Kemirgen neuroblasts nucleofection Neuroblast Göç Eğitim için In vitro

Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki çok önemli bir adımdır. Protokol Burada açıklanan DNA / küçük firkete RNA (ShRNA) nucleofection ve kemirgen doğum sonrası rostral göçmen akımından izole nöroblast ile 3D göç deneyi kullanılarak neuroblast göç aday düzenleyicilerinin rolünü araştırmak için kullanılabilir.

Bu prosedürün genel amacı, hedef proteinlerin göçleri üzerindeki etkisini incelemek için primer kemirgen postnatal nöroblastını transfekte etmektir. Bu, ilk olarak kemirgen poplarının rostral göç akışından nöroblastın diseksiyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım, onları ayırmak ve DNA veya S-H-R-N-A ile çekirdek sevgisi ile transfekte etmektir.

Daha sonra, nöroblast asılı damlalar halinde yeniden toplanır ve daha sonra uygun bir süre süspansiyon halinde kültürlenir. Son adım, yeniden toplanmış nöroblast kümelerini üç boyutlu bir matrise gömmek ve onları göçe bırakmaktır. Sonuç olarak, nöroblast göçünü analiz etmek için immünofloresan veya hızlandırılmış görüntüleme mikroskobu kullanılır.

Bu yöntem, doğum sonrası beyinde kök hücre kaynaklı nöroblast göçünün kontrolü gibi nörojenez alanındaki önemli bir sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, zorlu ve zaman alıcı olabilen viral vektörlerin kullanımına kıyasla nispeten kolay ve hızlı olmasıdır. Bir P altı ila P yedi sıçan kumu feda ettikten sonra, her sıçan üzerinde bir neşter bıçağı ile burundan serebelluma kadar orta sagital sütür boyunca deride bir posterior kesi yapın.

Sonra, cildi soyun. Aynı kesiyi kafatası boyunca tekrarlayın. Daha sonra kraniyal flepleri forseps ile nazikçe çıkarın ve beyni koku ampulleri ile birlikte bir spatula ile dikkatlice çıkarın.

Bundan sonra, beynin en küçük üçte birini kesin ve atın. Daha sonra, beyin dokusunu bir doku kıyıcı kullanarak 1.4 milimetre kalınlığında koronal dilimler halinde doğrayın. Dilimleri soğuk diseksiyon ortamı içeren bir kaba aktarın.

Daha sonra dilimleri diseksiyon mikroskobu altında görüntüleyin. Bir iğne kullanarak dikkatlice ayırın. Rostral göç akımı, OB bölümlerinin merkezinde üçgen yarı saydam bir alan ve küçük dairesel bir alan olarak görünür.

Daha fazla beyin diliminde, çevredeki dokuyu dahil etmekten kaçınmaya özen göstererek her dilimden RMS'yi bir mikrocerrahi bıçakla kesin. Daha sonra, RMS parçalarını plastik bir macun pipeti ile toplayın ve buz üzerinde soğuk diseksiyon ortamı içeren küçük bir tabağa koyun. Ardından, RMS parçalarını yemeğin ortasında toplamak için tabağı yavaşça döndürün.

Parçaları plastik bir pipetle toplayın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Parçaları tüpün dibine yerleşmeye bırakın. Diseksiyon ortamını iki mililitre ayrışma ortamı T tri ile değiştirin.

Daha sonra bir P 1000 pipeti kullanarak parça süspansiyonunu yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek RMS parçalarını derecelendirin. Doku parçalarıyla birlikte tüpü iki dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosunda bırakın. Daha sonra, çözeltiyi 10 kez tekrar pipetleyin ve parçaların ayrıştığından emin olun.

Daha sonra beş mililitre önceden kurtlanmış DMEM ve% 10 FCS ekleyerek tripsini etkisiz hale getirin ve hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 433 kez G'de santrifüjleyin. Fazla ortamı çıkarın ve resüsleyin. Hücre peletini bir mililitre ön ısıtma DMEM artı %10 FCS içinde hafifçe pipetleyerek askıya alın ve ardından aynı ortamdan dört mililitre daha ekleyin.

Ardından bir hücre sayımı gerçekleştirin. En iyi sonuçlar elde edilirken her bir nükleo sevgisi için en az 2,5 kez 10 ila altıncı hücre gereklidir. Çekirdek başına üç ila dört kez 10 ila altı hücre sevgisi kullanarak.

Hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 433 kez G'de santrifüjleyin. Bundan sonra, bu prosedürde mümkün olduğunca fazla ortam çıkarın. Hemen Resus, daha önce inkübe edilmiş sıçan nöron nükleo sevgi çözeltisinde hücre peletini askıya alın.

Oda sıcaklığında, 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu SI, R-N-A-D-N-A içeren her bir EOR tüpüne aktarın. Daha sonra bir P 200 pipeti ile iki ila üç kez pipetleyerek nazikçe karıştırın. Ardından, herhangi bir kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek numuneyi çekirdek sevgi kutusunun altına ekleyin.

Çekirdek sevgisi için, sıçan hücreleri için G tire 0 1 3 veya fare hücreleri için O tire 0 0 5 programını kullanın. Bundan sonra, çekirdekten etkilenen numuneye hızlı bir şekilde bir mililitre savaş öncesi DMEM artı %10 FCS ekleyin. Numuneyi, çekirdek sevgi kiti tarafından sağlanan plastik pipeti kullanarak beş mililitre savaş öncesi DMEM artı %15 FCS içeren 10 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Daha sonra numuneyi beş dakika boyunca 433 kez G'de santrifüjleyin. Tüm fazla ortamı dikkatlice çıkarın ve peleti bir P 20 pipet kullanarak 25 ila 30 mikrolitre savaş öncesi DMEM artı %10 FCS içinde yeniden süspanse edin. 30 mikrolitreden fazla ortam kullanmayın.

Daha sonra, süspansiyonu bir P 35 bulaşık kapağının iç tarafına damla olarak pipetleyin. Ardından, iki mililitre tam ortam içeren P 35 tabağının kapağını ters çevirin. En az beş saat% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübatörde bırakın.

Beş saat sonra, asılı damlaları kapaktan tabaktaki tam ortama aktarın. Kesik uçlu bir P 1000 pipet kullanarak. Daha sonra numuneleri DNA NU nükleer enfeksiyonları için 24 saat veya SI A HRA çekirdek etkileri için 48 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.

Şimdi 25 mililitre tam ortam hazırlayın ve birkaç saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede ön dengeleyin. Bu arada, bazal membran matrisinin donmuş alikotlarını eksi 80 derece dondurucudan çıkarın ve soğuk odada buz üzerinde çözdürün. Her çekirdek sevgisi için, sekiz adede kadar 13 milimetre steril örtü fişi içeren altı santimetrelik bir tabak hazırlayın.

Bulaşıkları streç filmle kaplı bir buzluğun üzerine yerleştirin. Nemi korumak için, diz gömülü oblast içeren üç adede kadar altı santimetrelik tabağı tutmak için kullanılacak 15 santimetrelik bir tabağın içine bir nemli doku şeridi yerleştirin. Daha sonra, tüm ortamı bir ila üç oranında haw matrisine ekleyin, yeniden toplanmış hücre kümelerini 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 433 kez G santrifüjleyin.

Bundan sonra, fazla ortamı çıkarın ve paleti 10 mikrolitre tam ortamda yeniden askıya alın. Ardından, her bir steril örtü kızağına iki mikrolitre hücre agrega süspansiyonu yerleştirin. 18 mikrolitre matris tam orta karışımı ekleyin ve matrisi tüm kapağa yaymak için pipet ucunu kullanın.

Kapak fişlerini içeren altı santimetrelik tabağı 15 santimetrelik tabağa yerleştirdikten hemen sonra kaydırın. Çanağı 15 ila 20 dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübatöre aktarın. Matris katılaştıktan sonra, her altı santimetrelik tabağa nazikçe beş mililitre tam ortam ekleyin ve yüzen örtü fişlerini pipet ucuyla aşağı doğru itin, ardından nöroblastın hücre agregatlarından dışarı çıkmasına izin vermek için% 5 karbojen ile 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin.

Bu şekilde, izole edilmiş sıçan RMS hücrelerinin, göçmen nöroblast belirteçleri DCX ve beta üç tübülin için immün pozitif olduğu gösterilmiştir. Ve bu şekil, göç eden nöroblast belirteçleri DCX ve PSA NCA'nın fareden göç eden hücrelerde ifade edildiğini göstermektedir. Fare Neuroblast Nu nükleer sevgisi için RMS Explan, ayrışmış fare RMS Neuroblast, GFP ile yeniden birleştirilmiş, üç boyutlu bir matrise gömülü olarak çekirdekten etkilendi ve altı saat boyunca göç etmesine izin verildi.

Yeniden toplanmış bir hücre kümesinden göç eden nöroblast, yüksek transfeksiyon verimliliği gösterir. Burada, sıçan nöroblastı, GFP'yi kodlayan iki farklı plazmid ile etkilenmiş, matrise gömülü olarak yeniden toplanmış ve 24 saat boyunca göç etmeye bırakılmıştır. Hücreler daha sonra fikse edildi ve göç mesafesini ölçmek için GFP ve beta üç tübülin için immün boyalandı.

Toplanan hücre kümesi altı eşit sektöre bölünür ve her sektör için kümenin kenarı ile en uzak göç eden hücre arasındaki mesafe ölçülür. Bu şekil, GFP pozitif NUCLE'den etkilenen hücreler tarafından taşınan nispi mesafenin nicelleştirilmesini ve nöroblast göçünü izlemek için GFP negatif çekirdekten etkilenmeyen hücrelerin kontrol edilmesini göstermektedir. S-H-R-N-A Çekirdek sevgisinden sonra, sıçan nöroblastı, bir kontrol S-H-R-N-A vektörü veya bir HRNA hedef tutturma ve aktin demetleme protein hücreleri içeren aynı vektör ile etkilendi, 48 saat boyunca yeniden toplandı, matrise gömüldü ve 24 saat boyunca göç etmeye bırakıldı.

Agregalar daha sonra fikse edildi ve GFP ve beta üç tübülin için immün boyama yapıldı. Western Blood Analysis ile S-H-R-N-A çekirdek etkileniminden 50 saat sonra etkili fasten tükenmesi tespit edilebilir ve Acton burada bir yükleme kontrolü olarak gösterilmiştir. İşte göreceli göç mesafesinin kantitatif analizi, hızlı tükenmenin nöroblast göçünü önemli ölçüde bozduğunu göstermektedir.

Bu prosedürü takiben, NU Nuclear Affection migrasyon testi ile elde edilen sonuçları in vivo olarak doğrulamak için doğum sonrası elektroporasyon gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.