Name: Fototermal Işın Sapmasına tarafından Çözülmüş Proteinler Submillisecond Konformasyonel değişiklikler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Öğrenin fototermal ışın sapması tekniğiyle kalsiyum transdüserlerindeki submilisaniyelik konformasyonel değişiklikleri incelemeyi. Bu yöntem hacim ve entropi değişimlerini eşzamanlı tespit eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (MCB 1021831, JM) ve J. &amp; E. Biyomedikal Araştırma Programı (Sağlık Florida Bölümü, JM) tarafından desteklenmiştir.

1.. Örnek Hazırlık <ol><li> Numune hazırlama ve istenmeyen uncaging önlemek için karanlık bir odada bütün numune manipülasyonlar yürütmek. </li><li> 50 mM HEPES içinde N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis [(oksi-karbonil) metil] -1,2-etandiamin) - (2-nitro-4 ,5-dimetoksi-fenil) - DM-nitrophen ((1 çözünürleştirilir tampon, 100 mM KCI, 400 uM&#39;lik nihai konsantrasyona kadar pH 7.0 (350m ε = 4330 M-1cm-1 9). </li><li> [DM-nitrophen]: [Ca2 +] arzu edilen bir oran elde etmek için 0.1 M stok çözeltiden CaCl 2 ekleyin. 10 uM &#39;den büyük Ca 2 + ilişkisi için Kd ile proteinleri için, [Ca2 +] oranı: 1:1 [DM-nitrophen] Uncaged DM-nitrophen fotoğraf-serbest Ca2 + bağlanmasını önlemek için tercih edilir, . Gerçekten de, bir kalsiyum bağlayıcı proteinin% 90 ~ 10 nM ve 400 mM olmak DM-nitrophen ve Ca2 + toplam konsantrasyonu olduğu DM-nitrophen için Kd değeri dikkate alınarakK d = 10 uM apoform olacaktır. Öte yandan, Kd &lt;10 uM olan proteinlere bağlanarak Ca 2 + çalışması için, bu, [Ca2 +] azaltmak için tercih edilir: Ca2 + kompleksleşmesini önlemek için 0.95 [DM-nitrophen] oranını apo- protein kafes fotoğraf ayrışma önce. </li><li> Referans bileşiği, K 3 çözünürleştirilir [Fe (III) (CN) 6], ya da numune ile aynı tampon maddesi içinde Na 2 CrO 4,. </li></ol> 2. Deney ayarlama <ol><li> Temel deneysel konfigürasyon Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. </li><li> 1 mm prob kirişin çapı (He-Ne lazerinin 632 nm çıkışı, ~ 5 mW lazer gücü) ayarlamak ve bir sıcaklığa yerleştirilmiş bir hücrenin merkezi aracılığıyla prob demeti yaymak için bir pim deliği (P 2) kullanarak Bir M 1 ayna kullanarak hücre tutucu kontrollü. </li><li> Sonda kiriş ortalamak için örnek arkasına bir ayna (2 M) kullanarakpozisyon duyarlı dedektör merkezi üzerinde. </li><li> En iyi iki diyotlar ve alt iki diyot gibi, dedektörün sağ ve sol tarafında, iki diyot arasındaki voltaj farkı arasındaki gerilim farkıdır ki bu şekilde detektör ortasına sonda kiriş Odak sıfır. </li><li> YAG lazer FWHM 5 nsn) ile nano iki 355 nm lazer ayna arasına yerleştirilmiş bir 3 mm iğne deliği (P 1) kullanılarak: Daha sonra, pompa demetinin çapı, Q-anahtarlı Nd bir 355 nm çıkış şekli. </li><li> Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi küvet merkezinden pompa ışını Copropagate. Her iki lazer ışınları, ölçülebilir bir sapma açısı ve PBD sinyalin böylece yüksek amplitüdü elde etmek için, yaklaşık eş doğrusal bir şekilde optik hücrenin merkezine doğru yayılır önemlidir. Deneysel koşullar altında, prob ve pompa kiriş kesişme açısı en az 15 ° &#39;dir. </li><li> Prob ve pompayı hizalamak için bir referans bileşik kullanınuzun zaman ölçeklerinde (~ 100 msn) üzerinde iyi bir S / N oranı ve istikrarlı PBD genlik, yani tatmin edici bir PBD sinyal elde etmek için ışın. </li><li> 355 nm lazer aynası artımlı ayarlanması ile prob huzmesine nisbetle pompa kirişin konumunu ayarlayın. </li><li> Pozisyon hassas detektörü, iki üst ve alt fotodiyotlar arasında bir fark olarak PBD referans sinyalinin genliğini ölçün. PBD sinyali hızlı bir zaman ölçekli (&lt;10 mikro-saniye) üzerinde genlik hızlı bir artış gösterir ve Şekil 3 &#39;de gösterildiği gibi, 100 milisaniye ölçeğinde stabil kalmalıdır. PDB genlik vurdu değişkenliği atış sinyal genliğinin% 5 içinde ve sinyal uyarlık esas titreşimlerden etkilenir. </li><li> Emilen uyarım lazer gücü ve Einsteins sayısına PBD sinyalinin doğrusal bağımlılığı, E a ölçerek çıkan ısı enerjisi ile ilgili olarak PBD sinyal amplitüdünün doğrusallığını kontrol= A uyarım dalga boyunda, referans absorbans karşılık gelen (1-10-A). </li><li> Lazer gücü altında, yaklaşık 1000 μJ ve multiphoton emme ve sırasıyla pompa ışını güç azalmayı önlemek için uyarım dalga boyu en az 0.5 &#39;de örnek / referans bileşiği absorbans tutun ve PBD sinyalinin doğrusallığını sağlar. </li></ol> 3. PBD Ölçümler <ol><li> Referans için PBD izlerin ölçümü ile başlayın. Bir 1.0 cm x 1.0 cm ve 1.0 cm x 0.5 cm kuvars hücrede referans bileşiği çözeltisi yerleştirin ve ısı kontrollü tutucu hücreyi yerleştirin. Her iki yol uzunlukları karşılaştırılabilir PBD genlik sağlar. </li><li> 3 ° C sıcaklık artışı ile 16-35 ° C sıcaklık aralığı içinde, sıcaklığın bir fonksiyonu olarak referans PBD sinyalini algılar </li><li> Her sıcaklık değişimi üzerine, pozisyon duyarlı dedektör prob ışınının pozisyonunu kontrol edin ve yenidenGerekirse, dedektörün merkezine konumunu ayarlamak. </li><li> Denklem 2&#39;ye göre bir fonksiyonu olarak [(dn / dt) / C p ρ] terimi PBD sinyalinin doğrusallığını kontrol edin. </li><li> Referans ölçümü için optik hücrenin aynı yönde tutmak referans bileşiği için olan ile aynı optik hücre içindeki örnek çözeltisi yerleştirin. </li><li> Referans için aynı sıcaklık aralığında, örnek PBD izleri tespit eder ve [(dn / dt) / C p ρ] terimi ile ilgili olarak örnek PBD genlik doğrusallığını kontrol edin. </li></ol> 4. Veri Analizi Sapmanın büyüklüğü nedeniyle Denklem 1&#39;e göre numune ısıtma (ΔV inci) ve ısısal olmayan hacim değişikliği (ΔV nonth) için hacim değişikliği ile doğrudan orantılıdır: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq1.jpg" alt="Denklem 1" /> Numunenin (A S genliği) Ve referans (A r) PBD sinyal sırasıyla Denklemler 2 ve 3 kullanılarak tarif edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq2.jpg" alt="Denklem 2" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq3.jpg" alt="Denklem 3" /> PBD sinyali gösterge yanıt parametre (K) ile doğrudan orantılıdır ve Einsteins sayısının emilen (E a). Denklem 2&#39;de ilk terim, (dn / dt) (1/ρC p) Q, bağlı çözücü bırakılan ısı, sinyal değişiklik karşılık gelir. Dn / dt vadeli kırılma endeksinin sıcaklığa bağlı değişimi temsil, ρ çözücü yoğunluğu, C p ısı kapasitesi. Tüm parametreler, damıtılmış su ile tanınırlar ve damıtılmış su içinde ve uygun bir tamponda, referans bileşik için bir PBD sinyalinin karşılaştırılması ile bir tampon çözeltisi için belirlenebilir. Q ısı returne miktarıdırçözücüye d. Ρ (dn / d ρ) terimi, 10-40 ° C&#39;de 10 arasındaki sıcaklık aralığında, sıcaklık-bağımsız olan bir birim daha sabittir. Δn abs terimi nedeniyle çözeltide emici türlerin varlığı kırılma indeksi değişimine karşılık gelen ve sonda ışınının dalga boyu çözelti içinde herhangi bir türün absorpsiyon spektrumları göre kaydırılır eğer bulunuyor ihmal edilebilir. Referans bileşik (A r) kaynaklanan sinyal E h ν, uyarma dalga boyunda foton enerjisi Denklem 3 ile ifade edilir E h ν = 80.5 kcal / mol 355 nm uyarma için. <ol><li> Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi Ön tetikleme ve sonrası PBD tetikleme sinyali arasındaki fark olarak referans PBD sinyalinin genliğini al. Benzer bir şekilde, hızlı (A s hızlı) genliğini belirlemek ve yavaş faz (A s yavaş) Numune PBD sinyalinin. </li><li> , Alet tepki parametresi K ortadan referans için PBD sinyalinin genliği ile numune PBD sinyalinin genliğini ölçeklemek için. Referans sinyalin numune sinyalinin oranı Denklem 4 verir ve benzeri gibi yazılabilir: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq4.jpg" alt="Denklem 4" /> </li><li> Bu denklemi kullanılarak, çözeltinin (Q) ve termal olmayan bir hacim değişikliği [bir arsa sırasıyla eğim ve kesişim noktası, bir foto-başlatılan reaksiyon ile bağlantılı (ΔV nonth) (A s / A r) E bırakılan ısıyı tespit h ν] sıcaklık bağımlı vadeli [(dn / dt) (1/ρCp)] karşı terim. </li><li> , Reaksiyon hacmi ve hızlı ve yavaş bir süreç için entalpi değişimlerini belirlemek Denklem 5-7 göre uygun kuantum verimi gözlenen hacim ve entalpi değişimi büyütmek için. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/50969/50969eq5.jpg&quot; alt = &quot;Denklem 5&quot; /&gt; <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq6.jpg" alt="Denklem 6" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq7.jpg" alt="Denklem 7" /> Kinetik 10 mikro saniye olduğu ~ 200 milisaniye arasındaki bir zaman ölçeğinde meydana gelen bir çok aşamalı bir işlem için, hacmi ve reaksiyonun tek tek adımlarla bağlantılı entalpi değişiklikleri tespit edilebilir. Tek tek aşamalar için yayılmalar ve yaşam süreleri hacmi ve entalpi değişiklikleri zaman profilini açıklayan fonksiyon f (t) için veri uyması yolu ile analiz edilir. <img alt="Denklem 8" src="/files/ftp_upload/50969/50969eq8.jpg" /> α 0 A s, hızlı karşılık gelir ve bir s yavaş her bir işlem için karşılık gelen ve α τ burada i bireysel reaksiyon adımlarının ömrü vardır. Fo oranı sabitinin sıcaklık bağımlılığındanr süreçleri tek tek aktivasyon entalpi ve entropi parametreler kolaylıkla Eyring araziler kullanılarak belirlenebilir (i i = 1 / τ k). </li></ol>

<ol><li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+photothermal+methods%3A+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li>
<li>Larsen, R. W., Mikšovská, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Coord.+Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li>
<li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Bioph.+Chem%22%5BJournal%5D)">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li>
<li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li>
<li>Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li>
<li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li>
<li>Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5%2C12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li>
<li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li>
<li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li>
<li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li>
<li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+photolysis+of+caged+calcium%3A+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li>
<li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+in+metalloproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li>
<li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds%3A+effect+of+proximal+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li>
<li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-%282-nitrobenzyl%29+caged+urea+compound%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Fototermal yöntemleri geride fiziksel prensibi bir fotoğraf heyecanlı molekülü çevreleyen çözücü 1,12 termal ısıtma sonuçlanan, zemin durumuna titreşim rahatlama yoluyla fazla enerjiyi dağıtacağını olmasıdır. Örneğin su gibi çözücü maddeler, bu hızlı bir hacim genişlemesi (ΔV th) üretir. Uyarılmış hal moleküller de bağlı bağı kırma / formasyonu ve / veya molekül (ler) i (van der yani değişiklikler moleküler boyutları değiştirebilir molekül yapısında değişikliklere termal olmayan bir hacim ...

Böyle foto akustik kalorimetrisine, fototermal ışın saptırma (PDB) ve nanosaniye lazer uyarma ile birlikte geçici mazgal gibi foto-termal yöntemler kısa ömürlü ara 1,2 zaman çözüme çalışmaları için optik spectroscopiesle geçici güçlü bir alternatif temsil eder. Bu tür geçici emme ve IR spektroskopisi gibi optik teknikler, aksine, bu çevreleyen kromofor soğurma değişimlerin zaman profilini izlemek, fototermal teknikleri optik zaman profilleri araştırılması için değerli araçlar ısı / hacim değişikliklerini gösteren bir zaman-bağımlılığı tespit etmek ve bu nedenle &quot;sessiz&quot; süreçleri. Şimdiye kadar, foto akustik kalorimetri ve geçici ızgara başarılı globinlerine 3,4, oksijen sensörü protein ile ligand etkileşimlerine atomlu ligand göçü de dahil olmak üzere foto-neden olduğu işlemlerin yapısal dinamiklerini incelemek için uygulanmış FixL 5, 6 oksidazlar elektron ve hem-bakır proton nakliye Birnd fotosistem II olarak rodopsin 7 ve 8 kriptokrom konformasyonel dinamiğinde verilmedi-izomerizasyon. Bir iç kromofor ve / veya flüorofor eksik biyolojik sistemlere fototermal tekniklerinin kullanılmasını genişletmek için, PBD teknik olarak, foto-tetikleyiciye kafesli bileşiğinin kullanılması birkaç mikrosaniye olan ligand / alt-tabaka konsantrasyonunda bir artış ile ya da daha hızlı birleştirildi kafesli bileşik üzerinde. Bu yaklaşım sağlar ligand / substrat bir iç flüoroforu veya kromofora eksik olan proteinler ve ticari stop akış araçlar tarafından erişilebilir olmayan zaman-ölçeğinde bağlama ile ilişkili yapısal değişikliklerin dinamikleri ve enerjilerin izlenmesi. Burada kafes bileşiğin, Ca 2 + termodinamik DM-nitrophen, foto-yarılma hem de nöronal kalsiyum sensörünün C-terminal alanına Ca2 + Birliği için kinetik aşağı izlemek için PBD bir uygulamadere Düzenleyici Eleman rakip Modülatör (DÜŞ) sunulmuştur. Ca 2 + 10 mikro-saniye içinde foto-serbest Ca 2 + DM-nitrophen ve ~ 300 mikro saniye bir zaman sabiti ile bir unphotolysed kafesine rebinds. Diğer taraftan, apoDREAM mevcudiyetinde milisaniye ölçekte oluşan ek bir kinetik gözlenen ve proteine ​​bağlanma ligandı yansıtmaktadır. Biyolojik sistemlerde konformasyonel geçişler araştırmak üzere PBD uygulama bir şekilde etkili zorluklar nedeniyle sınırlıdır; güçlü ve yeniden üretilebilir bir PBD sinyal elde etmek için prob ve pompa ışınının, örneğin zorlu bir hizalama. Ancak, alet set-up titiz bir tasarım, sıcaklığın bir hassas kontrolü, ve prob ve pompa ışın dikkatli bir hizalama geniş bir zaman içinde çözünen hacmi ve entalpi değişiklikleri izlenmesine olanak sağlar tutarlı ve sağlam PBD sinyalini sağlamak 10 mikro saniye olduğu yaklaşık 200 msn den zaman ölçeği. Buna ek olarak, modific Invb aynı sıcaklık, tampon bileşimi, optik hücre yönelim, lazer gücü altında örnek ve referans izleri tespit sağlamak için deneysel işlemin ations anlamlı ölçülen reaksiyon hacimleri ve entalpilerinin yılında deneysel hatayı azaltır.

<table><tbody><tr><td>1-(4,5-Dimetoksi-2-Nitrofenil)-1,2-Diaminoetan-N,N,N&#039;,N&#039; -Tetraasetik Asit</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>D-6814</td><td>DM-nitrofen, kafes kalsiyum bileşiği, fotoayrışmayı önlemek için stok çözeltilerini karanlıkta tutun</td></tr><tr><td>4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit, - (2-Hidroksietil) piperazin- N ve asal; -(2-etansülfonik asit)</td><td>Sigma Adrich</td><td>0909C</td><td>HEPES tamponu</td></tr><tr><td>Potasyum ferrisiyanür (III)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>702587 PBD ölçümleri için referans bileşiği</td></tr><tr><td>Sodyum kromat</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>307831 PBD ölçümleri için referans bileşiği</td></tr><tr><td>He-Ne Lazer Diyot 5 mW 635 nm</td><td>Edmund Optics</td><td>54-179</td><td>PBD ölçümleri için prob ışını olarak kullanın</td></tr><tr><td>Osiloskop,&nbsp;</td><td>LeCroy</td><td>Wave Surfer 42Xs</td><td>400 MHz bant genişliği</td></tr><tr><td>Nd:YAG lazer</td><td>PBD ölçümleri için</td><td>Continuum</td><td>ML II</td> pompa ışını</tr><tr><td>M355; Nd: YAG lazer ayna</td><td>Edmund Optics</td><td>47-324</td><td>lazer ayna 355 nm lazer hattı</td></tr><tr><td>için M 1 ve M 2 ; Lazer diyot ayna</td><td>Edmund Optics</td><td>43-532</td><td>visilbe lazer düz ayna, dalga boyu aralığı 300-700 nm</td></tr><tr><td>P1 ve P2; İris Diyafram</td><td>Edmund Optik</td><td>62-649</td><td>prob ve pum kirişlerini şekillendirmek için pim deliği</td></tr><tr><td>L1; bi-dışbükey lens</td><td>Thorlabs</td><td>LB1844</td>, <td>prob ışınını dedektöre odaklamak için bir lens, EFL 50 mm, dalga boyu aralığı 350-2.000</td></tr><tr><td>nm DM, dikroik ayna</td><td>Thorlabs</td>, 505 nm F<td></td>1 kesme <td>dalga boyuna sahip uzun geçişli dikroik ayna</td>DMLP505</tr><tr><td>; Kenar filtresi</td><td>Andower</td><td>500FH90-25</td>, <td>500 nm kesme dalga boyuna sahip uzun geçiren bir filtre</td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrollü küvet tutucu</td><td>Quantum Northwest</td><td>FLASH 300</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

fototermal işın sapmasına tarafından Çözülmüş proteinler submillisecond konformasyonel değişiklikler

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Birlikte fotoğraf-akustik kalorimetrisinden ve termal mazgal Fototermal ışın saptırma geleneksel Dur kullanarak erişilebilir değil zaman ölçekler milisaniye mikrosaniye proteinlerin yapısal değişimlere neden ışığın zaman profil hacim ve entalpi değişimleri izlemek fototermal yöntemleri ailesine ait -akış aletleri. Hacim ve / veya genel entalpi değişiklikleri sondalandı Ek olarak, bu teknikler, bir florofor ve bir kromofor veya etiket protein eksikliği ve diğer biomacromolecules uygulanabilir. Ca 2 ile ilişkili yapısal değişikliklerin dinamikleri ve enerjikliğin izlemek için + kalsiyum dönüştürücüler gibi nöronal kalsiyum sensörler, kafesli bir kalsiyum bileşiği, DM-nitrophen, fotoğraf-tetik serbest kalsiyum hızlı bir (τ &lt;20 mikro-saniye) artışı istihdam edilmektedir bağlanma konsantrasyon ve bununla bağlantılı ve entalpi değişiklikleri fototermal ışın saptırma tekniği kullanılarak sondalandı.

PBD temsili bir örneği, Ca 2 + DM-nitrophen Ca 2 + verilmedi-serbest bırakılması için izleri, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Yavaş faz Ca 2 + nonphotolysed kafese bağlanmasını gösterir ise, hızlı faz, Ca 2 + DM-nitrophen ve Ca 2 + kurtuluş foto-bölünmeye karşı gelmektedir. Sıcaklık bağlı faktör [C p ρ / (dn / dt)] bir fonksiyonu olarak referans bileşiğinin genliğine ölçekli hızlı ve yavaş bir faz için örnek PBD amplitüdünün arsa faktörü ...

Burada mikrosaniye ve milisaniyelik dinamikleri ve nöronal kalsiyum sensör, aşağı akış düzenleyici öğe Antagonist modülatörüne kalsiyum bağlanma kapasitesi ile bağlandığı yapısal değişikliklerin enerjileri izlemek için bir kafesli kalsiyum bileşiği, DM-nitrophen ile kombinasyon halinde fototermal ışın saptırma tekniğin bir uygulama rapor .

Fototermal Işın Sapmasına tarafından Çözülmüş Proteinler Submillisecond Konformasyonel değişiklikler

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kalsiyum transducerlarına ligand bağlanmasıyla ilişkili konformasyonel değişiklikleri alt milisaniye zaman ölçeğinde karakterize etmektir. APO proteinden kalsiyum bağlı proteine geçişteki konformasyonel geçiş, serbest kalsiyumun foto-salınımına yol açan kafeslenmiş bir kalsiyum bileşiği olan kalsiyum DM nitro'nun foto-koparılması ile tetiklenir. Kırılma indeksindeki ilgili değişim, dörtlü konum hassasiyetli bir dedektör kullanılarak prob ışınının yer değiştirmesi olarak ölçülür.Ardından, hem örnek hem de referans için fototermal ışın sapma izleri sıcaklığın bir fonksiyonu olarak ölçülür. Foto ışın sapma izlerinin bileşik analizi, reaksiyon hacmi ve entalpi değişimleri açısından kalsiyumla tetiklenen konformasyonel geçiş mekanizmasına dair bilgi sağlar. Fototermal ışın sapmanın, top flow gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, bu tekniğin hacim ve entropi değişimlerinin milisaniyenin altındaki zaman ölçeğinde eş zamanlı tespitine olanak tanımasıdır.Enstrümanın hassas hizalanması termodinamik parametrelerin geri kazanımı için kritik olduğundan, bu tekniğin görsel gösterimi gereklidir. Prosedürü, laboratuvarımdaki lisansüstü öğrencisi Walter Gonzale

submillisecond-conformational-changes-proteins-resolved-photothermal

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Moleküler ışında bulunan farklı konformatörlerin veya kümelerin mekansal olarak ayrılmasını sağlayan bir teknik sunuyoruz. Elektrostatik bir saptırıcı, türleri kütle-dipol moment oranlarına göre ayırmak için kullanılır ve bu da tek bir konformatör veya küme stoichiometry'nin gaz fazlı topluluklarının üretimine yol açtı.

Moleküler Konformatörlerin ve Kümelerin Mekansal Ayrımı

Protein fonksiyonunun temel adımları, özellikle omurga konformasyonel değişiklikleri ve proton transfer reaksiyonları, genellikle mikrosaniye ila milisaniye zaman ölçeğinde gerçekleşir. Bu dinamik süreçler, özellikle işlevi ışık tarafından tetiklenen proteinler için, zaman çözümlü adım taramalı Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopisi ile incelenebilir.

Tarafından Işığa Proteinler Proton Transferi ve Protein Konformasyon Dynamics Zamanda çözülmüş kızılötesi spektroskopi Fourier-dönüşümü Step-tarama

Yüksek çözünürlüklü bir Coulomb patlama görüntüleme kurulumu kullanarak bir moleküler dönme dalga paketinin gerçek zamanlı bir filmini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Lazer güdümlü Ultrafast Moleküler Rotasyon Doğrudan Görüntüleme

Burada, bir sütun halinde photoexcited molekülleri etrafında yerel yapıların deformasyonlar gözlemleri sağlayan diferansiyel-algılama analizleri zaman karar vermek kızılötesi titreşim spektroskopisinin ve elektron kırınım protokolleri mevcut sıvı kristal, yapısı ve bu fotoaktif malzeme dinamikleri arasındaki ilişki üzerine atomik bir bakış açısı veren.

Yapısal Photoresponsive sıvı kristaller dinamikleri gözlemlemek için yeni teknikleri

Bir seri femtosecond zaman çözüldü kristalografisi deney başarısı verimli örnek Teslimde bağlıdır. Burada, bacteriorhodopsin microcrystals bir yüksek viskozite mikro-ekstrüzyon enjektör üzerinden ekstrüzyon optimize etmek için iletişim kuralları açıklar. Metodoloji bir roman üç yönlü bağlaştırıcı ile örnek homojenizasyon ve görselleştirme ile yüksek hızlı bir fotoğraf makinesi yararlanır.

Microcrystals yüksek viskozite ekstrüzyon için zaman karar vermek seri halinde Femtosecond kristalografisi x-ışını lazerleri iyileştirilmesi

Tek makromoleküllerin mikroakışkan cihazlarda immobilize edilebisi ve konformasyonlarındaki değişiklikleri kesme akışı altında ölçen bir protokol sayılmısAk. Bu protokol, bir akış ortamında proteinler ve DNA gibi biyomoleküllerin biyomekanik ve fonksiyonel özelliklerini karakterize etmek için yararlıdır.

Floresan Mikroskopi ile Kesme Akışı Altında Tek Moleküllü Konformasyonel Değişikliklerin Karakterizasyonu

Diamond beamline I24'te seri senkrotron kristalografisi için sabit hedef numune hazırlama, veri toplama ve veri işleme için kapsamlı bir kılavuz sunuyoruz.

Diamond Light Source'da Sabit Hedef Seri Veri Toplama

Zaman çözümlenmiş tek moleküllü protein kaynaklı floresan geliştirme, proteinlerdeki yerel yapısal değişikliklere duyarlı yararlı bir floresan spektroskopik yakınlık sensörüdür. Burada, daha uzun menzilli FRET cetveli kullanılarak ölçüldüğünde küresel olarak yapılandırılmamış ve kararsız olarak bilinen α-Synuclein'deki kararlı yerel konformasyonları ortaya çıkarmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Kararlı Yerel Konformasyonları Belirlemek için Zaman Çözümlenmiş Protein Kaynaklı Floresan Geliştirmeyi Kullanmak Bir Seferde Bir α-Synuclein Monomer

Nötron geri saçılma spektroskopisi, proteinlerin ps-ns dinamiklerine ve hidrasyon suyuna tahribatsız ve etiketsiz bir erişim sunar. İş akışı, amiloid proteinleri üzerine iki çalışma ile sunulmaktadır: agregasyon sırasında lizozimin zamanla çözülmüş dinamikleri ve tau'nun lif oluşumu üzerine hidrasyon suyu dinamikleri üzerine.

Proteinlerin ve hidrasyon suyunun pikosaniye-nanosaniye dinamiklerini incelemek için yüksek çözünürlüklü nötron spektroskopisi

Burada, konfokal mikroskopi modunda tek molekül seviyesinde zamanla çözülen floresan anizotropi kullanarak biyomoleküllerin yerel esnekliğini ve dinamiklerini incelemek için protokolü sunuyoruz.

Biyomoleküllerde Yerel Esnekliği Karakterize Etmek için Tek Moleküllerden Zamanla Çözülen Floresan Anizotropisi

Plazmonik nano cımbızlayıcılar, proteinler de dahil olmak üzere tek nanoparçacıkları nanometre ölçekli bir optik alan içinde yakalamak için altın nanoyapılarda lokalize yüzey plazmon rezonansı kullanır. Saçılan sinyaldeki değişiklikler, protein varlığını ve konformasyonel dinamikleri ortaya çıkararak, florofor modifikasyonları veya yüzey bağlantısı olmadan izlemeyi mümkün kılar.

Plazmonik Nanotcımbız Kullanarak Tek Değiştirilmemiş Proteinlerin Konformasyonel Dinamiğinin İzlenmesi

Öğrenin fototermal ışın sapması tekniğiyle kalsiyum transdüserlerindeki submilisaniyelik konformasyonel değişiklikleri incelemeyi. Bu yöntem hacim ve entropi değişimlerini eşzamanlı tespit eder.

Fototermal Işın Sapmasına tarafından Çözülmüş Proteinler Submillisecond Konformasyonel değişiklikler

Daha fazla video keşfet