Hücresel Lipid damlacıklar İzolasyonu: Maya Hücreleri ve insan plasentası itibaren iki Arıtma Teknikleri

Bu prosedürün genel amacı, lipid damlacıklarını dokudan izole etmektir. Bu, önce plasenta dokusunun diseksiyonu ve ayrılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, oleinin hücreleri homojenize edilir.

Daha sonra organeller birkaç santrifüjleme aşaması ile ayrılır. Son olarak, lipit damlacıklarını içeren yüzen tabaka toplanır ve lipit damlaları karakterize edilir. Sonuç olarak, lipit damlacık fraksiyonunun saflığını göstermek için floresan mikroskobu ve western kan analizi kullanılır.

Bu tekniğin temel avantajı, lipid damlacıklarını çoğu aort hücresinden izole etmenin mümkün olmasıdır. Bazı dokularda, damlacıkların sayısının, yüzen G tabakasını ve damlacık sayısını azaltan damlacıkların altında olabileceğini unutmayın. Plasentalar, spontan doğum eyleminin başlamasından önce elektif sezaryen doğum yapılan tekil gebeliği olan sağlıklı kadınlardan toplandı, denekler plasentalarının toplanması için yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler.

Plasentaların toplanması ve daha sonra kullanımı, Tennessee Üniversitesi ve Knoxville'deki Tennessee Üniversitesi Tıp Enstitüsü'nün onayı ile gerçekleştirildi. Biyolojik güvenlik başlığındaki kurumsal inceleme kurulu, plasentayı steril otoklavlanabilir bir kaba aktarın ve steril salin kullanarak plasenta ve zarlardaki kanı dikkatlice yıkayın. Kanlı tuzlu suyu bir litrelik beherde sıvı biyolojik atık olarak atın.

Plasentayı, göbek kordonunu keskin, ince uçlu makas ve forseps ile yukarı bakacak şekilde bu pürüzsüz yüzeye gelecek şekilde steril bir alana yerleştirin. Göbek kordonunu ve fetal zarları çıkarın. Ardından, plasentayı maternal yüzey yukarı bakacak şekilde ters çevirin.

Ardından, üstteki bazal plaka dokusunu yüzeyden yaklaşık üç milimetre çıkarın. Koryonik plakadan kaçınarak bir seferde bir COTA kurşununu inceleyin ve villöz dokuyu tuzlu su ile 250 mililitrelik bir behere toplayın. Daha sonra% 0.9 steril salin ve forseps kullanarak, sıvı atık için bir litrelik beher kullanarak döndürerek dokuyu ayrı bir beherde birkaç kez durulamak için kullanın.

Her seferinde bir kodi leadin'i 150 milimetre Petri kabına aktarın. Forseps ile tutun ve dokuyu damarlardan bir Petri kabına kazımak için bir tıraş bıçağı kullanın. Kazınmış dokuyu %0,9 steril salin içeren ayrı bir behere yerleştirin.

Tüm doku parçaları için tekrarlayın. Kazınan dokuyu hücre ayrışma cve'sinde duruladıktan sonra, plasenta dokusunu sindirmek için fazla sıvı ve ağırlığı boşaltın. Doku sindirim karışımını hazırladıktan sonra, toplam toplanan dokudan 60 gram aktaran dokuyu 500 mililitrelik steril bir Helen Meyer şişesine bölün.

Doku sindirim karışımını dokuyu içeren şişeye ekleyin ve 37 santigrat derecede bir çalkalayıcıda 45 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra ayrışan hücreleri toplamak için 150 RPM'de ve dokunun yerleşmesine izin vermek için şişeyi eğmek. Süper natin'i topla.

UND ile ilişkisiz doku toplamamaya özen göstererek. Steril 15 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarmadan önce süpernatana eşit miktarda HBSS ekleyin. 1000 kez santrifüjlemeyi takiben her parti için UND ile ilişkili dokunun kalan kısımları ile ayrışma ve süpernatant toplamayı tekrarlayın.

Dört santigrat derecede 15 dakika boyunca yerçekimi, peleti rahatsız etmeden süpernatanı aspire eder. Plasental villus hücreleri ağırlıklı olarak kırmızı kan hücrelerinin üzerinde yer alan peletin beyaz kısmında bulunur. Peletin beyaz kısmındaki villus hücrelerini steril 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde tutun.

Her üç sindirim aşamasından hücreleri topladıktan sonra, süspansiyonu filtrelemek için steril 50 mililitrelik konik santrifüj tüpünün üstüne yerleştirilmiş 100 mikronluk bir naylon hücre süzgeci kullanın. Hücre süspansiyonunun filtrasyonu yavaşlarsa, tüp santrifüjü içinde 10 dakika boyunca dört santigrat derece ve yerçekiminin 1000 katı sıcaklıkta bir vakum çekmek için filtreyi yukarı doğru kaldırın. Biyolojik bir güvenlik başlığında taze hazırlanmış hipotonik lizis ortamı veya HLM kullanarak plasental villus hücrelerini homojenize etmek için peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın, hücrelere buz gibi soğuk HLM'nin hücre pelet hacminin dört katını ekleyin.

Nazikçe ve iyice canlandırmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek askıya alın. Hücreleri buz üzerinde 10 dakika inkübe ettikten sonra, buz gibi bir homojenizatöre aktarın ve 20 ila 25 hafif vuruş uygulayarak hücreleri gevşek oturan havan tokmağı ile yavaşça homojenize edin.

Kırılmamış hücreleri çıkarmak için lizatı 3000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede 10 dakika döndürün. Daha sonra, 20 dakika boyunca 25.000 kat yerçekimi ve dört santigrat derecede tekrar dönmeden önce süpernatanı yeni bir tüpe toplayın. Lipid damlacıklarını ultrasantrifüjleme ile izole etmek için mitokondriyi çıkarmak için, süper natini 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın.

% 20 sükroza ayarlayın ve% 20 sükroza ayarlayın ve bir S SW 28 rotoru veya eşdeğeri için bir ultrasantrifüj tüpünün dibine aktarın, yoğunluğu ayarlanmış süper natini yaklaşık 10 mililitre buz gibi, 100 milimolar sodyum karbonat tamponu ve 0.5 ila bir mililitre buz gibi soğuk HLM ile kaplayın 130'da bir S SW 28 sallanan kova rotor santrifüjü kullanarak tüpü doldurmak için, 000 dakika boyunca 45 kez yerçekimi ve dört santigrat derece. Daha sonra yüzen tabakayı toplayın,% 10 sakaroza ayarlayın ve% 13.2 mililitrelik bir ultrasantrifüj tüpünün dibine aktarın bir SW 41 TI rotor veya eşdeğeri için yoğunluk ayarlı süpernatantı yaklaşık beş mililitre buz soğuk, 100 milimolar sodyum karbonat tamponu ve 0.5 mililitre buz gibi soğuk HLM ile kaplayın 274'te santrifüjlemeyi takiben, 000 dakika boyunca 60 kez yerçekimi ve dört santigrat derece. Bir SW 41 TI rotorunda, lipid damlacıkları içeren üst yüzer tabakayı dikkatlice toplamak için bir mililitrelik bir pipet kullanın.

Hacmi %10 sükroza ayarlayın ve beş mililitre buz gibi, 100 milimolar sodyum karbonat tamponu ve 0,5 mililitre buz gibi HLM ile kaplamadan önce tekrar 13,2 mililitrelik bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın. 30 dakika boyunca santrifüjlemeden sonra, lipit damlacıklarını içeren üst beyaz renkli yüzer tabakayı 100 mikrolitre HLM içeren üç adet 1,5 mililitrelik tüpe dikkatlice toplamak için bükülmüş bir PE pipet kullanın. Lipid damlacıklarını metin protokolüne göre karakterize edin Bu şekilde görüldüğü gibi, insan term plasental villus hücrelerinden izole edilen lipid damlacıklarının varlığı, nötr lipid spesifik floresan boya boda P 4 93 5 0 3 ile boyanarak doğrulandı ve floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirildi.

Burada gösterilen, izole edilmiş lipid damlacık fraksiyonlarının saflığı, er için para lippin iki calnexin, goi markörü, mitokondri ve plazma membranı için GM bir 30 CO X dört, MEK bir içeren lipid damlacıkları için marker proteinlerle western blotlama ile değerlendirildi. Harap olduktan sonra, soğuk asetonlu lipit damlacıkları ve ekstrakte edilen proteinler. Fraksiyonlar Western blotting para lipin'e tabi tutuldu.

İkincisi, lipid damlacık proteini, nükleer sonrası süpernatantta ve lipid damlacıkları içeren izole beyaz yüzen tabakada tespit edildi. MK one ve GM one 30 gibi plazma zarlarına özgü proteinler, spin four ve spin five için yüzen tabakanın altındaki her iki tabakadaki lipid damlacık fraksiyonlarında tespit edilmedi. Daha önce bildirildiği gibi, protein kalneksini ve mitokondriyal membran proteini CO X dört'ün zayıf bir boyanması, lipid damlacık fraksiyonunun başka bir yerinde tespit edilmiştir.

Bu sonuçlar, lipid damlacıklarının memeli hücrelerinde mitokondri ve ER r ile etkileşime girdiğini gösteren önceki raporlarla tutarlıdır. Bu prosedürü takiben, damlacıklara hangi faktörlerin bağlı olduğu gibi ek soruları incelemek için proteomik ve lipidomik yöntemler gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.