Yağış oluşturulmuş polietilen glikol mikrojellerinin özellikleri reaktiflerin molekül ağırlığı ile kontrol edilir

Bu prosedürün genel amacı, ilaç taşıyıcı araçlar ve doku mühendisliği iskeleleri olarak kullanılmak üzere, fotopolimerize çöktürme reaksiyonu ile polietilen glikol mikro jeller oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle foto başlatıcı, tamponlar, trietilamin ve PEG DL solüsyonu dahil olmak üzere reaktiflerin hazırlanması ve bunların 37 °C'ye ısıtılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, reaktiflerin bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilmesi ve 37 °C sıcaklık korunurken vorteksle karıştırılmasıdır.

Ardından sodyum sülfat karıştırılır ve çözelti, çapraz bağlanma için 30 saniye boyunca UV ışığı altına yerleştirilir. Çapraz bağlanmanın ardından, çözeltinin üzerinde mikro jelleri içeren bulanık bir tabaka oluşacaktır. Son adım, karışıma PBS eklemek ve bir pelet oluşturmak için santrifüj işlemidir.

Son aşamada, mikrojellerin boyutunu ölçmek için mikroskopi ve dinamik ışık saçılması kullanılır; yoğunluk ise bir dekstrin yoğunluk gradyanı kullanılarak ölçülür. Ayrıca, mikrojellerin ıslak ve kuru ağırlıkları ölçülerek şişme miktarı hesaplanır. Bu tekniğin emülsiyon, süspansiyon ve dispersiyon teknikleri gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, çöktürme reaksiyonu ile oluşturulan mikrojellerin organik çözücüler veya stabilizatörler kullanılmadan düşük polidispersite indeksine sahip olmasıdır; çöktürme reaksiyonunun hafif koşulları, mikrojellerin özelleştirilebilir özellikleri ve enjeksiyonlar için düşük viskozite, onları NVivo uygulamaları için uygun hale getirir.

Bu yöntem, hem tekdüze boyuta hem de düşük polidispersite indeksine sahip iskelelerin üretimi gibi doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. İlaçlardaki büyüme faktörleri kolayca enkapsüle edilebildiği için bu tekniğin etkileri ilaç iletim tedavisine kadar uzanabilir. Başlamak için, 500 miligram foto başlatıcı tartın ve %0,5'lik bir çözelti hazırlamak için bunu 100 mililitre deiyonize suya ekleyin.

Çözeltiyi UV ışığından koruyun ve foto başlatıcıyı tamamen çözmek için yaklaşık bir saat boyunca sürekli karıştırarak 40 °C'ye ısıtın. Tam çözünme sağlandıktan sonra, çözeltiyi 0.22 µm'lik bir filtreden geçirerek steril filtreleyin ve ihtiyaç duyulana kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın. Ardından, viskozitesini azaltmak için Trietilamin'i 37 °C'ye ön ısıtmaya tabi tutun.

Ardından, bunun 612 µL'sini ve altı molar hidroklorik asidin 260 µL'sini 39,4 mL PBS'ye ekleyin ve pH değerini steril olarak 7.8'e ayarlayın. Nihai çözeltiyi 0,22 µm'lik bir filtreden süzün ve ihtiyaç duyulana kadar 37 °C'de saklayın. Sony ve ark. tarafından yapılan çalışma uyarınca, yayınlanmış yöntemlere göre PEG öncüllerini hazırlayın ve bitmiş ürünü argon altında -20 °C'de saklayın; ardından kullanımdan hemen önce, 0,8 mL trietanolamin ve hidroklorik asit eklenmiş PBS'yi 200 mg PEG diakrilata yavaşça ekleyerek 1 mL 200 mg/mL'lik PEG diakrilat çözeltisi hazırlayın.

Ayrıca, deneyden hemen önce 213 mg sodyum sülfat tartın ve bir mililitre deiyonize su içinde çözün. 1,5 molar bir çözelti hazırlamak için, çözeltiyi 37 °C'de 20 dakika boyunca ısıtın ve ardından tamamen çözünene kadar vorteksleyin. Çözünme tamamlandığında, hem nihai sodyum sülfat çözeltisini hem de PEG diakrilat çözeltisini 37 °C'de 0,22 mikronluk filtrelerden süzün.

127,5 µL PBS ile trietilamin ve hidroklorik asit, 10 µL %0,5 foto başlatıcı ve 25 µL 200 mg/mL PEG diakrilat çözeltisini 1,6 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin. Ardından, enkapsülasyon için istenen molekülleri ekleyin.

Bu tüpleri 1,5 molar sodyum sülfat çözeltisi ile birlikte 37 °C'ye ısıtın. Ardından, önceden ısıtılmış 1,5 molar sodyum sülfat çözeltisinden 87,5 µL'yi PEG çözeltisinin bulunduğu ilk tüpe ekleyin ve çözeltiyi pipetleme yöntemiyle üç ila beş kez karıştırın. Karıştırma işleminden sonra tuz konsantrasyonu eşit şekilde dağılacak ve çözelti berraklaşacaktır.

Tüpü UV ışığının altına yerleştirin ve çapraz bağlama işlemini 30 saniye boyunca uygulayın. Mikro jelleri içeren çözeltinin üzerinde bulanık bir tabaka oluşmalıdır. Ardından, tüpe 750 µL PBS ekleyin ve çözeltiyi vorteksleyerek iyice karıştırın.

Ardından, pelet oluşturmak için karışımı 2 dakika boyunca 4,000 ×g'de santrifüjleyin. Peletleme işlemi tamamlandıktan sonra, peleti bozmamaya dikkat ederek süpernatanı uzaklaştırın ve mikro jelleri taze PBS içinde süspanse edin. Mikro jelleri, her işlem arasında peletleyerek toplamda beş kez taze PBS ile yıkayın.

Son yıkamanın ardından, süpernatanı uzaklaştırın ve pelletten 30 µL mikrojeli bir mililitre deiyonize suyun içine pipetleyin. Ardından, mikrojel çözeltisini bir su banyolu sonikatörde, 50 ila 60 Hz frekans ve 1.4 A güçte bir saat boyunca sonikasyona tabi tutun. Son olarak, 15 µL mikrojel çözeltisini temiz, asitle aşındırılmış bir cam lam üzerine pipetleyin ve üzerine 1.5 numara asitle aşındırılmış bir lamel yerleştirin.

Lamı bir laboratuvar mendili üzerine ters çevirin ve fazla çözeltiyi uzaklaştırmak ve mikro jellerin tek bir tabaka halinde olduğundan emin olmak için lamın üzerine hafifçe bastırın. Ardından, bir optik mikroskop kullanarak, DIC 100x yağlı objektif ile mikro jellerin birkaç görüntüsünü yakalayın. Temsili bir çap elde etmek için mikro jelleri ölçün.

N'nin toplam mikrojel sayısı ve VI'nın mikrojelin hacmi olduğu, burada gösterilen hacim tabanlı denklemi kullanarak polidispersite indeksini hesaplayın. Ortalama mikrojel yoğunluğunu ölçmek için öncelikle deiyonize su içerisinde %7, 6, 5, 4, 3 ve 1'lik dekstrin çözeltileri hazırlayın; dekstrin çözeltilerinin yoğunlukları burada gösterilmiştir. Ardından, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne iki mililitre %7'lik dekstrin çözeltisi ekleyin.

Ardından, %7 dekstrin çözeltisinin üzerinde belirgin bir tabaka oluşturacak şekilde %6 dekstrin çözeltisinden iki mililitre yavaşça pipetleyin. Beş dakika sonra, %5 dekstrinden oluşan bir sonraki tabakadan iki mililitre ekleyin ve her bir dekstrin konsantrasyonu, azalan dekstrin konsantrasyonu sırasına göre tabakalanana kadar bu şekilde devam edin. Daha sonra mikro jelleri %1 dekstrin çözeltisinin üzerine dikkatlice tabakalandırın ve gradyanı beş derece Celsius'ta 4.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından mikro jellerin konumunu görselleştirin ve katmanlar arasındaki konumlarına göre mikro jellerin yoğunluğunu hesaplayın. Mikro jellerin şişmiş kütlesini ölçmek için önce bir mikro santrifüj tüpünü önceden tartın ve ardından içerisine bir mililitre mikro jel ekleyin. Her yıkama arasında mikro jelleri deiyonize su ile beş kez yıkayın.

Son yıkamanın ardından mikro jelleri çöktürmek için numuneyi 4.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Bunları deiyonize su içerisinde yeniden süspanse edin ve minimum 48 saat boyunca şişmelerine izin verin. 48 saat sonra, şişmiş mikro jelleri 4.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından tüm süpernatanı uzaklaştırın.

Ardından örneği tartın ve ıslak kütleyi kaydedin. Doğru ıslak ağırlık elde edildikten sonra, mikro jelleri -80 °C'de dondurun, ardından suyu uzaklaştırmak ve kuru kütleyi elde etmek için liyofilize edin. Tüm su süblime olduğunda, MS'nin mikro jellerin ıslak ağırlığı ve MD'nin kuru ağırlık olduğu burada gösterilen denklemleri kullanarak mikro jellerdeki su ve polimer içeriğini hesaplayın.

Farklı moleküler ağırlıklara sahip %20 PEG kullanılarak oluşturulan PEG mikro jellerin ortalama çapları burada gösterilmiştir. UV maruziyet süresinin artırılması da mikro jellerin çapı üzerinde etkili olmuştur. UV maruziyet süresi arttıkça, burada gösterilen üç formülasyonun çapları da artmıştır.

Dekstrin gradyanları ile ölçülen yoğunluk, öncül peg moleküllerinin moleküler ağırlığı arttıkça azalmıştır. Bu durum, daha yüksek moleküler ağırlıklı peg'in gram polimer başına daha yüksek miktarda su içerdiğinin görüldüğü yüzde su içeriği grafiğiyle de doğrulanmıştır. Son olarak, mikro jellerin floresan olarak konjuge edilmiş proteinlerle yüklenebileceğini göstermek amacıyla, polimerizasyon öncesinde karışıma albumin eklenmiş ve bu protein kürelerin içinde hapsolmuştur.

Floresan işaretli protein konsantrasyonunun artırılması, kürelerin polidispersite indeksini artırmış ancak ortalama boyut sabit kalmıştır. Bu prosedür uygulanırken, yıkama ve görüntüleme için lamların hazırlanması sırasında oluşabilecek agregatları parçalamak amacıyla tüm solüsyonların 37 °C'ye ısıtılması ve mikro jellerin iyice vorteksle karıştırılması gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, ilaç salınımının etkisine ilişkin ek soruları yanıtlamak için ilaç enkapsülasyonuna yönelik ek yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, çöktürme reaksiyonları yoluyla hafif koşullar altında peg DA mikro jellerinin nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.