Hücresel Lipid damlacıklar İzolasyonu: Maya Hücreleri ve insan plasentası itibaren iki Arıtma Teknikleri

Bu prosedürün genel amacı, dokudan lipid damlacıklarını izole etmektir. Bu işlem, öncelikle plasenta dokusunun diseke edilmesi ve ayrıştırılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, olein hücreleri homojenize edilir.

Ardından organeller birkaç santrifüjleme adımıyla ayrıştırılır. Son olarak, lipid damlacıklarını içeren yüzen tabaka toplanır ve lipid damlacıkları karakterize edilir. Nihayetinde, lipid damlacığı fraksiyonunun saflığını göstermek için floresan mikroskobu ve western blot analizi kullanılır.

Bu tekniğin temel avantajı, çoğu aortik hücreden lipid damlacıklarının izole edilebilmesidir. Bazı dokularda, damlacık sayısının yüzen G tabakasını ve damlacık sayısını azaltacak düzeyde düşük olabileceği unutulmamalıdır. Plasentalar, miadında spontan doğum başlamadan önce elektif sezaryenle doğum yapan, tekiz gebeliği olan sağlıklı kadınlardan toplanmıştır; denekler, plasentalarının toplanması için yazılı onam vermişlerdir.

Plasentaların toplanması ve ardından kullanılması, Knoxville'deki Tennessee Üniversitesi ve Tennessee Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin onayıyla gerçekleştirilmiştir. Kurumsal inceleme kurulu biyolojik güvenlik kabini içinde, plasentayı steril otoklavlanabilir bir kaba aktarın ve steril salin kullanarak plasenta ve membranlardaki kanı dikkatlice yıkayın. Kanlı salini, sıvı biyolojik atık olarak bir litrelik bir behere boşaltın.

Plasentayı, göbek kordonunun bulunduğu düz yüzeyi yukarı bakacak şekilde steril bir alana yerleştirin; işlem için ince uçlu keskin makas ve pens kullanın. Göbek kordonunu ve fetal membranları çıkarın. Ardından, plasentayı maternal yüzeyi yukarı bakacak şekilde ters çevirin.

Ardından, yüzeyden yaklaşık üç milimetre derinlikteki üstte kalan bazal plaka dokusunu çıkarın. Koryonik plakaya dikkat ederek her seferinde bir COTA leadin diseke edin ve villöz dokuyu salin içeren 250 mililitrelik bir behere toplayın. Daha sonra, dokuyu ayrı bir beherde %0.9 steril salin ve pens kullanarak, bir litrelik beheri sıvı atıklar için kullanıp dairesel hareketlerle birkaç kez durulayın.

Her seferinde bir codi leadin'i 150 milimetrelik Petri kabına aktarın. Pensle tutun ve dokuyu damarlardan kazıyarak bir Petri kabına toplamak için jilet kullanın. Kazınan dokuyu, %0,9 steril salin içeren ayrı bir behere yerleştirin.

Tüm doku parçaları için işlemi tekrarlayın. Kazınmış dokuyu hücre ayrıştırma çözeltisi ile duruladıktan sonra, fazla sıvısını süzün ve plasenta dokusunu sindirmek için ağırlığını ölçün. Doku sindirim karışımını hazırladıktan sonra, toplam toplanan dokudan 60 gramı 500 mililitrelik steril bir Helen Meyer flaskına aktararak dokuyu bölün.

Doku sindirim karışımını dokunun bulunduğu erlene ekleyin ve bir çalkalayıcıda 37 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası ayrışmış hücreleri toplamak için 150 RPM hızında çalıştırın ve dokunun çökmesine izin vermek için erleni eğin. Süpernatantı toplayın.

UND disosiye olmamış doku toplanmamasına dikkat edin. Süpernatantı steril 15 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarmadan önce üzerine eşit miktarda HBSS ekleyin. 1000 ×g hızında santrifüj işleminin ardından, her bir parti için kalan UND ilişkili doku kısımlarıyla disosiyasyon ve süpernatant toplama işlemlerini tekrarlayın.

Dört derece Celsius'ta 15 dakika boyunca çöktürün ve pellete zarar vermeden süpernatanı aspire edin. Plasental villus hücreleri, ağırlıklı olarak eritrositlerin üzerindeki pelletin beyaz kısmında bulunur. Pelletin beyaz kısmındaki villus hücrelerini steril 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde muhafaza edin.

Üç sindirim aşamasının tümünden hücreleri topladıktan sonra, süspansiyonu filtrelemek için steril 50 milliliter'lik konik santrifüj tüpünün üst kısmına yerleştirilmiş 100 mikronluk naylon hücre süzgeci kullanın. Hücre süspansiyonunun filtrasyonu yavaşlarsa, tüp içinde vakum oluşturmak için filtreyi yukarı doğru kaldırın; ardından dört °C'de ve 1000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Plasental villus hücrelerini taze hazırlanmış hipotonik lizis ortamı veya HLM kullanarak biyolojik güvenlik kabininde homojen hale getirmek için, pelete zarar vermeden süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın ve hücrelere hücre peleti hacminin dört katı kadar buz gibi soğuk HLM ekleyin.

Hücreleri nazikçe ve tamamen resüspande etmek için 10 mililitre pipet kullanın. Hücreleri pipetle yukarı ve aşağı çekerek süspande edin. Hücreleri buz üzerinde 10 dakika inkübe ettikten sonra, buz gibi soğuk bir homogenizatöre aktarın ve gevşek oturan pistonu 20 ila 25 kez nazikçe hareket ettirerek hücreleri yavaşça homogenize edin.

Parçalanmamış hücreleri uzaklaştırmak için lizatı 3000 ×g'de ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, 25.000 ×g'de ve 4 °C'de 20 dakika boyunca tekrar santrifüjlemeden önce süpernatantı yeni bir tüpe toplayın. Ultrasantrifüjasyon ile lipid damlacıklarını izole etmek için mitokondrileri uzaklaştırmak amacıyla süpernatantı 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın.

%20 sükroz değerine ayarlayın ve bir S SW 28 rotoru veya eşdeğeri için ultrasantrifüj tüpünün altına aktarın; yoğunluğu ayarlanmış süpernatantın üzerine, tüpü doldurmak için yaklaşık 10 mililitre buz gibi soğuk, 100 milimolar sodyum karbonat tamponu ve 0,5 ila 1 mililitre buz gibi soğuk HLM ekleyin. S SW 28 salıncak kovalı rotor santrifüj kullanarak 130.000 ×g ve 4 °C'de 45 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından yüzen tabakayı toplayın, %10 sükroz değerine ayarlayın ve bir SW 41 TI rotoru veya eşdeğeri için 13,2 mililitrelik bir ultrasantrifüj tüpünün altına aktarın; yoğunluğu ayarlanmış süpernatantın üzerine, yaklaşık beş mililitre buz gibi soğuk, 100 milimolar sodyum karbonat tamponu ve 0,5 mililitre buz gibi soğuk HLM ekleyin. 274.000 ×g ve 4 °C'de 60 dakika süren santrifüj işleminin ardından, bir SW 41 TI rotoru içerisinde, lipid damlacıklarını içeren üst yüzen tabakayı dikkatlice toplamak için bir mililitrelik pipet kullanın.

Hacmi %10 sükroz ile ayarlayın ve beş mililitre buz gibi soğuk, 100 milimolar sodyum karbonat tamponu ve 0,5 mililitre buz gibi soğuk HLM ile üst katman oluşturmadan önce tekrar 13,2 mililitrelik bir ultrasentrifüj tüpüne aktarın. 30 dakikalık santrifüjden sonra, lipid damlacıklarını içeren üstteki beyaz renkli yüzen tabakayı, 100 mikrolitre HLM içeren üç adet 1,5 mililitrelik tüpe dikkatlice toplamak için eğik uçlu bir PE pipet kullanın. Lipid damlacıklarını, bu şekildeki figürde görüldüğü üzere metin protokolüne göre karakterize edin; insan term placental villus hücrelerinden izole edilen lipid damlacıklarının varlığı, nötr lipide özgü bir floresan boya olan boda P 4 93 5 0 3 ile boyama yapılarak doğrulanmış ve floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenmiştir.

Burada, izole edilen lipid damlacığı fraksiyonlarının saflığı; lipid damlacıkları için perilipin 2, ER için kalneksin, Golgi belirteci GM130, mitokondri ve plazma membranı için COX4 ve MEK1 gibi marker proteinlerin kullanıldığı western blotting ile değerlendirilmiştir. Soğuk aseton ile lipid damlacıkları çözüldükten sonra proteinler ekstrakte edilmiştir. Fraksiyonlar perilipin için Western blotting işlemine tabi tutulmuştur.

İkincisi, lipid damlacığı proteini, çekirdek sonrası süpernatanda ve lipid damlacıklarını içeren izole edilmiş beyaz yüzer tabakada tespit edilmiştir. MK one ve GM one 30 gibi plazma membranlarına özgü proteinler, spin dört ve spin beş için yüzer tabakanın altındaki hiçbir tabakanın lipid damlacığı fraksiyonlarında tespit edilmemiştir. Daha önce rapor edildiği üzere, calnexin proteini ve mitokondriyal membran proteini CO X four'un zayıf boyanması, lipid damlacığı fraksiyonunun başka bölgelerinde tespit edilmiştir.

Bu sonuçlar, lipid damlacıklarının memeli hücrelerinde mitokondrilerle ve ER ile etkileşime girdiğini gösteren önceki raporlarla tutarlıdır. Bu prosedürün ardından, damlacıklara hangi faktörlerin bağlı olduğu gibi ek soruları incelemek için proteomik ve lipidomik yöntemler gibi diğer yöntemler uygulanabilir.