Biyobozunur Polimer Parçacıklarının Lenf İçi Düğüm Enjeksiyonu

Bu prosedürün genel amacı, biyomateryal aşı parçacıklarını doğrudan bir enjeksiyon tekniği kullanarak lenf düğümlerine bırakmaktır. İlk olarak, lipid stabilize edilmiş polimer parçacıklarını bir çift emülsiyon yöntemi kullanarak sentezleyin. Daha sonra parçacıkları yıkayın ve boyut, kargo, yükleme veya stabilite gibi malzeme özelliklerini ölçün.

Daha sonra, boyanın lenf noduna drenajından sonra görselleştirmeye izin vermek için farenin kuyruk tabanına bir izleyici boya uygulayın. Son adım, D işaretli lenf düğümünü tanımlamak ve bu konuma küçük bir hacimde polimer partikülü enjekte etmektir. Histoloji, immünofloresan ve konfokal mikroskopi, kasık lenf düğümlerindeki partiküllerin varlığını ve dağılımını doğrulamak için kullanılabilir.

Lenf nodlarının doğrudan enjeksiyonunun aşılama için biyomalzemelerle birleştirilmesi, lenf nodu mikro ortamındaki aşı bileşenlerinin kombinasyonları ve dozları üzerinde sıkı kontrol sağlar ve bu dokularda yükün kontrollü bir şekilde serbest bırakılmasına izin verir. Tüm aşıların etkili olabilmesi için lenf bezlerine ulaşması gerekir. Bu nedenle, biyomateryallerin ve dahil edilmiş bağışıklık ipuçlarının lokal lenf nodu sinyallerini nasıl etkilediğini tanımlamak, bu olayları sistemik bağışıklık tepkisine bağlamak için önemlidir.

Bu bilgi, biyomateryal aşıların geleneksel yollar boyunca nasıl uygulandığını daha iyi anlamamıza yardımcı olacaktır. Biyomalzemelerin intra lenf nodu iletimi, biyomateryallerin lenf nodlarının organizasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için bir araç olarak hizmet etse de, bu platform aynı zamanda kanser ve otoimmün bozukluklara yönelik yeni terapötik aşılar ve immünoterapiler geliştirmek için uygulamalı bir fırsat sunmaktadır. Mikropartiküller sonikat için, 12 watt'ta buz üzerinde polimer lipid ve diğer suda çözünmeyen kargoyu içeren organik faz.

Su ve yağ emülsiyonunu oluşturmak için, bir miligram peptit proteini veya başka bir suda çözünür kargo içeren 500 mikrolitre damıtılmış H2O veya H2O ekleyin. 30 saniye boyunca zina etmeye devam edin. Tam emülsifikasyonu sağlamak için şişeyi ator ucunun etrafında yan yana hafifçe yukarı ve aşağı sallayın.

Şimdi su yağı emülsiyonunu 16.000 RPM'de üç dakika homojenize edilmiş 40 mililitre H2O'ya dökerek su ve yağ içinde su emülsiyonunu hazırlayın. Daha sonra, manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin ve gece boyunca çözücüyü çıkardıktan sonra fazla çözücüyü çıkarmak için su ve yağı gece boyunca su emülsiyonunda karıştırın. Emülsiyonu 40 mikronluk bir naylon örgü hücre süzgecinden beş dakika boyunca 50 mililitrelik bir konik tüp santrifüjüne dökün, süpernatanı boşaltın, partikül peletini bir mililitre suda yeniden süspanse edin ve asılı partikülleri 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Parçacıkları beş dakikalık bir santrifüjleme ile toplayın. Parçacık boyutunu lazer kırınımı veya ışık saçılımı ile ölçün. Fraksiyon hücresine eklenen su hacmi, fraksiyon hücresine 10 mikrolitre partikül süspansiyonunun hizalanması ve boşaltılması için yeterli seviyededir.

Partikül boyutu analizörü bölmesinin kapısını kapatın. Ardından PLGA için partikül boyutunu ölçün. 1.60'lık bir kırılma indisi kullanın.

Enjeksiyondan bir gün önce bir sayı temeli kullanarak partikül çapını hesaplamak için yazılım arayüzünü kullanın. Fareyi iacuc onaylı bir hayvan protokolüne göre uyuşturun. Anestezi derinliğini bir ayak parmağı ile değerlendirin.

Dakikada 100 ila 120 nefes arasında bir solunum hızı sağlamak için refleks testlerini sıkıştırın ve solunumu izleyin. Kuyruğun dibindeki ve arka kısımdaki saçları tıraş edin. Tüyleri hayvanın ventral tarafından çıkarın ve arka bacağın ekleminin hemen üzerindeki sırt tarafına lateral olarak alın.

Her boya enjeksiyonu için, 10 mikrolitre boya solüsyonunu bir mikro merkezli füge tüpüne aktarmak için bir mikro pipet kullanın ve 10 mikrolitrenin tamamını 31 gauge iğneden bir mililitrelik insülin şırıngasına aspire edin. Şimdi, enjeksiyonlar arasında yükleme yapmak için kuyruk tabanının her iki tarafına deri altına 10 mikrolitre boya çözeltisi enjekte edin. Kalan tüyleri almak için hafif bir tüy dökücü krem uygulayın.

Arka bacak ile karın arasındaki alanı kapladığınızdan emin olun. Üç dakika sonra, ılık H two oh ile ıslak eldivenli bir el kullanın ve tüy dökücü kremi cilde nazikçe sürün. Fazla tüy dökücüyü çıkarmak için hemen tekrarlayın.

Ardından, yumuşak bir bezi veya kağıt havluyu ılık suyla ıslatın ve tek bir hareketle farenin alt kısmını silin. Kurtarmak için fareyi bir ısı lambasının altına yerleştirin ve ardından en az 12 saat bekletmeye geri dönün. Her bir kasık lenf noduna iz veya boya drenajını doğrulamak için anestezi uygulanmış fareyi inceleyin.

Lenf nodu, arka uyluk ve karın yakınında karanlık bir nokta olarak görünmelidir. Şimdi reçine, partikülleri her enjeksiyon için istenen enjeksiyon konsantrasyonunda damıtılmış su içinde yeniden süspanse eder. 10 mikrolitre partikül çözeltisini bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için bir mikro pipet kullanın.

10 mikrolitrenin tamamını bir mililitrelik bir şırıngaya bağlı 31 gauge insülin iğnesine aspire edin. İğne ile boyalı lenf bezinin etrafından cildi gergin bir şekilde cilde 90 derecelik bir açıyla çekin. Cilde bir milimetre derinliğe kadar nüfuz edin.

Görünür lenf nodu büyümesi için tüm hacim monitörünü yavaşça enjekte edin. Farenin bir ısı lambası altında iyileşmesine izin verin ve ardından tutmaya geri dönün veya ek testler yapın. İlk olarak, parçacık sentezini ve boyut dağılımını onaylayın.

Emülsiyon çözücü buharlaştırma sentez protokolü, nihai emülsiyonların görsel muayenesi ile kalitatif olarak değerlendirilebilir. Oluşturulan. Emülsiyonlar, görünür agregalardan arındırılmış homojen bir süspansiyon olmalıdır. Parça parçacık boyutu dağılımı, lazer kırınımı veya dinamik ışık saçılımı ile doğrulanabilir, parçacık numuneleri mono modal bir dağılım göstermelidir.

Partikül sentezinin daha fazla kalitatif değerlendirmesi, protokolün bir floresan peptit veya lipofilik boya gibi bir veya daha fazla floresan kargoyu içerecek şekilde modifikasyonu yoluyla elde edilebilir. Boya, partikül enjeksiyonu için lenf düğümünü bulmak ve hedeflemek için kullanılabilir Eğitim sırasında, lenf nodu konumlarına aşinalık kazanmak için farelere boya enjeksiyonunu takiben ötenazi ve nekropsi yapılabilir. Enfekte lenf nodunun t ve b hücre bölgeleri içindeki partikül dağılımı, kesitli ve lekeli lenf nodlarının konfokal mikroskobu ile doğrulanır.

Floresan mikroskobu ile enjeksiyon ve görüntülemeyi takiben lenf düğümlerinde boyut gibi partikül özelliklerindeki farklılıklar görülebilir Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik iki günlük bir süre içinde tamamlanabilir. Partikül sentezi ve hayvan hazırlığı ilk gün gerçekleşir. İkinci gün partikül yıkama karakterizasyonu ve lenf içi nod enjeksiyonu yapılır.

Bu videoyu izledikten sonra, farelerin kasık lenf düğümlerini görselleştirmek ve enjekte etmek için bir iz veya boyanın nasıl kullanılabileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, biyomateryal aşı taşıyıcılarının daha önce mümkün olmayan kontrol seviyesi ile doğrudan lenf noduna cerrahi olmayan bir şekilde verilmesini sağlar. Biyomalzemelerin doğrudan lenf nodu verilmesi, bilim insanlarının ve mühendislerin ve immünoloji ve aşı geliştirmenin, biyomalzemelerin, aşıların ve bağışıklık sinyallerinin lenf nodu ile temel etkileşimlerini keşfetmesine olanak tanıyacak ve bu materyallerin bağışıklığı uyarma ve şekillendirme mekanizmalarına yeni bir ışık tutacaktır.