla saflaştırılabilir.
DNA ve RNA, silika sütun bağlanması kullanılarak en iyi şekilde izole edilir. Nükleik asitler, anyon değişimi yoluyla kolona bağlanır ve diğer hücresel bileşenlerden ayrıldıktan sonra kolondan ayrılabilir.
Faz ayırma, çözünürlüklerine bağlı olarak belirli proteinleri veya nükleik asitleri saflaştırmak veya konsantre etmek için farklı özelliklere sahip çözeltilerin kullanılabileceği ilkesini kullanır. Kloroform ilavesi, hücre bileşenlerinin bir bulamacını sulu ve organik olmak üzere iki farklı faza ayırır. Organik faz proteinler içerirken, akeos fazı nükleik asitler içerir. DNA daha sonra etanol ilavesiyle organik fazdan çökeltilebilir.
Nükleik asitler, bir kolon bağlama protokolü kullanılarak mayadan izole edilebilir. İlk olarak, hücreler santrifüjleme ile büyütülür ve hasat edilir.
Hücre peleti enzim içeren tamponda yeniden süspanse edilirken, girdaplanır ve hücre duvarları sindirilene kadar inkübe edilirken süpernatan çıkarılır ve atılır. Hücre duvarı sindirimi ve sferoplast oluşumu, enzim tedavisini optimize ederken mikroskopi ile doğrulanabilir. Hücre duvarı sindiriminden sonra, hücrelere lizis tamponu eklenir ve karışım girdaplanır.
Parçalanmış hücreler, enkaz karışımını berraklaştırmak için santrifüjlenmeli, süpernatantta DNA ve küçük partiküller ve çözünür proteinler bırakılmalıdır. Süpernatant bir silika kolonuna yüklenir ve daha sonra santrifüjlemeyi takiben nükleik asitlerin bağlanmasına izin verilir, bu da çözünür safsızlıkların bir kısmını giderir.
Yıkama adımları, bağlı nükleik asitlerden kalan safsızlıkları gidermek için etanol veya yüksek tuz tamponu ile gerçekleştirilir. Son olarak, DNA veya RNA su veya tuz oranı düşük bir tampon ile ayrıştırılır. DNAse ve RNAse enzimlerinden arınmış bir tampon veya su kullandığınızdan emin olun.
Mayadan izole edilen nükleik asitler, özel deneysel hedefinize bağlı olarak çeşitli kullanımlara sahiptir. Mayadan izole edilen DNA, PCR, southern blotting veya restriksiyon enzimi sindirimi dahil olmak üzere bir dizi farklı moleküler biyoloji tekniği için kullanılabilir.
Gen ifadesindeki değişiklikler, bunun gibi gen dizilerini kullanan mikrodizi analizi olarak bilinen bir işlemle tanımlanabilir.
Biri hidrojen peroksite maruz kalmış ve diğeri kontrol olmak üzere iki maya kültürümüz varsa, mRNA bu kültürlerden izole edilebilir ve mikrodizi slaytları üzerinde hibritleştirilebilir. Slaytlar analiz edilir ve oksidatif stres ile modifiye edilen genler tanımlanabilir.
Bu videoda araştırmacılar, gen fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılan genom çapında maya mutantlarından oluşan bir kütüphane hazırlamak için robotik bir sistem kullanıyorlar. Genetik barkod adı verilen özel olarak tasarlanmış dizilerin genlere yerleştirilmesi nedeniyle, mutant suşlardan genomik DNA aynı anda 4.000 ila 6.000 kişiden ekstrakte edilebilir ve mikrodizi analizine veya dizilemeye tabi tutulabilir. Barkod dizilerinin nispi bolluğuna bağlı olarak, her mutantın uygunluğu birden fazla deneysel koşul altında belirlenebilir.
JoVE'nin mayadan nükleik asitleri izole etme hakkındaki videosunu az önce izlediniz. Artık nükleik asitlerin saflaştırılmasının, maya hücrelerinin lizis için nasıl hazırlanacağı ve farklı ekstraksiyon ve izolasyon prosedürlerinin nasıl gerçekleştirileceği gibi temel yönlerini anlamalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Chapters in this video
0:00
Overview
0:35
Principles Behind Separating Nucleic Acids from Yeast
3:33
Procedure for Isolating Nucleic Acids Using Column Binding
4:55
Applications
6:22
Summary
Videos from this collection: