Etçil Bitki Nepenthes'in Dokusundan Canlı Çok Hücreli Bezlerin İzolasyonu

Sunulan yöntemin kapsamı, moleküler analizler için taze bitki dokusundan tekil ve saf bezler elde etmektir. Bu işlem, öncelikle nepenthe bitkisinden bir ibrik yaprağın hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından doku, tazeliğini korumak amacıyla buz üzerinde bir mikro örnekleme platformuna doğrudan sabitlenir.

Mikro örnekleme prosedürü sırasında, bezler hassas bir şekilde izole edilir ve toplanan materyal üzerinde kantitatif PCR analizi gerçekleştirilmeden önce PCR tüpüne aktarılır. Nihayetinde, ileri moleküler analizler için spesifik dokuları hızlı ve mikro-invaziv bir şekilde sağlamak amacıyla, etobur bitkilerden tekil ve saf bezler elde etmek için mekanik mikro örnekleme teknolojisi kullanılır. Etobur bitkiler, hayvan proteinlerini sindirebildikleri için flora arasında uzmanlaşmış türlerdir.

Bunun moleküler düzeyde nasıl çalıştığına dair bilgilerimiz hâlâ sınırlıdır. Bu soruyu ele almak için uygun bir model, belirgin organları ve sindirim süreçlerine katkıda bulunan bezler üreten yapıları olduğu için genius apandiksle ilgili resim karışımıdır. Apandikste.

Bu bezler alt kısımdaki resimlerin içinde yer almaktadır. Moleküler analiz için, yaklaşık 100 ile 200 mikrometre çapındaki bu geniş ve yassı yapıların doğrudan taze dokudan izole edilmesi gereklidir. İşlemi daha da zorlaştıran nokta ise, bezlerin koruyucu bir kapakla örtülü olmasıdır.

Örnekleme sırasında üç boyutlu gözlemler gerektiren carport benzeri bir yapıya ve üç boyutta hassas bir şekilde hareket edebilen bir araca ihtiyaç duyulmuştur. Mevcut mikro diseksiyon tekniklerinin sorunlarımızı çözmek için tasarlanmadığını öğrendik. Örneğin bir lazer, bitki dokusunun yüksek su içeriği nedeniyle başarısız olmuştur.

Bu nedenle, özellikle doku kısımlarını veya hatta 3D yapıların tek hücrelerini izole etmek için aika adı verilen yeni bir mekanik mikrodisseksiyon tekniğini kullanmaya ve uygulamaya karar verdik. Bu sistem, bir 3D mikromanipülatörün, çok düz veya çok yüksek nesnelere kolayca ulaşabilecek şekilde entegre edildiği bir stereo veya konfokal mikroskoptan oluşur. Bitkilerden örnekleme yapmak için mikromanipülatör, bir sütun gibi mikroskopla birlikte hareket eder ve genellikle mikro kapilerler kullanılır.

Bununla birlikte, apandiks camı durumunda, PTO tahrikli mikro penslerin prosedürümüz için daha etkili çalıştığını gördük. Apandiks için platform modifiye edilmiştir. Küçük bir VXY tablası, hem doku örneği ile tutucusunu hem de bezin yerleştirileceği alanı alacak kadar büyük, buzla dolu bir taşıma kabını desteklemektedir.

Buz, doku içindeki degrade süreçlerinin, dokunun orijinal moleküler durumunun tanınmasını mümkün kılacak kadar yavaşlamasını sağlar. Aşağıdaki prosedür, bir görüntünün alt kısmından oluşturulmuştur. Yaklaşık bir ila iki santimetrekare büyüklüğünde bir parça eksize edilir ve ardından düzleştirilir.

Ardından doku, çift taraflı bant yardımıyla bir nesne camı üzerine sabitlenir. Bu doku örneği RNAs içermeyen su ile kaplanır ve örnekleme işlemi boyunca ıslak tutulur. Daha sonra örnek, bezler ve koruyucu kapüşonlar manipülatör tarafına bakacak şekilde konumlandırılır.

Numune ile alet arasındaki açının, bezlerin düz duracak şekilde ayarlanması gerekir. Üniversal bir tabla kullanılarak eğim iki eksende ayarlanabilir ve mikroskop altında kolayca düzeltilebilir. Metal tabla, numunenin mikroskop altında soğuk kalmasını sağlar.

Bezler net bir şekilde ayırt edilmektedir. Floresans, hem bezin hem de koruyucu başlığın konturunun kolayca tanınmasına yardımcı olur. Bezlerin izolasyonu için örnek, bir FSE filtresi aracılığıyla gözlemlenir.

RNA ekstraksiyonu için bir UV filtresi kullanılır. Bez izolasyonu için mikro pensin çok hassas bir şekilde konumlandırılması gereklidir. Aracın düşük hız modunda kullanılması önerilir.

Mikro pensle bir bezle yaklaşılır ve joystick yardımıyla kollar bezin sınırlarına yerleştirilerek mikro pens nazikçe kapatılır. Ardından bez, çevreleyen dokudan kaldırılır. Hassas izolasyon sonrası, alttaki vasküler dokuyu ortaya çıkaran sağlam boşluk görülebilir.

Ardından izole edilen bez PCR tüpüne aktarılır ve hazırlanan tampon çözeltinin içine yerleştirilir. Bu yöntemi doğrulamak için, sıvıya salgılanan atoma leg protein short (TAP) gen ekspresyonu belirlenmiştir; gen, genomik DNA'nın önceden ekstraksiyonuna gerek kalmadan, doğrudan bezlerden amplifiye edilebilir. Bunun için sadece izole edilen dokuya PCR reaksiyon karışımı eklenmesi yeterlidir.

Deney serisi, farklı şekilde işlem görmüş nepenthes örneklerinden alınan bezleri ve çevresindeki epidermal dokudan alınan örnekleri kapsamaktadır. Her bir deney için toplam RNA ekstre edilmiştir. Elde edilen mRNA, ters transkripsiyon yoluyla karşılık gelen cDNA'ya dönüştürülmüş ve sonraki PCR reaksiyonu için kullanılmıştır.

İlgilenilen gen dizisini amplifiye etmek için, nepenthes bezlerindeki ve epidermisteki TLP ekspresyon seviyelerini karşılaştırmak amacıyla gerçek zamanlı PCR kullanıldı. Sonuçlar, avla temasın gen ekspresyonunu tetikleyip tetikleyemeyeceğini test etmek için bez dokusuna göre epidermisteki doku oranının birden küçük olduğu görselleştirme ile, hem nepenthes allotta hem de nepenthes miis türlerinde TLP transkript seviyesinin sekretuar bezlerde epidermal dokuya kıyasla daha yüksek olduğunu göstermektedir. Av yakalandıktan sonra TLP transkript seviyeleri, işlem görmemiş görüntüler ve drosophila melanogaster ile beslenen görüntüler karşılaştırıldı.

Epidermal dokuda burada daha yüksek bir TLP ekspresyonu görüldü. Bezlerin ve epidermal dokunun TLP transkript seviyeleri ile bir nepenthes miis işlem görmüş görüntüsü karşılaştırıldı. Her iki doku tipinde TLP ekspresyonunun artışı, ibrik sıvısı proteinlerinin üretiminin gerçekten av tarafından indükleyebileceğini göstermektedir.

PCR sonuçları, beslemenin her iki doku tipinde de TLP ekspresyonunu etkili bir şekilde değiştirdiğini ve bez ile epidermis arasındaki ekspresyon oranını kaydırabileceğini göstermektedir. FA apandiks dokusundan temizleme işlemi için etkili bir yöntem geliştirdik ve gen ekspresyon deneylerini yürütmek için yeterli miktarda mRNA izole ettik. Geliştirdiğimiz bu yeni yöntemle, sadece apandiks bezlerinde transkriptomik analizler yapmak mümkün olmakla kalmayıp, buna ek olarak metabolomik ve proteomik çalışmalar da gerçekleştirilebilir.