Multi-spektral Görüntüleme Sitometrisi ile Enucleating Olaylar bir Kemirgen erythroblast ICSI'nin Zenginleştir tanımlanması

Bu prosedürün genel amacı, bir aurn Erythroblast alt popülasyonu ile enükleasyon olaylarının tanımlanmasını kolaylaştırmaktır. İlk adım, çekirdeklenme olayları açısından zenginleştirilmiş bir popülasyon yaratmaktır. Bu, stresli olmayan bir farenin femurlarından, tibialarından ve pelvik kemiklerinden izole edilen düşük yoğunluklu kemik iliği hücrelerinden başlayarak uzun süreli in vitro eritropoez kültürü veya kısa süreli kültür ile gerçekleştirilir.

Stres eritropoezini monte etmek için daha önce flebotomiye tabi tutulmuş bir farenin dalağından alınan plesitlerle başlayarak. Kültürün son adımındaki kültürlenmiş hücreler sabitlenir, nüfuz ettirilir ve ilgilenilen floresan belirteçlerle boyanır. Bu hücreler bir görüntüleme akış sitometresi üzerinde çalıştırılır ve daha sonra çekirdek hücre popülasyonunda enükleasyona uğrayan hücreleri tanımlamak için analiz edilir, enükleasyon sürecini düzenleyen ve aracılık eden sinyalizasyon ve hücre iskeleti bileşenleri tanımlanabilir.

Bu tekniğin floresan mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, önemli ölçüde daha fazla sayıda çekirdekli hücrenin kısa sürede gözlemlenebilmesi ve analiz edilebilmesidir. Bu yöntem, eritrop çekirdeklenmesinde hangi moleküler mekanizmaların yer aldığı gibi eritropoez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Eritroid hücreleri düşük yoğunluklu kemik iliği hücrelerinden ayırt etmek için, steril akışlı bir sitometri tüpüne bir mililitre kültür ortamı ekleyerek başlayın.

Daha sonra bir tüberkülin şırıngasına 25 gauge x sekizde beş inçlik bir iğne takın ve taze kültür ortamını hasat edilen femurlar ve tibiadan birkaç kez akış sitometri tüpüne nazikçe akıtın. Hücre süspansiyon hacmini IMDM ile beş mililitreye ayarladıktan sonra, 15 mililitrelik bir tüpte mililitre yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı başına beş mililitre 1.083 gram üzerine dikkatlice katmanlayın. Her şeyi iki mililitre işaretine kadar 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve toplanan buffy ceketi taze kültür ortamı ile yıkayın, kırmızı kan hücrelerini üç mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda oda sıcaklığında beş dakika boyunca bitleyin, hücreleri kültür ortamında yıkadıktan sonra ve peleti aynı plakada tekrar askıya alın, altı kuyulu bir hücre kültürü plakasındaki hücreler, kuyu başına beşinci hücrelerin 10'da biri olan bir konsantrasyonda, büyüme ortamında 2.5 mililitrelik bir nihai hacme kadar ve kültürü kapladıktan beş gün sonra hücreleri 37 santigrat derecede inkübe eder.

Orijinal kültür plakasının her bir oyuğundaki eritroblastların sayısını sayın ve ardından her bir oyuğu karşılık gelen 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Hücreleri döndürdükten sonra, süpernatanları aspire edin ve peletleri sadece eritropoietin içeren taze büyüme ortamında, mililitre başına beşinci hücrelerin 10'unun iki katı konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin. Daha sonra süpernatanı beş hücreli bir MS plakasından aspire edin ve eritroid hücrelerini kuyucuklara ekleyin.

İki gün sonra, süpernatanı düşük yoğunluklu PLE sititlerinden sitokinler ve eritroblastlar içermeyen taze büyüme ortamı ile değiştirin. Dalağı 40 mikronluk bir süzgeçten 50 mililitrelik bir tüpe yumuşatmak için pistonu beş mililitrelik bir şırıngadan kullanın. Hücre süzgecini büyüme ortamı ile yıkayın ve hücre süspansiyonunun son hacmini beş mililitreye ayarlayın.

Daha sonra hücre katmanlarını az önce gösterildiği gibi yoğunluk gradyanına göre ayırdıktan sonra, kırmızı kan hücrelerini bitleyin ve sitleri yedi mililitre kültür ortamında yıkayın. Daha sonra Resus, peleti sitokinlerle takviye edilmiş büyüme ortamında askıya alır ve hücreleri, gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasının oyuğu başına bir mililitrelik bir nihai hacimde bir ila beş kez 10 ila altı hücrede inkübe eder. Ertesi gün.

Hücreleri, daha önce tarif edildiği gibi yapışmış MS beş hücresi içeren kuyucuklara aktarın ve altı ila sekiz saat sonra analiz edin, eritroblastları kültür kuyucuklarından toplayın ve bunları PBS Resus'ta 500 mikrolitre% 3.7 formaldehit içinde sabitleyin, peleti nazik pipetleme ile süspanse edin. 15 dakika sonra, hücreleri bir mikro santrifüjde 20 saniye boyunca 2000 GS'de döndürün, süpernatanı aspire edin ve peleti 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri mikro santrifüjde döndürdükten sonra, süpernatanı tekrar aspire edin ve hücreleri en az 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.

Eksi 20 santigrat derece koyun, aseton çözeltilerini buz üzerinde saklayın. Daha sonra, faks tamponu yıkamasından sonra belirtildiği gibi bir dizi aseton yıkamasında hücreleri hızlı bir şekilde yeniden askıya alın ve döndürün, hücre peletlerini oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 100 mikrolitre uygun antikor kokteyli içinde inkübe edin. Daha sonra, hücreleri tekrar faks tamponunda yıkadıktan sonra, sürekli peletleri drac beş içeren 60 mikrolitre faks tamponunda yeniden askıya alın ve numuneleri, deney numunesi başına en az 10.000 olay toplayan bir görüntüleme akış sitometresinde çalıştırın.

Ardından, hücreleri parlak alan en boy oranlarına, küçük eksenlerinin uzunluğunun ana eksene oranına ve boyutlarının göstergesi olan parlak alan alanlarına göre seçerek analize başlayın. Parlak alan alanı değeri 20'den düşük ve 200'den yüksek olan olaylar çoğunlukla sırasıyla enkaz ve hücre agregalarıdır ve analizden çıkarılır. Ardından, görüntünün keskinliğini gösteren gradyan RMS parametresi için değerlerine göre tek hücreleri analiz edin, odakta iyi çekilen görüntüleri seçmek için gradyan RMS değeri 50. yüzdebirlik dilimden büyük hücreleri içeren ikinci bir kapı oluşturun.

Bir sonraki kapı, parlak alan alanları ile ölçülen boyutlarına ve TER one 19 floresan leke ile ölçülen eritroid markörü TER one 19 için pozitifliklerine dayalı hücreler, TER one 19 için çok düşük veya çok yüksek piksel parametre hücreleri ortalama ya eritroid olmayan ya da kalan hücre agregatlarıdır ve bir sonraki adımda analizden çıkarılır. Hücreler, DR beş en boy oranı yoğunluğuna, çekirdeğinin minör eksenine karşı ana eksenine oranına ve d dr beş ifadelerinin yoğunluğuna göre seçilir. DR beş negatif hücre, çoğunlukla retikülositler ve kırmızı kan hücreleri gibi enükleasyonlu hücreler ve düşük sürükleme beş en boy oranına sahip hücreler.

Çoğunlukla çiftler analiz yürüyüşünden çıkarılır. Bu noktada çoğunlukla eritroblastlar olan beş pozitif DNA pozitif hücreyi sürükleyin. Bu eritroblastlar daha sonra hücrenin boyutunu gösteren TER bir 19 alanına ve TER bir 19 ortalama piksel alanına veya TER bir 19 boyamalarının parlaklığını gösteren TER bir 19 ifadesinin yoğunluğuna göre analiz edilir.

Orto kromatik eritroblastlar, küçük TER bir 19 yüksek hücre olarak tanınır. Son olarak, ortokromatik eritroblastların bir alt popülasyonu, düşük parlak alan en-boy oranları ve yüksek delta sentu XY TUR one 19 ile karakterize edilir. DR beş, yeni başlayan TUR bir 19 pozitif retikülositin merkezi ile DR beş pozitif çekirdeğin merkezi arasındaki mesafe ile tanımlandığı gibi, ona karşı antikor, bir 19 ve DNA boyası DRAAK beş.

Hücreler tipik olarak eritroblast ve çekirdeklenme sırasında f aktinin lokalizasyonunu tanımlamak için boyanır. Dikkat çekici bir şekilde, enükleasyonun ilerlemesi, azalan bir en boy oranına sahip hücreler olarak görselleştirilebilir. Yani, giderek uzayan hücreler ve artan bir delta ile OID, xy, TUR, bir, 19, sürükleme, beş gözlenir.

F aktin, çekirdeklenme sırasında bölünme oluğunda yoğunlaşır ve daha sonra çekirdek ekstrüde edildiğinde dağılır. İlgilenilen diğer proteinler ve yapılar da enükleasyon sırasında rollerinin görüntülenmesine izin vermek için uygun antikorlar veya floresan belirteçler ile boyanabilir. Örneğin, polarize mikrotübül oluşumu, bir çekirdeklenmeden önce vahşi tip orto kromatik eritroblastlarda görselleştirilebilir, ancak kolşisin ile muamele edilen eritroblastlarda görselleştirilemez.

Tubulin polimerizasyonunun kolşisin tarafından inhibisyonu, Brightfield kanalında görülen hücre gövdesinin merkezi ile DR beş ile elde edilen nükleer boyamanın merkezi arasındaki delta OID XYB FDR beş parametresinin ölçülmesiyle gösterildiği gibi hücre polarizasyonunu azaltır. Bu prosedürü takiben, Eritroplast adalarında gözlemlenenler gibi eritropoezde yer alan farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimlerle ilgili soruları yanıtlamak için floresan mikroskobu gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, eritroblastla zenginleştirilmiş bir popülasyonda enükleasyon olaylarının nasıl görselleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.