Name: Etçil Bitki Nepenthesin Dokusundan Canlı Çok Hücreli Bezlerin İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-22T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Öğrenin, etçil bitki Nepenthes'in dokusundan mekanik mikro hazırlama tekniğiyle canlı çok hücreli bezleri izole etme yöntemini. Bu teknik, moleküler ve biyokimyasal analizler için bezlerin bütünlüğünü korur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jena'daki Friedrich Schiller Üniversitesi Botanik Bahçesi'ndeki MPI-CE'deki sera ekibine bitki yetiştirme için ve Wilhelm Boland ve Max Planck Topluluğu'na destekleri için teşekkür ederiz.

1. Bitki Materyali Hazırlama
<ol>
	<li>Tüm Nepenthes türleri ya Kimyasal Ekoloji için MPI'nin seralarında ya da Almanya'nın Jena kentindeki Botanik Bahçesi'nde yetiştirildi.</li>
	<li>Salgı dokusunun hazırlanması için bir sürahi hasat edin ve kapak, peristom ve kaygan bölge dahil olmak üzere üst üçte birini çıkarın. Sürahi taze veya sıvı nitrojen içinde dondurulmuş olarak kullanılabilir ve -80 °C'de saklanabilir.</li>
</ol>
2. Sürahi dokusunun mikrodiseksiyonu
<ol>
	<li>Mikro örnekleme platformu, bir stereomikroskop ve doğrudan mikroskop gövdesine bağlı olan ve bir 3D joystick ile çalıştırılan bir mikromanipülatörden oluşur. Burada, belgelendiği gibi aureka'nın erken bir prototipi kullanılmıştır (Şekil 2A).</li>
	<li>Nepenthes sürahilerinden salgı bezlerinin diseksiyonu için bir mikroforseps kullanın ve bunu manipülatöre takın (Şekil 2A ve 2B).</li>
	<li>RNA ekstraksiyonu için, tüm aletleri (tıraş bıçakları, cımbız, mikromanipülatör, mikroforseps, nesne kayması) RNaseZAP ile tedavi edin.</li>
	<li>RNA ekstraksiyonu için bir PCR tüpüne 9 μl nükleaz içermeyen su ve 1 μl RNaz inhibitörü ekleyerek toplama tüplerini hazırlayın. Doku örneklerinden doğrudan PCR için sadece nükleaz içermeyen su (10 μl) kullanın.
	<ol>
		<li>Taze veya donmuş sürahiyi alın ve salgı bezlerini içeren 1-2cm2 boyutunda bir doku parçasını jiletli ve cımbız yardımıyla çıkarın. Dokuyu suyla yıkayın; RNA ekstrakte edilecekse %0.1 dietilpirokarbonat (DEPC) ekleyin.</li>
		<li>Bitki materyalini çift yüzlü yapışkan bantla bir nesne sürgüsüne sabitleyin (bez kaplı yüzey yukarı bakmalıdır, Şekil 2C ve 2D) ve sürgünü, hareketli bir masa ile uygulanması gereken evrensel bir tabla üzerinde yapışkan bantla sabitleyin.</li>
		<li>Nükleik asitlerin ekstraksiyonu için hazırlık buz üzerinde yapılmalıdır. Bu nedenle düz bir strafor kutu alın, numuneyi içeren üniversal tablayı içine yerleştirin ve kutuyu buzla doldurun. Daha sonra kutuyu mikroskobun altına yerleştirin.</li>
		<li>Hazırlık için bezlerin konumlandırılması çok önemlidir. Salgı bezleri kısmen koruyucu bir başlık ile örtülüdür (Şekil 3) ve sadece bir taraftan forseps tarafından erişilebilir. Ayrıca, numunenin forsepslere olan açısı, Nepenthes türüne bağlı olarak, üniversal tablanın tablası yaklaşık 135° eğilerek ayarlanmalıdır.</li>
		<li>Mikrodiseksiyon görsel kontrol altında yapılır. Bez izolasyonu için, DNA ve RNA'nın bozulmasını sınırlamak için UV olmayan bir filtre kullanın.</li>
		<li>Mikromanipülatörü ve forsepsleri kontrol panelinden seçilen beze taşıyın. Beze ulaşıldığında, forsepsin her bir kolunu bezin her iki tarafına yerleştirin. Forsepsleri kapatarak bezi kalan dokudan çıkarın (Şekil 4A).</li>
		<li>Forsepslere bağlı bezi nesneden uzağa ve toplama tüpüne yönlendirin. Forsepsin uçlarını tüpteki çözelti ile temas ettirin (Şekil 4B). Forsepsin açılmasıyla bezin serbest bırakılması iyi gözlemlenmelidir, çünkü bezler alet ucuna yapışma eğilimindedir. Doku, PCR veya RNA ekstraksiyonuna kadar -80 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Nepenthes Dokusundan Doğrudan PCR Amplifikasyonu
<ol>
	<li>Hazırlama yönteminin etkinliğini kanıtlamak için, DNA ekstraksiyon aşaması olmadan doğrudan bez dokusundan bir PCR yaklaşımı gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>PCR amplifikasyonu için gene özgü primerler kullanın; burada taumatin benzeri bir proteinin (TLP) dizisini kodlar (ileri: 5'-CAATGAGCCAATTCATAAAATTCATTG-3', geri: 5'-CAGTTATACTTTAAGGGCAAAACACAAC-3').
	<ol>
		<li>10 μl nükleaz içermeyen su içeren bir PCR tüpünde 1-5 bez toplayın. 50 μl'lik bir reaksiyon için 5 μl 10x Taq tamponu, 1 μl 10 mM deoksinükleosit trifosfatlar (dNTP'ler), 3 μl 25 mM MgCl2, 0.4 μl (1.25 U) Taq DNA polimeraz, 1 μl (100 pmol) her primer ve 28.6 μl nükleaz içermeyen su.</li>
		<li>Aşağıdaki programla bir termodöngüleyicide PCR reaksiyonları gerçekleştirin: ilk denatürasyon 3 dakika boyunca 94 ° C; 35 döngü denatürasyon (30 saniye boyunca 94 ° C), tavlama (30 saniye boyunca 59 ° C) ve uzatma (1 dakika boyunca 72 ° C); ve 72 ° C'de 10 dakikalık son uzatma adımı.</li>
		<li>Agaroz jel elektroforezi kullanarak PCR ürününün amplifikasyonunu kanıtlayın. Bu nedenle %1.5 (a/h) agaroz kullanın ve 1x TAE (40 mM Tris bazı, 20 mM buzlu asetik asit, 1 mM EDTA, pH 8) tamponunda çözün. Çözeltiyi, agaroz çözülene kadar bir mikrodalgada ısıtın. 100 ml agaroz çözeltisine, aşağı akış görselleştirmesi için 1 μl etidyum bromür (10 μg/μl) ekleyin. Jeli bir elektroforez odasında yaklaşık 20 dakika boyunca 300 V, 115 mA'da 1x TAE tamponunda çalıştırın. TLP amplisonunun doğru boyutu 690 bp'de olmalıdır.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Küçük Doku Örneklerinden RNA Ekstraksiyonu ve Ters Transkripsiyon
<ol>
	<li>Buz üzerinde aşağıdaki adımları gerçekleştirin. RNA'nın ekstraksiyonu için iki ekstraksiyon yöntemi kullanıldı, toplam RNA'nın ekstraksiyonu için bir Mikro Kit ve manyetik boncuklarla uygulanan bir mRNA izolasyon kiti.</li>
	<li>1 μl RNaz inhibitörü ve 9 μl nükleaz içermeyen su içeren bir PCR tüpünde mikro preparasyon ile en az 30 salgı bezi toplayın. Daha sonra dokuyu 75 ° C'de 10 dakika boyunca bir termosiklerde parçalayın.</li>
	<li>Toplam RNA'nın ekstraksiyonu.
	<ol>
		<li>Hazırlandıktan sonra, numuneye 90 μl lizis çözeltisi ekleyin ve 75 ° C'de 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, reaksiyon karışımını kolona (kit ile birlikte verilir) yükleyin ve üreticinin kılavuzunda açıklandığı gibi yıkama adımlarına devam edin.</li>
		<li>RNA'yı sırasıyla 10 μl Elüsyon Çözeltisi ile iki kez elute edin ve DNaz I tedavisine devam edin.</li>
		<li>20 μl ekstrakte edilen RNA'ya 2 μl 10x DNaz I tamponu ve 1 μl DNaz I (RNA ekstraksiyon kiti ile sağlanır) ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. 2 μl DNaz İnaktivasyon Reaktifi ekleyerek reaksiyonu durdurun ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin. Maksimum hızda 1,5 dakikalık bir santrifüj adımından sonra, RNA taze bir RNaz içermeyen tüpe aktarılabilir. Bir spektrofotometre kullanarak her numunenin RNA konsantrasyonunu belirleyin. Numuneler -80 °C'de saklanmalıdır.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Manyetik boncuklar kullanılarak mRNA'nın ekstraksiyonu.
	<ol>
		<li>Numune hacmini liziz/bağlayıcı tampon (kitte verilir) ile 100 μl'ye ayarlayın ve 75 °C'de 10 dakika inkübe edin. Oligo (dT)25 çıkıntısı ile sağlanan 20 μl manyetik boncuk ekleyin ve reaksiyonu oda sıcaklığında 5 dakika karıştırın. mRNA, poli(A) kuyruğu ile boncukların Oligo (dT)25 çıkıntısına bağlanır.</li>
		<li>Manyetik boncuklara bağlı mRNA'nın yıkama adımlarını üreticinin protokolünü takip ederek gerçekleştirin. Çözeltiler bir mıknatıs kullanılarak çıkarılabilir. Boncukları 20 μl 10 mM Tris-HCl tamponunda (pH 7.5) tekrar süspanse edin.</li>
		<li>Numuneyi 37 °C'de 1 saat boyunca 2U (1 μl) DNaz (2 μl, 10x DNaz tamponu ve 17 μl nükleaz içermeyen su) ile işleyerek genomik DNA kontaminasyonlarını giderin. Daha sonra enzim çözeltisi mıknatıs tarafından çıkarılır ve boncuklar 20 μl 10 mM Tris-HCl tamponunda yeniden süspanse edilir. Boncuklara bağlı olduğu için RNA konsantrasyonunu ölçmek mümkün değildir. Numuneler -80 °C'de saklanmalıdır.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ters transkripsiyon için bir cDNA Sentez kiti kullanın. Reaksiyonlar, üreticinin protokolü izlenerek gerçekleştirildi.
	<ol>
		<li>Toplam RNA'nın ters transkripsiyonu için 1 μl (100 pmol) Oligo (dT)20 primer veya 1 μl (0.4 μg) Rastgele Heksamer, 1 μl RNaz inhibitörü ve 1 μl 10 mM dNTP Karışımı ekleyin 1 μg RNA'ya karıştırın ve hacmi nükleaz içermeyen su ile 14 μl'ye ayarlayın. 65 °C'de 5 dakika inkübe edin ve ardından numuneleri buzun üzerine yerleştirin. 1 μl 0.1M DTT, 1 μl ters transkriptaz ve 4 μl 5x RT tamponu ekleyin. Reaksiyonlar 50 ° C'de 55 dakika inkübe edilir, ardından 70 ° C'de 10 dakika boyunca bir inaktivasyon aşaması uygulanır. Ters transkripsiyondan sonra numuneler -20 °C'de saklanabilir.</li>
		<li>Manyetik boncuklara bağlı mRNA için, Tris-HCl tamponunu ilk reaksiyon karışımıyla (1 μl RNaz inhibitörü, 1 μl 10 mM dNTP Karışımı ve 12 μl nükleaz içermeyen su) değiştirin ve 65 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Boncukların Oligo (dT)25 çıkıntısı nedeniyle, numunelere bir Oligo (dT)20 primeri veya Rastgele Heksamer eklemek gerekli değildir. Daha sonra yukarıdaki protokolü izleyin (adım 4.5.1).</li>
		<li>cDNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün. Numuneleri -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Gerçek zamanlı PCR
<ol>
	<li>Gerçek zamanlı PCR ile yapılan analizler için Mikro Kit ve bir SYBR Green QPCR Master Mix ile ekstrakte edilen toplam RNA kullanın. Eşit miktarda transkript sağlamak için, ters transkripsiyondan sonra her numunenin cDNA konsantrasyonunu aynı değere ayarlayın.</li>
	<li>Numunelere ek olarak, kontrol reaksiyonlarını da ekleyin. Reaktiflerde kontaminasyon olup olmadığını taramak ve primerlerinizin kalitesini kontrol etmek için şablon olmayan bir kontrol kullanın. Genomik DNA'nın yokluğunu doğrulamak için RT olmayan bir kontrol çalıştırın. Gerçek zamanlı PCR'de her iki reaksiyon da negatif olmalıdır (floresan sinyali yok).</li>
	<li>Farklı numuneler arasında eşit bir transkript seviyesini garanti etmek için en az bir referans gen kullanın. Burada, bir aktin (ileri: 5'-CTCTTAACCCCAAAGCAAACAGG-3', geri: 5'-GTGAGAGAACAGCCTGGATG-3') ve bir 18SrRNA (ileri: 5'-CTTGATTCTATGGGTGGTGGTG-3', geri: GTTAGCAGGCTGAGGTCTC-3') için kodlayan tasarlanmış primer çiftleri kullanıldı. Hedef gen olarak TLP (ileri: 5'- GTGGGCAACAATTGGACCCAG-3', geri: 5'-CATTCGATCCGGAAAGGCTAC-3') seçildi. Güçlendirilmiş her parçanın boyutu yaklaşık 100bp idi.</li>
	<li>25 μl'lik bir reaksiyon için 12.5 μl 2x SYBR Green QPCR Master Mix, cDNA (≥20 ng), her bir primerden 400 nM ve pasif referans boya ROX'tan 30 nM (kit ile birlikte verilir) ekleyin. Numune hacmini nükleaz içermeyen su ile 25 μl'ye ayarlayın.</li>
	<li>Reaksiyonlar, aşağıdaki programla bir QPCR termosiklerde gerçekleştirildi: polimerazı aktive etmek için 10 dakika boyunca 95 ° C'de ilk denatürasyon; 40 döngü denatürasyon (30 saniye boyunca 95 ° C), tavlama (60 saniye boyunca 61 ° C) ve uzatma (1 dakika boyunca 72 ° C); ardından ayrışma eğrisi (60 saniye boyunca 95 ° C, 30 saniye boyunca 55 °C, 30 saniye boyunca 95 °C). Ayrışma eğrisi, ek bir tepe noktası ile tespit edilebilen primer dimerlerin yokluğunu belirlemek için gereklidir.</li>
	<li>Liu ve Saint8 yöntemini kullanarak her bir PCR reaksiyonunun verimliliğini (E) belirleyin. Verimlilik, amplifikasyon eğrisinin doğrusal kısmından saptırılabilir. Burada, bir döngü noktasının (CPA) bağıl amplikon sayısı (Rn, A), başka bir döngünün (CPB) amplikon miktarına (Rn, B) bağlıdır.</li>
	<li>Gerçek zamanlı PCR sonuçlarını Relative Expression Software Tool (REST 2009, <a href="http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html" target="_blank">http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html</a>) veya benzer bir yazılımla analiz edin. Bir kontrole kıyasla tedavi edilmiş bir numunedeki bir genin ekspresyon oranını hesaplamak için programı kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Adlassnig, W., Peroutka, M., Land, I., Lichtscheidl, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glands+of+carnivorous+plants+as+a+model+system+in+cell+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Bot.+Gall%22%5BJournal%5D)">Glands of carnivorous plants as a model system in cell biological research.</a> Acta Bot. Gall. 152, 111-124 (2005).</li>
<li>Darwin, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDarwin%2C+C+%22Insectivorous+plants%22">Insectivorous plants</a>. , John Murray. London. (1875).</li>
<li>Mithöfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carnivorous+pitcher+plants%3A+Insights+in+an+old+topic%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Carnivorous pitcher plants: Insights in an old topic.</a> Phytochemistry. 72, 1678-1682 (2011).</li>
<li>Owen Jr., T. P., Lennon, K. A., Santo, M. J., Anderson, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+for+nutrient+transport+in+the+pitchers+of+the+carnivorous+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Nepenthes+alata+Ann.+Bot%22%5BJournal%5D)">Pathways for nutrient transport in the pitchers of the carnivorous plant.</a> Nepenthes alata Ann. Bot. 84, 459-466 (1999).</li>
<li>Brandt, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microgenomics%3A+gene+expression+analysis+at+the+tissue-specific+and+single-cell+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Microgenomics: gene expression analysis at the tissue-specific and single-cell levels.</a> J. Exp. Bot. 56, 495-505 (2005).</li>
<li>Hölscher, D., Schneider, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+laser-assisted+microdissection+for+tissue+and+cell-specific+analysis+of+RNA%2C+proteins%2C+and+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Bot%22%5BJournal%5D)">Application of laser-assisted microdissection for tissue and cell-specific analysis of RNA, proteins, and metabolites.</a> Prog. Bot. 69, 141-167 (2008).</li>
<li>Rottloff, S., Müller, U., Kilper, R., Mithöfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropreparation+of+single+secretory+glands+from+the+carnivorous+plant+Nepenthes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Micropreparation of single secretory glands from the carnivorous plant Nepenthes.</a> Anal. Biochem. 394, 135-137 (2009).</li>
<li>Liu, W. H., Saint, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+quantitative+method+of+real+time+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+assay+based+on+simulation+of+polymerase+chain+reaction+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics.</a> Anal. Biochem. 302, 52-59 (2002).</li>
<li>Werker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichome+diversity+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Bot.+Res.+Inc.+Adv.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Trichome diversity and development.</a> Adv. Bot. Res. Inc. Adv. Plant Pathol. 31, 1-35 (2000).</li>
<li>Fahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+secretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Bot.+Res.+Inc.+Adv.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of secretory cells.</a> Adv. Bot. Res. Inc. Adv. Plant Pathol. 31, 37-75 (2000).</li>
<li>Juniper, B. E., Robins, R. J., Joel, D. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJuniper%2C+BE+%22The+carnivorous+plants%22">The carnivorous plants</a>. , Academic Press. London. (1989).</li>
<li>Gershenzon, J., McCaskill, D., Rajaonarivony, J., Mihaliak, C., Karp, F., Croteau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+secretory-cells+from+plant+glandular+trichomes+and+their+use+in+biosynthetic-studies+of+monoterpenes+and+other+gland+products%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of secretory-cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic-studies of monoterpenes and other gland products.</a> Anal. Biochem. 200, 130-138 (1992).</li>
<li>Rontein, D., Onillon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP725A4+from+yew+catalyzes+complex+structural+rearrangement+of+taxa-4%285%29%2C11%2812%29-diene+into+the+cyclic+ether+5%2812%29-oxa-3%2811%29-cyclotaxane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">CYP725A4 from yew catalyzes complex structural rearrangement of taxa-4(5),11(12)-diene into the cyclic ether 5(12)-oxa-3(11)-cyclotaxane.</a> J. of Biol. Chem. 283 (5), 6067-6075 (2008).</li>
<li>Aharoni, A., Jongsma, M. A., Bouwmeester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+science%3F+Engineering+of+terpenoid+biosynthesis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Volatile science? Engineering of terpenoid biosynthesis in plants.</a> Trends Plant Sci. 10, 594-602 (2005).</li>
<li>Mithöfer, A., Boland, W., Maffei, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+ecology+of+plant-insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Plant+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemical ecology of plant-insect interactions.</a> Ann. Plant Rev. 34, 261-291 (2009).</li>
<li>Kennedy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+pests%2C+parasitoids%2C+and+predators%3A+Tritrophic+interactions+involving+the+genus+Lycopersicon%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Tomato pests, parasitoids, and predators: Tritrophic interactions involving the genus Lycopersicon.</a> Ann. Rev. Entomol. 48, 51-72 (2003).</li>
<li>Mithöfer, A., Boland, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+defense+against+herbivores%3A+Chemical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant defense against herbivores: Chemical aspects.</a> Ann. Rev. Plant Biol. 63, 431-450 (2012).</li>
<li>Rottloff, S., Stieber, R., Maischak, H., Turini, F. G., Heubl, G., Mithöfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+a+class+III+acid+endochitinase+from+the+traps+of+the+carnivorous+pitcher+plant+genus%2C+Nepenthes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of a class III acid endochitinase from the traps of the carnivorous pitcher plant genus, Nepenthes.</a> J. Exp. Bot. 62, 4649-4647 (2011).</li>
</ol>

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Uzun bir süredir, bitki salgı yapıları, özellikle trikomlar üzerine yapılan çalışmalar, esas olarak anatomi üzerinde yapılmıştır ve tamamen tanımlayıcıdır. 9-11 arasındaki incelemelerde özetlendiği gibi bu türden çok sayıda yayın vardır. Bitki salgı yapılarına ilişkin biyokimyasal ve moleküler bilgimiz, örneğin glandüler trikomların subkütiküler boşluğa salgılanan monoterpenoidlerin biyosentez bölgesi olduğunu gösteren nane glandüler trikomlar üzerine yapılan bazı erken dikkate değer çalışmalara rağme...

Bitkiler, düşük molekül ağırlıklı moleküllerden polimerlere kadar, farklı endüstriyel ve farmasötik uygulamaları olan çok geniş bir bileşik çeşitliliği üretirler. Bu tür bileşikler sıklıkla, birçoğu bitki yüzeyinde yer alan bezsel trikomlar veya nektaryumlar gibi veya sırasıyla idiyoblastlar ya da lateks ve reçine kanalları gibi dahili olarak konumlanan oldukça uzmanlaşmış yapılar tarafından üretilir ve salgılanır. Bununla birlikte, tüm bu bez türleri aktif metabolizmaya işaret eden birçok özellik göstermesine rağmen, bu özel salgı yapılarının biyolojisi hakkında nispeten az şey bilinmektedir. Özellikle, Nepenthes gibi etçil bitkilerin bezleri, bitki hücre biyolojisinde model sistemler olarak görülebilir1.
Etçil bitkiler, Charles Darwin'in 'Insectivorous Plants' (Böcekçil Bitkiler) adlı eserinin yayınlandığı 1875 yılından beri birçok çalışmanın konusu olmuştur2. Ancak, moleküler düzeyde araştırmalar sadece son birkaç yılda yapılmıştır ve bilgilerimiz hâlâ sınırlıdır. Örneğin, Nepenthes cinsine ait ibrik bitkilerinin sindirim sıvısının protein bileşimi henüz tam olarak bilinmemektedir. Yakın zamanda ancak birkaç hidrolitik protein ve bunlara karşılık gelen birkaç gen tanımlanabilmiştir3. Nepenthes türlerinin düşen-tuzaklarında (Şekil 1), çok hücreli bezler ibriklerin iç tabanında yer alır. Bu bezler, hem sindirim enzimlerinin üretilip ibrik sıvısına salgılanmasını hem de çözünmüş besinlerin ibrik sıvısından emilimini gerçekleştirir4. Bu nedenle, bu çift fonksiyonlu bezler, Nepenthes türlerinin etçilliğinde merkezi bir konuma ve işleve sahip olan ve detaylıca incelenmeye değer benzersiz bir mikro dokuyu temsil etmektedir.
<img alt="Etçil bitki anatomisi, Nepenthes ibrik detayı, botanik çalışma, tuzak mekanizması, adaptasyon." src="/files/ftp_upload/50993/50993fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1. Nepenthes alata ibriği. İbriğin alt kısmı, sindirim sıvısını ve iç kısımdaki bezleri içerir.
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50993/50993fig1highres.jpg" target="_blank">Daha büyük görüntüyü görmek için buraya tıklayın</a>.
Bitki bilimlerinde, tanımlanmış bir doku yerine tüm organlar incelendiği için birçok deneysel yaklaşım 'dökme materyale' (bulk material) dayanmaktadır. Bunun sonucunda, bu materyallerinle homojenizasyonu ve analizi, yalnızca bireysel dokulara ve hücrelere kıyasla seyreltilmiş ve orantılı sonuçlar sağlayabilmektedir5. Bu sorunu çözmek için, örneğin lazer yakalama mikrodissection (LCM) olarak adlandırılan mikrohazırlama teknikleri geliştirilmiş ve spesifik bitki dokularını toplamak ve bunların bireysel içeriklerini analiz etmek için başarıyla kullanılmıştır6. Bununla birlikte, RNA gibi kararsız ve/veya hızla bozunan hücre bileşenleri hedeflendiğinde LCM genellikle kısıtlı kalmaktadır. Böyle bir durumda, zaman alan ve genellikle biyomoleküllerin bozunmasıyla seyreden önceden doku fiksasyonu ihtiyacı bir dezavantaj teşkil etmektedir. Ayrıca, birçok bitki dokusunun yüksek su içeriği ve hücre duvarlarının sağlamlığı nedeniyle LCM, taze dokudan doğrudan hazırlama işleminde sıklıkla başarısız olmuştur7. Genlerden mRNA ve proteinlere, ikincil bileşiklerden bunların biyosentezine kadar salgı bezlerinde bulunan hücresel bileşenleri incelemeye yönelik her türlü yaklaşım, özel hazırlık için alternatif tekniklere ihtiyaç duymaktadır. Bu nedenle, tek hücreleri ve hatta hazırlıktan sonra bütünlüğü korunan çok hücreli bezleri izole etmek için spesifik teknikler gereklidir.
Burada, doğrudan mikroskobik görselleştirme özelliğine sahip mekanize bir mikroörnekleme platformunun kullanıldığı bir yöntem sunulmaktadır. Bu teknik, şu bitkilerin ibriklerinden tekil bezlerin hazırlanmasında hem hızlı hem de verimlidir: Nepenthes türler. Bu çok hücreli bezler bifonksiyoneldir, yani Salgılama süreçlerinin yanı sıra alma süreçlerinde de yer alırlar, sessildirler ve maruz kalmamış hücre tabakaları, bir endodermis oluşturacak şekilde emprenye olmuştur. Tüm bezler, komşu dokulardan ayrıştırılarak bir PCR tüpüne belirgin bir şekilde yerleştirilebilir. Bu teknik, bez dokularındaki belirli genlerin yanı sıra gen ekspresyonunun çalışılması için uygulanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>RNAqueous-Micro Kit</td><td>Life Technologies GmbH, Almanya</td><td>AM1931</td><td>Toplam RNA izolasyonu, 50 örnek</td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit</td><td>Life Technologies GmbH, Almanya</td><td>61011</td><td>5 ml Dynabeads Oligo (dT)25</td></tr><tr><td>DynaMag-2 mıknatıs</td><td>Life Technologies GmbH, Almanya</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript CellsDirect cDNA Sentez Sistemi</td><td>Life Technologies GmbH, Almanya</td><td>18080-200</td><td>25 reaksiyon</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies GmbH, Almanya</td><td>10777-019</td><td>Rnase inhibitörü, 5.000 birim</td></tr><tr><td>Rastgele Heksamer (0.4 & mu; g/&mu; l)</td><td>QIAGEN GmbH, Almanya</td><td>79236</td><td>100 &mu; l</td></tr><tr><td>10 mM dNTP Karışımı, moleküler biyoloji sınıfı</td><td>Fermentas GmbH, Almanya</td><td>R0192</td><td>1 ml</td></tr><tr><td> Taq DNA polimeraz, (rekombinant)</td><td>Fermentas GmbH, Almanya</td><td>EP0402</td><td>10x Taq tamponu ile birlikte verilir (KCl veya (NH4< ile >2SO4) ve 25 mM MgCl2</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies GmbH, Almanya</td><td>AM2238</td><td>1.000 adet</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth GmbH Co. Almanya</td><td>T846.3</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler Low Range DNA merdiveni, kullanıma hazır</td><td>Fermentas GmbH, Almanya</td><td>SM1193</td><td>50 &mu; g</td></tr><tr><td>Brilliant II SYBR Yeşil QPCR Master Mix</td><td>Agilent Technologies, Inc., ABD</td><td>600828</td><td>Tek kit</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Almanya</td><td>R2020</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçağı</td><td>Carl Roth GmbH Co., Almanya</td><td>CK08.1</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>Carl Roth GmbH Co., Almanya</td><td>2801.1 / 2855.1</td><td></td></tr><tr><td>GE NanoVue spektrofotometre</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, Almanya</td><td>28-9569-62</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler gradyanı</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Almanya</td><td>5331 000.010</td><td></td></tr><tr><td>Mx3000P Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>Stratagene, ABD</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>Agagel Standart Yatay Jel Elektroforez Odası</td><td>Biometra</td><td>Durdurulan</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Aura Optik</td> GmbH <td>Aureka</td><td>Mikroforseps</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td> ile donatılmıştır <td>Carl Zeiss Mikroskopi, Jena, Almanya</td><td>SteREO Lumar.V12</td><td>AxioCam</td></tr><tr><td>Lumar Filtre seti ile donatılmıştır 01</td><td>Carl Zeiss, Mikroskopi, Jena, Almanya</td><td>485001-0000-000</td><td>UV filtresi</td></tr><tr><td>Lumar Filtre seti 09</td><td>Carl Zeiss, Microscopy, Jena, Almanya</td><td>485009-0000-000</td><td>UV olmayan filtre</td></tr></tbody></table>

etçil bitki nepenthes'in dokusundan canlı Çok hücreli bezlerin İzolasyonu

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Birçok bitki, belirli düşük moleküler ağırlıklı bileşiklerin ve proteinlerin üretimi ve salgılanmasında rol oynayan özel yapılara sahiptir. Bu yapılar hemen hemen her zaman bitki yüzeylerinde lokalizedir. Bunlar arasında nektarlar veya glandüler trikomlar bulunur. Salgılanan bileşikler genellikle biyotik çevre ile etkileşimlerde, örneğin tozlayıcılar için cezbedici veya otoburlara karşı caydırıcı olarak kullanılır.
 Çeşitli yönlerden benzersiz olan bezler etçil bitkilerde bulunabilir. Nepenthes cinsinin sürahi bitkileri olarak adlandırılan bitkilerde, tuzak tuzağı içindeki iki işlevli bezler bir yandan av sindirimi için gerekli tüm enzimler de dahil olmak üzere sindirim sıvısını salgılar, diğer yandan salınan besinleri alır. Bu nedenle, bu bezler, bitkilerde protein salgılanması ve besin alımının altında yatan moleküler, biyokimyasal ve fizyolojik mekanizmaları incelemek için önceden belirlenmiş ideal, özel bir dokuyu temsil eder. Ayrıca, genel olarak, glandüler yapılarla donatılmış birçok bitki tarafından üretilen ikincil bileşiklerin biyosentezi doğrudan salgı bezlerinde incelenebilir.
Bu tür özel yapılar üzerinde çalışabilmek için verimli, hızlı, metabolik olarak aktif ve diğer dokularla kontaminasyon olmadan izole edilmeleri gerekir. Bu nedenle, Nepenthes sindirim sıvısı ile ilgili çalışmalar için mekanik bir mikro preparat tekniği geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Burada, mekanize bir mikro örnekleme platformuna dayalı olarak Nepenthes tuzaklarından tek iki işlevli bezleri başarılı bir şekilde hazırlamak için kullanılan bir protokol sunulmaktadır. Bezler izole edilebilir ve RNA'nın hazırlanmasından sonra PCR teknikleri ile gen ekspresyon analizi için doğrudan kullanılabilir.

Nepenthes ibrik dokusundan tekil bezlerin hazırlanması için mekanize bir mikrodiseksiyon tekniği geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Mikrohazırlama platformunun, mikromanipülatöre bağlı olan ve bir kontrol paneli üzerinden yönetilen mikroforseplerle donatılması gerekir. Mikroskop altında görülebilen tekil bezler, bez dokusunu kavrayan ve mekanik olarak ayıran forseplerle hedeflenebilmiştir (Şekil 4A).
Bezi dokusu, sonraki analizler için doğrudan bir PCR tüpüne aktarıldı (...

Bitki bezleri, biyotik çevre ile etkileşimlerde yer alan birçok bileşiğin biyosentezi ve salgılanmasından sorumlu özel yapılardır. Moleküler ve biyokimyasal özellikleri üzerinde çalışmalara olanak sağlamak için, burada etçil bitki Nepenthes'ten metabolik olarak aktif tek bezleri izole etmek için mekanik bir mikro hazırlama tekniği oluşturulmuştur.

Etçil Bitki Nepenthes'in Dokusundan Canlı Çok Hücreli Bezlerin İzolasyonu

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Sunulan yöntemin kapsamı, moleküler analizler için taze bitki dokusundan tekil ve saf bezler elde etmektir. Bu işlem, öncelikle nepenthe bitkisinden bir ibrik yaprağın hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından doku, tazeliğini korumak amacıyla buz üzerinde bir mikro örnekleme platformuna doğrudan sabitlenir.Mikro örnekleme prosedürü sırasında, bezler hassas bir şekilde izole edilir ve toplanan materyal üzerinde kantitatif PCR analizi gerçekleştirilmeden önce PCR tüpüne aktarılır. Nihayetinde, ileri moleküler analizler için spesifik dokuları hızlı ve mikro-invaziv bir şekilde sağlamak amacıyla, etobur bitkilerden tekil ve saf bezler elde etmek için mekanik mikro örnekleme teknolojisi kullanılır. Etobur bitkiler, hayvan proteinlerini sindirebildikleri için flora arasında uzmanlaşmış türlerdir.Bunun moleküler düzeyde nasıl çalıştığına dair bilgilerimiz hâlâ sınırlıdır. Bu soruyu ele almak için uygun bir model, belirgin organları ve sindirim süreçlerine katkıda bulunan bezler üreten yapıları olduğu için genius apandiksle ilgili resim karışımıdır. Apandikste.Bu bezler alt kısımdaki resimlerin içinde yer almaktadır. Moleküler analiz için, yaklaşık 100 ile 200 mikrometre çapındaki bu g

isolation-viable-multicellular-glands-from-tissue-carnivorous-plant

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Etobur Bitki Nepenthes'in Dokusundan Canlı Çok Hücreli Bezlerin İzolasyonu

Burada kadın kara dul örümcekleri karın ipek üreten bezlerin kaldırmak için etkili bir strateji açıklanmaktadır. Bu prosedür, yedi ayrı ipek üreten, son derece saf bir moda, örümcek ipeği üretimi ve lif montaj inceleyen araştırmacılar için önemli bir süreci bezlerinin hızlı bir izolasyon sağlar.

Black Widow Spider İpek üreten Bezler, Mikrodisseksiyon

Burada fare tracheas bazal ve submukozal bez kanal hücrelerinin izolasyonu için bizim protokol göstermektedir. Ayrıca, bir oluşturmak için dorsal fare yağ yastığı içine kök hücreleri enjekte yöntem...

Fare Trakea gelen Bazal Hücre ve Submukozal Bezi Kanal Hücre İzolasyonu

Bu videoda, mide epitel hücrelerini insan fundik dokusundan izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. İzole edilmiş epitel hücreleri, mide fizyolojisi ve patofizyolojisindeki düzenleyici rollerini incelemek için in vitro bir model olarak kullanılabilir.

Mide Fundik Bezleri İzolasyonu: Fon Bezlerini İnsan Mide Dokusundan İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Biz deniz deniz tavşan sinir sisteminin diseksiyonu...

Duyusal nöronlar izolasyonu<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için

Bu makale sülükler kullanılarak üç sinir sistemi hazırlıkları anlatmaktadır: Hücre içi kayıt ventral gangliada nöronların, ventral ganglionlar nöronları kültüre ve duyusal alanları haritaya innerve deri bir yama kayıt.

Hücre içi Kaydı, Duyu Alan Haritalama ve Sülük de Kültüre Belirlenen Nöronlar Hirudo medicinalis</i

Kök hücre türevli kültürler, bulaşıcı hastalıkları modellemek için muazzam bir potansiyel barındırıyor. Burada, yetişkin kök hücrelerden türetilen fare ve insan mide organoidlerinin kültürü anlatılmaktadır. Organoidlere mide patojeni Helicobacter pylori mikroenjekte edilir.

Enfeksiyon Hastalıkları Modeli Olarak Organoids: Helicobacter Pylori ve İnsan Kültür ve kemirgen Mide Organoids ve Mikroenjeksiyon

Burada, hücre dışı Matriks (ECM) ifade ve duktal Morfoloji araştırmak için meme dokuları bütün, olduğu gibi fare yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Fare #4 karın bezleri tarafsız tampon formalin içinde sabit kesitli ve ECM proteinler için immünhistokimya kullanarak lekeli 8-10 hafta eski kadın nulliparous fareler, elde.

Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için

Burada biz kurmak ve 3 boyutlu (3D) Gastrik organoids insan ve fare türetilen ve yöntemi 3D organoids aktarmak için bir 2-boyutlu monolayer kültür bir protokol tanımlamak. Yenilenme çalışmaları bir roman çizik-yara tahlil olarak Gastrik epitel monolayer kullanımı da açıklanmıştır.

Fare ve insan elde edilen birincil Gastrik epitel Monolayer kültür yenilenme çalışmaları için

Birincil insan tükürük bezi türevi epitelyal hücreleri izole etmek ve yetiştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu hücreler onları tükürük epitelyal orijinli olmak ile tutarlı gen ifade desenleri sergiler ve Engelbreth-Holm-Swarm tümör hücrelerinden türetilen Bodrum membran matrisleri üzerinde salispheres olarak veya tedavi kültür yemekleri monolayers olarak yetişebilir.

Salispheres veya Monolayers olarak In vitro büyüme için ınsan tükürük bezlerinden tükürük epitelyal hücrelerin yalıtım

Esrar sativa'dan glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomların uygun ve yüksek verimli izolasyonu ve zenginleştirilmesi için bir protokol sunulmaktadır. Protokol, sadece sıvı azot, kuru buz ve naylon elekler kullanılarak trikomların kuru, tamponsuz ekstraksiyonuna dayanır ve RNA ekstraksiyonu ve transkriptomik analiz için uygundur.

Esrar sativasından Glandüler Kapitat Saplı ve Sapsız Trikomların Susuz İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Fare adrenal korteks için zona glomerulosa ve zona fasciculata ile zenginleştirilmiş hücrelerin 2D birincil kültürlerini oluşturmak amacıyla sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşım geliştirildi. Bu sistem, her bölgenin temel moleküler ve fonksiyonel özelliklerini koruyarak sinyal yolları, hormon üretimi ve adrenal kortikal hücre davranışının odaklanmış şekilde incelenmesini mümkün kılar.

Fare Adrenal Korteksinden Bölge Zenginleştirilmiş Birincil Kültürlerin Oluşumu

Öğrenin, etçil bitki Nepenthes'in dokusundan mekanik mikro hazırlama tekniğiyle canlı çok hücreli bezleri izole etme yöntemini. Bu teknik, moleküler ve biyokimyasal analizler için bezlerin bütünlüğünü korur.

Etçil Bitki Nepenthes'in Dokusundan Canlı Çok Hücreli Bezlerin İzolasyonu

Daha fazla video keşfet