Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu
30 Ocak 2014
Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.
Bu prosedürün genel amacı, kortikal mikroglia'yı murin yenidoğanlarından izole etmektir. Bu, Müren yenidoğanlarından alınan kortikal beyin dokusunu ilk mikroskelerin incelemesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, in vitro olarak 17 ila 21 gün boyunca karışık glial hücre kültürlerinin büyütülmesidir.
Daha sonra, mikroglia bu karışık glial kültürlerden izole edilir. Son adım, daha fazla deney için hücre kültürü plakalarında mikroglial hücreleri plakalamaktır. Sonuç olarak, immünofloresan mikroskobu ve Eliza, bu izolasyon protokolünün mikroglial immün fenotipi ve işlevselliği koruduğunu göstermek için kullanılır.
Mikro mikrodiseksiyonda yer alan SEP'in gerçekleştirilmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu prosedürün başarılı bir şekilde yürütülmesi hem hız hem de doğruluk gerektirir. Yani, çok yavaş olmak hücre veriminizi düşürürken, meninkslerin eksik çıkarılması glial kültürü kirletecek ve glial büyümeyi engelleyecektir.
Bundan sonra MCM olarak anılacak olan mikroglia komple ortamını hazırlayarak başlayın. Her yavru için bir şişe hazırlayın ve en az bir saat kuluçkaya yatırın. Bu dengeleme adımı başarı için çok önemlidir.
Sonra, alikot hazırlayın ve buz üzerinde soğutun. Gerekli tüm ortamlar, her yavru için altı mililitre MCM içerir ve diseksiyondan önce 37 santigrat derece su banyosunda ısıtılır. Yatay hava akımı iş istasyonunu ve diseksiyon mikroskobunu %70 etanol ile silin.
Daha sonra işlem için gerekli olan sterilize edilmiş cerrahi aletleri çalışma alanına yerleştirin. Kafayı yakalamak için diseksiyon ortamı ve diseksiyon için başka bir diseksiyon ortamı içeren steril bir tabak hazırlayın. Beyin dokusunu kıymak için kıyma ortamını kendi kabına dağıtın.
Dekapitasyon ve beyin ekstraksiyonundan sonra, nezaketleri görselleştirmek için yeni izole edilmiş beyni diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin ve sırt tarafını yukarıda ve kuru tuttuğunuzdan emin olun. Forseps uçlarını orta beyin ve korteksin kesişme noktasına sokarak beyni sabitleyin. Yerleştirildikten sonra, dorsal kortikal meninksleri tamamen çıkarın.
Ardından, mikroglia saflığını ve verimini en üst düzeye çıkarmak için ventral meninksleri çıkarın. Tüm meningeal dokunun tamamen çıkarılması esastır. Korteksleri beynin geri kalanından ayırın.
Kortekslerin ventral veya medial tarafında bulunabilecek kalıntı kortikal meninksleri çıkardığınızdan emin olun. Meningeal doku çıkarıldıktan sonra korteksleri daha önce hazırlanmış kıyma kabına yerleştirin. İkinci sınıf bir biyolojik güvenlik kabininde çalışırken, beyin dokusunu kıymak için makas kullanın.
Kıyılmış dokuyu 15 milimetrelik konik bir tüpe aktarın. Verimi en üst düzeye çıkarmak için hem makası hem de kıyma kabını bir mililitre kıyma ortamıyla durulayın. Bu durulamaları toplayın ve kıyılmış dokuyu içeren 15 mililitrelik konik tüpe dağıtın.
Doku süspansiyonunu bir ila iki dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın ve kıyılmış dokunun tüpün dibine yerleşmesine izin verin. Bu sürenin ardından, yerleşmiş kıyılmış dokuyu bozmamaya dikkat ederek, süpernatanın iki mililitresini dikkatlice çıkarın ve atın. Kıyılmış dokuya önceden ısıtılmış MCM'den üç mililitre ekleyin ve ardından dokuyu kuvvetlice deneyin.
Trier tamamlandığında fark edilebilir katı doku kalmamalıdır. Uçtan kalan öğütülmüş numuneyi toplamak için aynı pipet ucunu kullanarak üç mililitre daha MCM ekleyin. Toplandıktan sonra, hücreleri peletlemek için kıyılmış dokuyu santrifüjleyin.
Tamamlandığında, peletlenmiş hücreleri biyolojik güvenlik kabinine geri koyun. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın. Nazikçe resus.
Hücre peletini iki mililitre ılık MCM ile askıya alın ve ardından hücre reçinesi süspansiyonunu daha önce hazırlanan şişeye ekleyin. Hücreleri 24 saat inkübe edin. 24 saat sonra, doku kalıntılarını bozmak için şişeyi avucunuzun içine hafifçe vurun.
Kalıntıların tamamen temizlendiğinden emin olmak için dokunmadan önce ve sonra hücreleri kontrol edin. Ardından, ortamı yeni MCM ile değiştirin ve şişeyi inkübatöre geri koyun. Büyüme ve kontaminasyonu izlemek için hücreleri günlük olarak kontrol edin.
Yaklaşık 17 ila 21 gün sonra, hücrelerin hazır olup olmadığını belirlemek için mikroglial hücreler hasat için hazır olacak, bunları ters faz kontrast mikroskobu altında inceleyecektir. Mikroglia hasada hazır. Yaklaşık% 40 co akıcılığına ulaştıklarında, birbiri üzerine tek tabaka olarak büyüyen küçük, parlak küresel hücreler olarak görünürler.
İzole etmek için, mikroglia şişeyi laboratuvar tezgahına kuvvetlice vurun. Bu ajitasyon, mikroglianın düşük yapışma özellikleri nedeniyle mikroglia'yı diğer glial hücrelerden ayırmaya yardımcı olur. Şişe kapaklarını paraform ile kapatın ve karışık glial kültürleri sıcaklık kontrollü, nemlendirilmemiş bir döner çalkalayıcı kullanarak beş saat boyunca döndürün.
Bu süreden sonra, mikroglia'nın şişe yüzeyinden kalktığını görsel olarak inceleyin. Ters faz kontrast mikroskobu kullanan mikroglia, parlak, küresel, serbest yüzen hücrelerdir. Şişenin dibine yapışan artık bir astrosit ve oligodendrosit tabakası olacaktır.
Daha sonra, mikroglia içeren süpernatanı steril bir konik santrifüj tüpüne ve damağa toplayın. Resus. Mikroglial peleti ılık mikroglial büyüme ortamında askıya alın ve bir hemo sitometre plakası kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin. Plastik veya steril cam kapak üzerine 24 oyuklu plaka formatındaki hücreler 24 saat sonra kayar.
Yüzen hücreleri ve kalıntıları temizlemek için ortamı taze ılık MGM ile değiştirin. Bu adım, hücre sağkalımı için kritik öneme sahiptir ve hareketsiz mikrogliayı korumak için, mikroglia hücreleri, mikroglial saflığı değerlendirmek için bu yeniden besleme adımından hemen sonra deneye hazırdır. Endojen olarak GFP'yi eksprese eden mikrogliadan türetilen hücre kültürleri, makrofaj antijeni IBA one için boyandı ve dapi ile karşı boyandı.
Hücre çekirdeğini görselleştirmek için, hücrelerin %95'inden fazlası GFP IBA one ve dpi'nin kolokalizasyonu sergiledi. LPS ile hücrelere meydan okuduktan sonra, mikroglia, küçük bir bi fenotipten amip benzeri bir şekle keskin bir morfolojik değişiklik benimsedi. P 65 için immüno-fitokimyasal boyama, normal koşullar altında P 65'in sitoplazma boyunca yaygın olarak lokalize olduğunu kanıtlar.
Pam P 65'e iki saatlik bir maruz kaldıktan sonra, immünoreaktivite, izole mikroglia'nın biyokimyasal immün işlevselliğini koruduğunu doğrulamak için lokalizasyonu hücre çekirdeğine önemli ölçüde kaydırdı. Proinflamatuar sitokin TNF alfa'nın sekresyonu, PAM veya LPS'ye maruz kaldıktan sonra belirlendi. Bu videoyu izledikten sonra, en iyi sonuçları elde etmek için kortikal mikroglia'yı aynalanan yenidoğanlardan nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.
Steril tekniğin sürdürülmesi ve meningeal dokunun diseke edilen kortikal bölgeden iyice çıkarılması önemlidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, mikrogliya hücrelerinin fare neonatallerinden izole edilmesi prosedürünü açıklar ve bu işlem sırasında mikrogliya immün fonksiyonunun korunmasının önemini vurgular. İzolasyon yöntemi, beyin dokusunun mikroskop altında diseksiyonunu, karışık glia hücrelerinin kültürlenmesini ve ardından deneysel amaçlarla mikrogliya hücrelerinin izole edilmesini içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- İmmünoloji
Arka Plan
- Mikrogliya, merkezi sinir sistemi (MSS) içinde kritik bir rol oynar.
- İzolasyon yöntemleri, mikrogliya hücrelerinin işlevselliğini etkileyebilir.
- İmmün fonksiyonun korunması, doğru deneysel sonuçlar için esastır.
- Mikrogliya aktivasyonunu değerlendirmek için proinflamatuar uyarıcılar kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- Fare neonatallerinden mikrogliya hücrelerini izole etmek için güvenilir bir protokol geliştirmek.
- İzole edilen mikrogliya hücrelerinin immünofenotiplerini ve işlevselliklerini korumasını sağlamak.
- Mikrogliya biyolojisi üzerinde daha fazla deney yapmayı kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Fare neonatallerinden kortikal beyin dokusunun mikroskop altında diseksiyonu.
- Karışık glia hücrelerinin 17 ila 21 gün boyunca in vitro kültürü.
- Karışık glia kültürlerinden mikrogliya hücrelerinin izole edilmesi.
- Mikrogliya işlevselliğini değerlendirmek için immünoflüoresan mikroskopi ve ELISA kullanımı.
Ana Sonuçlar
- İzolasyon protokolü, oldukça saf mikrogliya hücreli kültürler verir.
- Mikrogliya, izole edildikten sonra immün işlevsel özelliklerini korur.
- LPS ve Pam 3 CSK 4 ile aktivasyon, korunmuş işlevselliği gösterir.
- Floresan görüntüleme ve immünositokimi yapılan deneyler, sonuçları doğrular.
Sonuçlar
- Açıklanan izolasyon yöntemi, işlevsel mikrogliya elde etmek için etkilidir.
- İmmün fonksiyonun korunması, mikrogliya biyolojisini incelemek için kritiktir.
- Bu protokol, mikrogliya ile ilgili çeşitli deneysel kurulumlara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Isolation of functional microglia from murine neonates enables mechanistic de-risking in neuroimmunology target validation by preserving immunophenotype and responsiveness to inflammatory stimuli. This ex vivo model supports predictive confidence in early discovery by maintaining quiescent and activated states relevant to CNS disease pathways. The method provides a disease-relevant system for screening immunomodulatory compounds and assessing target engagement in preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial activation pathways through LPS and Pam3CSK4 challenge assays.
- Operational Value: Yields highly pure cortical microglia with preserved NF-κB p65 nuclear translocation and TNF-α secretion functionality.
- Predictive Value: Supports target hypothesis testing by maintaining immunophenotypic fidelity from quiescent to proinflammatory states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized microglial monolayer system for compound screening after 17–21 days of glial culture maturation.
- Operational Value: Allows quantification of microglial purity via IBA-1/GFP colocalization (>95%) and functional readouts like cytokine release.
- Assay Readiness: Isolated microglia exhibit morphological and functional responses to stimuli, enabling reliable dose-response profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains microglial functionality ex vivo, supporting continuity from discovery to preclinical validation of neuroinflammatory targets.
- Mechanistic De-risking: Preserves biochemical functionality (NF-κB signaling, TNF-α release) critical for assessing target-mediated pathway modulation.
- Disease Relevance: Models quiescent and activated microglia states applicable to neurodegenerative and neuroinflammatory disease research.
Pipeline & Workflow Integration
The isolation method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification by providing a reproducible microglial platform for mechanism-of-action studies and phenotypic screening in neuroimmunology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification via NF-κB translocation and cytokine secretion assays following immune challenge.
- Screening: Enables assay standardization through consistent microglial yield, purity, and functional responsiveness after rotary shaker isolation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variables including TNF-α secretion levels and p65 nuclear localization for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects ex vivo microglial function to in vivo relevance through preserved immunophenotype and activation kinetics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microglial isolation workflow applicable across multiple CNS target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through preserved microglial immunophenotype and stimulus-responsive functionality.
- Operational Value: Standardized isolation via mechanical agitation yields reproducible microglial cultures with >95% purity and functional integrity.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuroimmunology screening by maintaining ex vivo microglial behavior indicative of in vivo states.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory targets based on validated target engagement in functional microglial assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal murine tissue dissection and sterile glial culture techniques.
- Dependent on temperature-controlled rotary shaker and inverted phase contrast microscopy for microglia isolation and verification.
- Necessitates standardization of meninges removal and culture duration (17–21 days) across teams to ensure microglial yield and purity.
- Adaptation to other model systems may require optimization of dissociation timing and microglial adhesion properties.
- Practical limitation: Microglial yield is contingent on complete meningeal tissue removal to prevent glial culture contamination.
