Fototermal Işın Sapmasına tarafından Çözülmüş Proteinler Submillisecond Konformasyonel değişiklikler
18 Şubat 2014
Burada mikrosaniye ve milisaniyelik dinamikleri ve nöronal kalsiyum sensör, aşağı akış düzenleyici öğe Antagonist modülatörüne kalsiyum bağlanma kapasitesi ile bağlandığı yapısal değişikliklerin enerjileri izlemek için bir kafesli kalsiyum bileşiği, DM-nitrophen ile kombinasyon halinde fototermal ışın saptırma tekniğin bir uygulama rapor .
Aşağıdaki deneyin genel amacı, milisaniyenin altındaki zaman ölçeğinde kalsiyum transdüserlerine ligand bağlanması ile ilişkili doğrulayıcı değişiklikleri karakterize etmektir. APO proteini ile kalsiyuma bağlı protein arasındaki onaylayıcı geçiş, serbest kalsiyumun foto salınımına yol açan kafesli bir kalsiyum bileşiği kalsiyum DM nitronun foto bölünmesi ile tetiklenir. Yansıma indeksindeki ilgili değişiklik, dörtlü konuma duyarlı bir dedektör kullanılarak prob ışınının yer değiştirmesi olarak ölçülür.
Daha sonra, fototermal ışın sapma izleri, hem numune hem de referans için sıcaklığın bir fonksiyonu olarak ölçülür. Foto ışın sapma izlerinin bileşik analizi, reaksiyon hacmi ve entalpi değişiklikleri açısından kalsiyum kaynaklı doğrulama anahtarının mekanizması hakkında bilgi sağlar. Fototermal ışın sapmasının, üst akış gibi mevcut direk üzerindeki ana avantajı, bu tekniğin, milisaniyenin altındaki zaman ölçeğinde hacim ve entropi değişikliklerinin aynı anda tespit edilmesine izin vermesidir.
Bu tekniğin görsel gösterimi gereklidir, çünkü cihazın hassas bir şekilde hizalanması termodinamik parametrelerin geri kazanımı için kritik öneme sahiptir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Walter Gonzalez olacak, İstenmeyen herhangi bir açılmayı önlemek için numune hazırlamayı ve tüm numune manipülasyonlarını karanlık bir odada gerçekleştirin. Bu videoda, çekim amacıyla ışıkta adımlar gösterilmektedir.
DM Nitro'yu 50 milimolar yığın tamponunda çözündürmeye başlamak için 100 milimolar potasyum klorür, pH 7.0'dan 400 mikromolar nihai konsantrasyona kadar. İstenen kalsiyum / DN nitro konsantrasyon oranını elde etmek için 0.1 molar stok çözeltisinden kalsiyum klorür ekleyin. Daha sonra, referans bileşik potasyum siyanür veya sodyum kromatı aynı tamponda çözündürün.
Örneğe gelince, fototermal ışın sapması için temel deneysel konfigürasyonun şeması için metin protokolüne bakın. Deneyi kurarken, prob ışınını, sıcaklık kontrollü bir hücre tutucusuna yerleştirilmiş bir hücrenin merkezinden geçirin. Daha sonra bir iğne deliği kullanarak, prob ışınının çapını bir milimetreye ayarlayın, prob ışınını konuma duyarlı dedektörün merkezinde ortalamak için numunenin arkasında ikinci bir ayna kullanın.
Pro ışınını dedektörün merkezine odaklayın, böylece üst iki diyot ile alttaki iki diyot arasındaki voltaj farkı ve ayrıca dedektörün sol ve sağ tarafındaki iki diyot arasındaki voltaj farkı sıfır olur. Daha sonra, bir ND YAG lazerin 355 nanometre çıkışı olan pompa ışınının çapını şekillendirin. 2 355 nanometre lazer ayna arasına yerleştirilmiş üç milimetrelik bir iğne deliği kullanarak, pompa ışınını vete'nin merkezinden birlikte yayar.
Her iki lazer ışınının da optik hücrenin merkezinden neredeyse koline bir şekilde yayılması önemlidir. Ölçülebilir bir sapma açısı ve dolayısıyla yüksek genlikli fototermal ışın sapması veya PBD sinyali elde etmek için, iyi bir sinyal-gürültü oranı ve daha uzun zaman ölçeklerinde kararlı PBD genliği ile karakterize edilen tatmin edici bir PBD sinyali elde etmek için prob ve pompa ışınını hizalamak için bir referans bileşik kullanın. Ardından, 355 nanometre lazer aynaların artımlı ayarını yaparak pompa ışınını prob ışınına göre konumlandırın.
PBD referans sinyalinin genliğini, konuma duyarlı dedektördeki iki üst ve alt foto diyot arasındaki fark olarak ölçün. PBD sinyali, hızlı bir zaman ölçeğinde genlikte hızlı bir artış göstermeli ve 100 milisaniyelik zaman ölçeğinde sabit kalmalıdır. PBD sinyalinin uyarma lazer gücüne ve Einstein'ın emilen sayısına doğrusal bağımlılığını ölçerek, salınan ısı enerjisine göre PBD sinyal genliğindeki doğrusallığı kontrol edin.
Çoklu foton emilimini önlemek için lazer gücünü yaklaşık 1000 mikro julün altında tutun. Ayrıca, pompa ışın gücünün azalmasını önlemek için numunenin veya referans bileşiğinin absorpsiyonunu 0,5'ten daha düşük bir uyarma dalga boyunda tutun. Bu adımlar, PBD sinyalinin doğrusallığını sağlayacaktır.
PBD izlerinin ölçümü ile başlayın. Referans için, referans bileşiğinin çözeltisini bir kuvars hücresine yerleştirin ve hücreyi sıcaklık kontrollü tutucuya yerleştirin. Referans PBD sinyalini, üç santigrat derecelik bir sıcaklık artışıyla 16 ila 35 santigrat derece arasındaki sıcaklık aralığında sıcaklığın bir fonksiyonu olarak tespit edin.
Her sıcaklık değişiminde. Konuma duyarlı dedektör üzerindeki prob ışınının konumunu kontrol edin ve konumu dedektörün merkezine göre yeniden ayarlayın. Gerekirse, metin protokolünde açıklandığı gibi PBD sinyalinin doğrusallığını kontrol edin.
Ardından, numune çözeltisini, referans ölçümü için optik hücrenin aynı yönünü koruyarak, referans bileşik için kullanılanla aynı optik hücreye yerleştirin. Referans ile aynı sıcaklık aralığında numune PBD izlerini tespit etmeye devam edin ve numune PBD genliğinin doğrusallığını kontrol edin. Pret tetikleme ve tetikleme sonrası PBD sinyali arasındaki fark olarak referans PBD sinyalinin genliğini alın.
Benzer şekilde, örnek PBD sinyalinin hızlı ve yavaş fazının genliğini belirleyin. Cihaz yanıt parametresini ortadan kaldırmak için, örnek PBD sinyalinin genliğini PBD sinyalinin genliği ile ölçeklendirin. Referans için, numune sinyalinin referans sinyaline oranı, çözeltiye ısı salınımının ve foto ile başlatılan bir reaksiyonla ilişkili termal olmayan hacim değişiminin, hızlı ve yavaş işlem ölçeği için reaksiyon hacmini ve entalpi değişimini belirlemek için sıcaklığa bağlı terime karşı enerji ile çarpılan genlik oranının grafiğinin eğiminden ve kesişiminden belirlenebileceği bir denklem verir, Gözlemlenen hacim ve entalpi, uygun kuantum verimine dönüşür.
Metin protokolünde bulunan denklemlere göre, bireysel adımlar için genlikler ve ömürler, verilerin hacim ve entalpi değişimlerini tanımlayan zamana bağlı fonksiyona uydurulmasıyla analiz edilir. Hızlı adımın genliği, numune PBD sinyalinin istem fazının genliğine karşılık gelir ve sonraki adımın genliği, numune PBD sinyalinin yavaş fazının genliğine karşılık gelir. Bireysel süreçler için hız sabitinin sıcaklığa bağımlılığından her bir işlem için, aktivasyon entalpisi ve entropi parametreleri IR grafikleri kullanılarak kolayca belirlenebilir.
Kalsiyum DM nitrodan kalsiyum foto salınımı için PBD izlerinin temsili bir örneği burada gösterilmiştir. Hızlı faz, kalsiyum DM nitronun foto bölünmesine ve kalsiyum serbest kalmasına karşılık gelirken, yavaş faz, foto olmayan kafese kalsiyum bağlanmasını yansıtır. Nöronal kalsiyum sensörünün aşağı akış düzenleyici eleman antagonisti, regülatörü veya rüyasının C terminal alanına kalsiyum ilişkisi için PBD izi, kalsiyum foto ayrışması üzerine burada gösterilmiştir.
Fotoğrafta yayınlanan ligand, gözlemlenen hız sabitinin sıcaklığa bağımlılığından 20 santigrat derecede 1.3 artı veya eksi 0.3 milisaniye zaman sabiti ile rüyanın C terminal alanına bağlanır. Kalsiyumun rüyanın C terminal alanına bağlanması için aktivasyon bariyeri, mol başına 9.2 artı veya eksi 0.4 kilo kalori olarak belirlendi. Bu prosedürü denerken, referans için olanlarla aynı koşullar altında numune PBD izlerini ölçmeyi unutmamak önemlidir.
Bu videoyu izledikten sonra, tekrarlanabilir bir termodinamik parametre elde etmek için numunenin nasıl hazırlanacağını, enstrümantasyonun nasıl hizalanacağını ve verilerin nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, nöronda kalsiyum seviyelerinin değişim dinamiklerini araştırmak için fototermal ışın sapma tekniğini ve kafesli kalsiyum bileşiği DM-nitrofen ile birlikte kullanır. Odak noktası, kalsiyum bağlanma olaylarının mikrosaniye ve milisaniye zaman ölçeklerindedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyofizik
- Strüktürel Biyoloji
Arka Plan
- Kalsiyum transdüserleri, nöronal sinyallemede kritik bir rol oynar.
- Yapılandırma değişikliklerini anlamak, kalsiyum sinyalleşme mekanizmalarını açıklamak için esastır.
- Fototermal ışın sapma, bu hızlı dinamikleri incelemek için yeni bir yaklaşım sunar.
- DM-nitrofen, kontrollü kalsiyum salınımına izin veren bir kafesli kalsiyum bileşiğidir.
Çalışmanın Amacı
- Kalsiyum transdüserlerine ligand bağlanması ile ilişkili yapılandırma değişikliklerini karakterize etmek.
- Bu değişimlerin dinamiklerini alt milisaniye zaman ölçeğinde ölçmek.
- Kalsiyum bağlanması sırasındaki reaksiyon hacmi ve entalpi değişimlerini analiz etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Fototermal ışın sapma tekniğinin uygulanması.
- Serbest kalsiyumun foto salınımı için DM-nitrofen kullanımı.
- Prob ışının yer değiştirmesi olarak yansıma indeksi değişimlerinin ölçülmesi.
- Fototermal ışın sapma izlerinin sıcaklık fonksiyonu olarak analizi.
Ana Sonuçlar
- APO ve kalsiyum bağlı proteinler arasındaki yapılandırma geçişlerinin başarılı bir şekilde ölçülmesi.
- Kalsiyum kaynaklı yapılandırma değişim mekanizmasına ilişkin görüşler.
- Hacim ve entropide değişimlerin eş zamanlı tespitinin gösterilmesi.
- Fototermal ışın sapmanın geleneksel yöntemlere göre avantajlarının vurgulanması.
Sonuçlar
- Çalışma, kalsiyum sinyalleşme dinamikleri hakkında daha derin bir anlayış sağlar.
- Fototermal ışın sapma, hızlı moleküler değişimleri incelemek için değerli bir araçtır.
- Gelecek araştırmaları, bu bulgulara dayanarak diğer kalsiyumla ilgili süreçleri keşfetmek için geliştirilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Photothermal beam deflection enables direct, label-free quantification of submillisecond conformational changes in proteins, providing unique insight into rapid ligand-induced structural transitions. This capability addresses a critical gap in early discovery and mechanistic de-risking, especially for targets lacking intrinsic chromophores or fluorophores. The method enhances predictive confidence in target validation and supports risk-adjusted portfolio decisions by delivering quantitative thermodynamic parameters inaccessible to traditional techniques.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of ligand-induced conformational changes on microsecond to millisecond timescales.
- Quantifies reaction volume and enthalpy changes, supporting mechanistic de-risking of target engagement.
- Facilitates functional validation of protein targets without the need for extrinsic labels.
- Improves predictive confidence for advancing targets through the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative readouts of protein conformational dynamics for assay development.
- Supports reproducibility and standardization by enabling simultaneous detection of volume and enthalpy changes.
- Prepares robust biological systems for downstream screening workflows, even for non-fluorescent targets.
- Enables reliable evaluation of compound-induced structural effects in early screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biophysical measurements with disease-relevant protein function for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by quantifying activation barriers and kinetic parameters relevant to preclinical models.
- Provides mechanistic data to inform biomarker strategies when supported by target biology.
Pipeline & Workflow Integration
Photothermal beam deflection integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical mechanistic studies, particularly where rapid conformational dynamics are critical decision points.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying fast structural transitions and thermodynamic parameters.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound triage.
- Analytics: Provides high-resolution measurements of reaction kinetics, volume, and enthalpy changes for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by aligning kinetic and thermodynamic data with functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, label-free platform for diverse protein targets and ligand classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability across protein systems.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing early, quantitative biophysical data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with robust mechanistic evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in photothermal instrumentation alignment and data analysis.
- Demands precise temperature control and optical setup for reproducible measurements.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and reference calibration.
- Adaptable to proteins lacking chromophores or fluorophores, broadening applicability.
- Instrument sensitivity and alignment are critical for accurate thermodynamic parameter recovery.
