Fototermal Işın Sapmasına tarafından Çözülmüş Proteinler Submillisecond Konformasyonel değişiklikler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kalsiyum transducerlarına ligand bağlanmasıyla ilişkili konformasyonel değişiklikleri alt milisaniye zaman ölçeğinde karakterize etmektir. APO proteinden kalsiyum bağlı proteine geçişteki konformasyonel geçiş, serbest kalsiyumun foto-salınımına yol açan kafeslenmiş bir kalsiyum bileşiği olan kalsiyum DM nitro'nun foto-koparılması ile tetiklenir. Kırılma indeksindeki ilgili değişim, dörtlü konum hassasiyetli bir dedektör kullanılarak prob ışınının yer değiştirmesi olarak ölçülür.

Ardından, hem örnek hem de referans için fototermal ışın sapma izleri sıcaklığın bir fonksiyonu olarak ölçülür. Foto ışın sapma izlerinin bileşik analizi, reaksiyon hacmi ve entalpi değişimleri açısından kalsiyumla tetiklenen konformasyonel geçiş mekanizmasına dair bilgi sağlar. Fototermal ışın sapmanın, top flow gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, bu tekniğin hacim ve entropi değişimlerinin milisaniyenin altındaki zaman ölçeğinde eş zamanlı tespitine olanak tanımasıdır.

Enstrümanın hassas hizalanması termodinamik parametrelerin geri kazanımı için kritik olduğundan, bu tekniğin görsel gösterimi gereklidir. Prosedürü, laboratuvarımdaki lisansüstü öğrencisi Walter Gonzalez gerçekleştirecektir. İstenmeyen herhangi bir kafes dışına çıkarma (uncaging) işlemini önlemek için örnek hazırlama ve tüm örnek manipülasyonlarını karanlık bir odada gerçekleştirin. Bu videoda, adımlar çekim amaçlı olarak ışık altında gösterilmektedir.

Başlamak için DM Nitro'yu, 50 millimolar heaps buffer ve 100 millimolar potasyum klorür (pH 7.0) içerisinde 400 micromolar nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde çözün. İstenilen kalsiyum/DN nitro konsantrasyon oranını sağlamak için 0.1 molar stok çözeltiden kalsiyum klorür ekleyin. Ardından, referans bileşik olan potasyum siyanür veya sodyum kromatı aynı tampon çözelti içerisinde çözün.

Numuneye gelince, fototermal ışın sapması için temel deneysel konfigürasyonun şeması için metin protokolüne bakınız. Deneyi kurarken, prob ışınını sıcaklık kontrollü bir hücre tutucuya yerleştirilmiş bir hücrenin merkezinden geçirin. Ardından, bir pinhole kullanarak prob ışınının çapını bir milimetreye ayarlayın; prob ışınını konum hassasiyetli dedektörün merkezine hizalamak için numunenin arkasında ikinci bir ayna kullanın.

Üstteki iki diyot ile alttaki iki diyot arasındaki voltaj farkı ve detektörün sol ve sağ tarafındaki iki diyot arasındaki voltaj farkı sıfır olacak şekilde prob ışınını detektörün merkezine odaklayın. Ardından, bir ND YAG lazerin 355 nanometre çıktısı olan pompa ışınının çapını şekillendirin. İki adet 355 nanometre lazer aynası arasına yerleştirilmiş üç milimetrelik bir iğne deliği kullanarak, pompa ışınını vete merkezinden birlikte yayılacak şekilde geçirin.

Her iki lazer ışınının da optik hücrenin merkezinden neredeyse koline bir şekilde yayılması önemlidir. Ölçülebilir bir sapma açısı ve dolayısıyla yüksek genlikli bir fototermal ışın sapması veya PBD sinyali elde etmek için, iyi bir sinyal-gürültü oranı ve uzun zaman ölçeklerinde stabil bir PBD genliği ile karakterize edilen tatmin edici bir PBD sinyali sağlamak amacıyla prob ve pompa ışınını hizalamak için bir referans bileşik kullanın. Ardından, 355 nanometre lazer aynalarının kademeli ayarıyla pompa ışınını prob ışınına göre konumlandırın.

PBD referans sinyalinin genliğini, konum hassasiyetli dedektör üzerindeki üst ve alt iki fotodiyod arasındaki fark olarak ölçün. PBD sinyali, hızlı bir zaman ölçeğinde genlikte hızlı bir artış sergilemeli ve 100 milisaniyelik zaman ölçeğinde stabil kalmalıdır. PBD sinyalinin, uyarım lazer gücüne ve absorbe edilen Einstein sayısı üzerindeki doğrusal bağımlılığını ölçerek, PBD sinyal genliğinin salınan ısı enerjisiyle olan doğrusalığını kontrol edin.

Çok fotonlu absorbsiyonu önlemek için lazer gücünü yaklaşık 1000 micro joule değerinin altında tutun. Ayrıca, pompa ışını gücündeki azalmayı önlemek için numunenin veya referans bileşiğin bir uyarma dalga boyundaki absorbsansını 0,5'ten düşük tutun. Bu adımlar PBD sinyalinin lineerliğini sağlayacaktır.

İşleme PBD izlerinin ölçümü ile başlayın. Referans için, referans bileşik çözeltisini bir kuvars hücreye yerleştirin ve hücreyi sıcaklık kontrollü tutucuya konumlandırın. Referans PBD sinyalini, 16 ile 35 °C sıcaklık aralığında, üç °C'lik sıcaklık artışlarıyla sıcaklığın bir fonksiyonu olarak tespit edin.

Her sıcaklık değişiminde, prob ışınının konum hassasiyetli detektör üzerindeki konumunu kontrol edin ve konumu detektörün merkezine göre yeniden ayarlayın. Gerekirse, metin protokolünde açıklandığı şekilde PBD sinyalinin doğrusalığını kontrol edin.

Ardından, örnek çözeltisini, referans ölçümü için kullanılanla aynı optik hücreye, hücrenin yönünü referans ölçümündekiyle aynı tutarak yerleştirin. Örnek PBD izlerini referansla aynı sıcaklık aralığında tespit etme işlemine geçin ve örnek PBD genliğinin doğrusallığını kontrol edin. Referans PBD sinyalinin genliğini, tetikleme öncesi (pre-trigger) ve tetikleme sonrası (post-trigger) PBD sinyalleri arasındaki fark olarak belirleyin.

Benzer şekilde, örnek PBD sinyalinin hızlı ve yavaş fazlarının genliğini belirleyin. Cihaz tepki parametresini ortadan kaldırmak için, örnek PBD sinyalinin genliğini, PBD sinyalinin genliği ile ölçeklendirin. Referans için, örnek sinyalin referans sinyale oranı, foto-başlatılmış bir reaksiyonla ilişkili çözeltiye ısı salınımının ve termal olmayan hacim değişiminin, genlik oranının enerji ile çarpımının sıcaklığa bağlı terime karşı çizilen grafiğinin eğimi ve kesişim noktasından belirlenebileceği bir denklem sağlar; hızlı ve yavaş süreç ölçeği için reaksiyon hacmini ve entalpi değişimini belirlemek amacıyla, gözlemlenen hacim ve entalpi değişimini uygun kuantum verimiyle ölçeklendirin.

Metin protokolünde yer alan denklemlere göre, bireysel adımlar için genlikler ve ömürler, verilerin hacim ve entalpi değişimlerini tanımlayan zamana bağlı fonksiyona uydurulmasıyla analiz edilir. Hızlı adımın genliği, numune PBD sinyalinin anlık fazının genliğine karşılık gelir ve sonraki adımın genliği, numune PBD sinyalinin yavaş fazının genliğine karşılık gelir. Bireysel süreçlerin hız sabitinin sıcaklık bağımlılığından hareketle, her bir bireysel süreç için aktivasyon entalpisi ve entropi parametreleri IR grafikleri kullanılarak kolayca belirlenebilir.

Kalsiyum DM nitro'dan kalsiyumun fotoyayılımı için PBD izlerinin temsilci bir örneği burada gösterilmiştir. Hızlı faz, kalsiyum DM nitro'nun fotolizine ve kalsiyum salınımına karşılık gelirken, yavaş faz foto-uyarılmamış kafese kalsiyum bağlanmasını yansıtır. Kalsiyumun fotodisosiyasyonu üzerine nöronal kalsiyum sensörü downstream regulatory element antagonist, regulator, or dream'in C-terminal domainine kalsiyum birleşimi için PBD izi burada gösterilmiştir.

Gözlemlenen hız sabitinin sıcaklık bağımlılığından, foto-salınan ligandın, 20 °C'de 1,3 ± 0,3 milisaniyelik zaman sabitiyle dream proteininin C terminal domainine bağlandığı saptanmıştır. Kalsiyumun dream C terminal domainine bağlanması için aktivasyon bariyeri 9,2 ± 0,4 kcal/mol olarak belirlenmiştir. Bu prosedür uygulanırken, numune PBD izlerinin referansla aynı koşullar altında ölçüldüğünden emin olmak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra; tekrarlanabilir bir termodinamik parametre elde etmek için numunenin nasıl hazırlanacağı, cihazların nasıl hizalanacağı ve verilerin nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.