Potansiyel Toprak Ekstrasellüler Enzim Aktivitelerinin Yüksek verim Florimetrik Ölçme

Bu prosedürün genel amacı, topraklardaki hücre dışı enzimlerin hedef substratları parçalama potansiyel maksimum hızlarını nicelleştirmektir. Bu işlem, önce saha nemli toprağın ve tampon çözeltinin bir blenderda birleştirilmesi ve ardından karıştırılan örneklerin derin kuyucuklu örnek plakasına ve derin kuyucuklu standart plakalarına pipetlenmesiyle gerçekleştirilir. Derin kuyucuklu plakalar inkübe edilir ve santrifüj edilir; ardından derin kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğundan 250 µL, siyah düz dipli plakaların ilgili kuyucuklarına aktarılır.

96 kuyucuklu plakalar. Ardından üç plaka florimetre ile okunur ve elde edilen veriler analiz edilir. Sonuç olarak, potansiyel toprak hücre dışı enzim aktiviteleri, floresan boyanın substrattan bir enzim katalizli reaksiyon aracılığıyla salınma hızıyla belirlenir; burada daha yüksek floresan, daha fazla substrat yıkımı anlamına gelir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, derin 96 kuyucuklu mikroplaka formatından yararlanarak çok sayıda örnekte enzim aktivitelerini ölçebilme yeteneğidir. Diğer protokolleri derin kuyucuklu plaka formatına uyarlayarak, standart mikroplakalara kıyasla örnek hacmini artırma fırsatını gördüğümüzde bu yöntem için ilk fikri edindik. Bu tekniğin doğurduğu sonuçlar, mikrobiyal fizyolojiyi ekosistem ölçeğindeki süreçlerle daha iyi ilişkilendirmemize olanak tanımaktadır.

Bu teknik için görsel gösterim kritik öneme sahiptir çünkü yazılı bir prosedürde takip edilmesi kolay olmayan birçok nüans ve numune işleme adımı bulunmaktadır. Bu yöntem, toprak mikroplarının çevrelerindeki değişikliklere nasıl tepki verdiği ve fizyolojik yanıtlarının ayrışma ve besin döngüsü gibi kritik ekosistem süreçlerini nasıl etkilediği gibi, mikrobiyal ekoloji ve toprak biyojeokimyası alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, toprak organik maddesinin ayrışması, besin döngüsü ve karasal ekosistemler hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, deniz ve tatlı su sistemlerine de uygulanabilir.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler pipetleme becerileri ve bu protokolle ilgili zaman hassasiyeti sorunları konusunda zorluk yaşayacaklardır. Ayrıca, bu prosedürde üretilen büyük miktardaki veri, ilk kez kullananlar için bazen bunaltıcı olabilir. Deney kurulumuna başlamak için, üç derin kuyucuklu plakayı sırasıyla numune, dört metil ve beone için MUB standart ve yedi amino dört metil kumarin için MUC standart olarak etiketleyin.

Her bir standardı ve substratı, sıralar halinde düzenlenmiş, önceden etiketlenmiş ayrı temiz rezervuarlara dökün. Ardından, metin protokolünde belirtildiği şekilde, uygun MUB standardını MUB standart plakasının ilgili kuyucuklarına pipetleyin. Toprak süspansiyonlarını hazırlamak için bu işlemi MUC standartları için MUC standart plakasının ilgili kuyucuklarında tekrarlayın.

Her bir toprak örneği için, blendera eklemeden önce 2,75 gram saha nemli toprağı tartın. 91 mililitre 50 milimolar tampon ekleyip yüksek hızda bir dakika boyunca karıştırın. Blender içeriğini, içinde bir manyetik karıştırıcı çubuk bulunan ve en az sekiz kanallı bir pipet genişliğinde olan temiz bir cam kaba boşaltın.

Toprak bulamacı, kaba dökülmeden önce yaklaşık bir milimetrelik bir süzgeçten geçirilebilir. Kabı bir karıştırma plakasına yerleştirin ve toprak bulamacını karıştırın. Ardından, numune plakasının ilk kolonuna 800 µL toprak bulamacı pipetleyin.

Aynı işlemi MUB standart ve MUC standart plakalarının ilk sütunu için de yapın. Toprak örnekleri arasında blenderı, manyetik karıştırıcıyı ve manyetik balığı deiyonize su veya tamponla durulayın. Bu işlemi her toprak örneği için tekrarlayın.

Her bir sonraki örnekle birlikte bir sonraki sütuna geçiniz. Ardından, uygun substratı örnek plakasının ilgili kuyucuklarına pipetleyiniz. Metin protokolünde belirtildiği üzere, test edilecek her bir inkübasyon sıcaklığı için bir örnek plakası hazırlayınız.

Derin kuyucuklu plakaları plaka matları ile mühürleyin. Çözelti tamamen karışana kadar mühürlenmiş her plakayı elinizle ters çevirin. Plakaları, metin protokolünde belirtilen gerekli inkübasyon süresi boyunca uygun inkübatöre yerleştirin; başlangıç zamanını sıfırıncı zaman olarak ve her inkübasyon döneminin sonunda uygun inkübasyon sürelerini kaydedin.

Kapatılmış plakaları yaklaşık 2,900 G'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, inkübe edilmiş derin kuyulu plakaların her bir kuyusundan 250 µL'yi, siyah düz tabanlı 96 kuyulu plakaların karşılık gelen kuyularına aktarın. İnkübe edilen her bir derin kuyulu plaka için bir adet siyah plaka kullanılacaktır.

Numunelerin, inkübe edilen derin kuyucuklu plakalardan, kullanılan florometrik plaka okuyucunun üretici talimatlarına uygun olarak siyah düz tabanlı 96 kuyucuklu plakalardaki karşılık gelen kuyucuklara aktarılması önemlidir. Eksitasyon dalga boyunu 365 nanometreye ve emisyon dalga boyunu 450 nanometreye ayarlayın.

Standart plakalardan birini yerleştirin, florimetreyi otomatik kazanç moduna getirin ve plakayı okutun. Ardından kazancı manuel moda getirin ve değeri optimalden, en yakın beşe yuvarlanmış bir sonraki en düşük sayıya düşürün. Her bir standart plaka için, ölçümü her plaka başına iki kez tekrarlayın.

Ardından, örnek plakasını yerleştirin. Kazancı otomatik olarak ayarlayın ve örnek plakasını çalıştırın. Her bir standart plaka için en yüksek kazancı eşlemek amacıyla örnek plakasını manuel olarak yeniden çalıştırın.

MUB ve MUC standartları için standart eğri floresans verilerini bir hesap çizelgesine girerek veri analizine başlayın. Her örnek için mikromolar konsantrasyonları mikromollere dönüştürün. Standart eğri floresans verilerini kullanarak MUB ve MUC standart konsantrasyonları için eğimi, y kesişimini ve R kare değerlerini hesaplayın.

Kabul edilebilir r kare değerleri her bir örnek için 0,98'in üzerinde olmalıdır. Standart eğriler, floresans okumalarının bağımlı değişken ve standart konsantrasyonun bağımsız değişken olarak işaretlendiği bir saçılım grafiği ile görselleştirilebilir. Örnek artı substrat ham floresans verilerini yeni bir hesap tablosuna girin.

Ayrıca her bir örnek için inkübasyon süresini ve toprak kuru ağırlığını ekleyin, standart eğri kesişim değerlerini karşılık gelen örnek floresan değerlerinden çıkarın ve ardından karşılık gelen standart eğrinin eğimine bölün. Standart hat denklemini kullanarak, örnek mikromol değerini toprak süspansiyonunda kullanılan tampon hacmi olan 91 mililitre ile çarpın. Elde edilen değeri, örneğe özgü inkübasyon süresine ve kuru toprak kütlesine bölün.

Son olarak, istenen birimleri elde etmek için elde edilen değeri 1000 ile çarpın. Sonuçlar, ortam iklim koşullarına maruz kalan topraklar ile yüksek karbondioksit ve ısıtma işlemlerine maruz bırakılan toprakları karşılaştıran deneysel bir iklim çalışmasından gösterilmektedir; burada gösterilenler, kontrol parsellerinde ve işlem parsellerindeki çayır ısıtma ve yüksek karbondioksit zenginleştirme sahasındaki potansiyel hücre dışı enzim aktiviteleri veya EEA'lardır. Bu örnekte, 0 ila 5 cm toprak derinliklerindeki potansiyel karbon, azot ve fosfor enzim kazanım aktivite analizleri, deneysel işlemlere göre farklılık göstermemiştir.

Bununla birlikte, 5 ila 15 cm toprak derinliklerinde, birkaç potansiyel EEA önemli ölçüde farklılık göstermiştir. Örneğin, karbon degrade eden enzimler beta 1,4 glukosidaz ve beta D selobiyolidaz, ortam iklim koşulları parselleriyle karşılaştırıldığında, yüksek karbondioksit ve ısıtma işlemi uygulanan parsellerde daha düşük çıkmıştır; azot ve fosfor mineralize eden enzimler de 5 ila 15 cm toprak derinliklerinde, ortam iklim koşullarıyla karşılaştırıldığında işlem uygulanan parsellerde daha düşük bulunmuştur.

Tüm karbon, azot veya fosfor döngüsü potansiyel EEA'larının toplamının hesaplanması ve grafiğe dökülmesi, potansiyel toprak karbon, azot ve/veya fosfor döngüleriyle ilgili daha geniş örüntüleri gözlemlemek için yararlı bir yaklaşım olabilir. Bu örnekte, potansiyel karbon döngüsü aktivitelerini temsil etmek üzere beta one four glucco, beta D cello, bio hydrolase, beta xlo ve alpha one four glucco potansiyel EEA'larının toplamı hesaplanmıştır. Potansiyel azot döngüsü aktivitelerini temsil etmek üzere beta one four N acetyl glucose amid dase ve L leucine amino peptidase toplamı hesaplanmıştır.

Potansiyel fosfor döngüsü aktivitelerini temsil etmek için fosfataz kullanılmıştır. Toplam karbon, azot ve fosfor döngüsü için potansiyel EEA değerleri, 5 ila 15 santimetre toprak derinliklerinde, yüksek karbondioksit ve ısıtma uygulaması yapılan parsellerde, ortam iklim koşullarındaki parsellere kıyasla daha düşük eğilim göstermiştir. Ancak bu eğilim yalnızca toplam azot ve fosfor döngüsü aktiviteleri için anlamlıydı ve toprak EEA değerleri uygulama parselleri arasında anlamlı bir farklılık göstermemiştir.

Sıfır ila beş santimetre toprak derinliğinde. Sonuçlar, toprak derinliğine yanıt olarak işlem parselleri arasında enzim aktivitesinde ve fonksiyonel gruplarda karşıt eğilimler olduğunu göstermektedir; potansiyel EEA oranları, mikrobiyal besin ihtiyaçlarını değerlendirmenin bir yoludur. Burada; toprak enzimleri, topografik geometri, karbon/azot, karbon/fosfor veya azot/fosfor aktiviteleri, sıfır ila beş santimetre toprak derinliğindeki işlem parselleri arasında önemli ölçüde farklılık göstermektedir.

Bununla birlikte, potansiyel enzim karbon/fosfor ve azot/fosfor oranları, artırılmış karbondioksit ve ısıtma işlemi uygulanan parsellerde daha yüksekti. Beş ila 15 santimetre toprak derinliklerindeki ortam iklim koşullarıyla karşılaştırıldığında, sıcaklık toprak EEAs'larını güçlü bir şekilde etkileyebilir. Ancak tipik laboratuvar analizlerinde toprak enzimleri, in C two sıcaklık koşullarına karşılık gelmeyebilen tek bir sıcaklıkta ölçülmektedir.

Aran grafikleri, aktivasyon enerjisini görselleştirmek için kullanılır ve x ekseninde kelvin derecesine dönüştürülmüş ters sıcaklığın bir fonksiyonu olarak enzim aktivitesinin logaritması kullanılarak çizilir. Aktivasyon enerjisi genellikle bir kimyasal reaksiyonu katalize etmek için gereken minimum enerji olarak tanımlanır ve burada enzim katalizli reaksiyonların sıcaklık hassasiyeti için bir gösterge olarak kullanılır. Daha yüksek aktivasyon enerjisi, enzimin sıcaklığa karşı daha hassas olduğunu gösterir.

Benzer şekilde, aktivasyon enerjileri doğrudan Q 10 sıcaklık katsayısı değerlerine karşılık gelir. Karbon, azot ve fosfor EEA'ları için potansiyel enzim kinetikleri, her iki uygulama parselinde ve iki farklı toprak derinliğinde değerlendirilmiş olup; bulgular, EEA'ların sıcaklık duyarlılığının her iki toprak derinliğindeki uygulama parselleri arasında anlamlı bir farklılık göstermediğini ortaya koymuştur. Yönteme hakim olunduğunda, 96 kuyucuklu mikrotitre plakalara 30 dakika veya daha kısa sürede 12 örnek inoküle edilebilir.

Ayrıca, belirlenen inkübasyon sürelerinden sonra, genellikle yarım saat içinde plakları tekrar santrifüj edebilir, transfer edebilir ve urometre üzerinde okuyabilirsiniz. Bu prosedürü uygularken pipetleme işleminin tutarlı yapılması önemlidir. Pipetlemedeki herhangi bir hava kabarcığı, prosedürün ardından sonuçlarınızı olumsuz etkileyecektir.

Toprak gelişimi sonrası toprak fonksiyonunda toprak mikrobiyal topluluk kompozisyonunun rolüne ilişkin ek soruları yanıtlamak için DNA ekstraksiyonu ve sekanslama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, mikrobiyal ekoloji alanındaki araştırmacıların karasal ekosistemlerdeki besin döngüsünü ve biyogeokimyasal süreçleri keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, potansiyel enzim aktivitelerinin nasıl nicelendirileceği konusunda oldukça iyi bir fikre sahip olmalısınız.

Ayrıca, verileri farklı ekosistemlerdeki iklim ve farklı toprak türleri gibi faktörlere karşı potansiyel mikrobiyal yanıtları yansıtacak şekilde yorumlayabilmelisiniz. Florofor kısmının ışık hassasiyeti nedeniyle, floresan materyallerle çalışırken ışığa maruz kalmayı en aza indirmek için her zaman önlem alınması gerektiğini unutmayın.