Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu
30 Ocak 2014
Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.
Bu prosedürün genel amacı, fare yenidoğanlarından kortikal mikroglia izole etmektir. Bu işlem, öncelikle fare yenidoğanlarından kortikal beyin dokusunun mikrodiseksiyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım, karışık glial hücre kültürlerinin in vitro ortamda 17 ila 21 gün boyunca büyütülmesidir.
Ardından, bu karışık glial kültürlerden mikroglialar izole edilir. Son adım, mikroglial hücrelerin daha ileri deneyler için hücre kültürü plaklarına ekilmesidir. Son olarak, bu izolasyon protokolünün mikroglial immünofenotipi ve fonksiyonelliği koruduğunu göstermek için immünofloresan mikroskopi ve Eliza kullanılır.
Mikrodissectionda kullanılan SEP'lerin uygulanması zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir. Bu prosedürün başarılı bir şekilde yürütülmesi hem hız hem de doğruluk gerektirir. Yani, çok yavaş olmak hücre veriminizi azaltırken, meningelerin eksik temizlenmesi glial kültürü kontamine edecek ve glial büyümeyi engelleyecektir.
Bundan sonra MCM olarak adlandırılan mikroglia tamamlayıcı besiyerini hazırlayarak başlayın. Yavru başına bir erlen hazırlayın ve bunları en az bir saat boyunca inkübe edin. Bu dengeleme adımı, başarının sağlanması için gereklidir.
Ardından, alikotları hazırlayın ve buz üzerinde soğutun. Gerekli tüm besiyerleri için, her pupa başına altı mililitre MCM alikotlayın ve diseksiyon öncesinde 37 °C'lik su banyosunda ısıtın. Yatay hava akımlı çalışma istasyonunu ve diseksiyon mikroskobunu %70 etanol ile silerek temizleyin.
Ardından, prosedür için gerekli olan sterilize edilmiş cerrahi aletleri çalışma alanına yerleştirin. Kafayı yakalamak için diseksiyon medyası içeren steril bir kap ve diseksiyon için başka bir kap hazırlayın. Beyin dokusunu kıymak için kıyma medyasını kendi kabına boşaltın.
Dekapitasyon ve beyin çıkarımının ardından, dorsal tarafın yukarıda ve kuru kaldığından emin olarak, ilgili bölgeleri görüntülemek için taze izole edilmiş beyni bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Pens uçlarını orta beyin ve korteks kesişimine yerleştirerek beyni sabitleyin. Yerleştiğinde, dorsal kortikal meningesleri tamamen temizleyin.
Ardından, mikroglia saflığını ve verimini maksimize etmek için ventral meningesleri çıkarın. Tüm meningeal dokunun tamamen temizlenmesi esastır. Korteksleri beynin geri kalanından ayırın.
Kortekslerin ventral veya medial tarafında bulunabilecek tüm kalıntı kortikal meningeslerin temizlendiğinden emin olun. Meningeal doku temizlendikten sonra, korteksleri daha önce hazırlanan doğrama kabına yerleştirin. Sınıf iki biyolojik güvenlik kabininde çalışarak, beyin dokusunu makasla doğrayın.
Doğranmış dokuyu 15 milimetrelik konik tüpe aktarın. Verimi maksimize etmek için hem makası hem de doğrama kabını birer mililitre doğrama medyası ile durulayın. Bu durulama sıvılarını toplayıp doğranmış dokunun bulunduğu 15 mililitrelik konik tüpe ekleyin.
Kıyılmış dokunun tüpün dibine çökmesi için doku süspansiyonunu bir ila iki dakika boyunca rahat bırakın. Bu sürenin ardından, çökmüş kıyılmış dokuyu bozmamaya dikkat ederek süpernatantın iki mililitresini dikkatlice alın ve atın. Kıyılmış dokunun üzerine önceden ısıtılmış üç mililitre MCM ekleyin ve ardından dokuyu güçlü bir şekilde trite edin.
Trier işlemi tamamlandığında geriye belirgin bir katı doku kalmamalıdır. Pipet ucunda kalan artık tritüre örneği toplamak için aynı pipet ucunu kullanarak üç mililitre daha MCM ekleyin. Toplandıktan sonra, hücreleri çöktürmek için kıyılmış dokuyu santrifüjleyin.
İşlem tamamlandığında, peletlenmiş hücreleri biyolojik güvenlik kabinine geri getirin. Süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın ve atın. Nazikçe resuspend edin.
Hücre peletini iki mililitre sıcak MCM ile süspande edin ve ardından hücre resüspansiyon süspansiyonunu daha önce hazırlanan flaska ekleyin. Hücreleri 24 saat boyunca inkübe edin. 24 saat sonra, doku kalıntılarını dağıtmak için flaskı el ayasına hafifçe vurun.
Hücrelerin içindeki kalıntıların tamamen temizlendiğinden emin olmak için vurma işleminden önce ve sonra hücreleri kontrol edin. Ardından, ortamı taze MCM ile değiştirin ve flaskı inkübatöre geri yerleştirin. Büyümeyi ve kontaminasyonu izlemek için hücreleri günlük olarak kontrol edin.
Yaklaşık 17 ila 21 gün sonra, mikroglial hücreler hasat için hazır olacaktır; hücrelerin hazır olup olmadığını belirlemek için onları ters faz kontrast mikroskobu altında inceleyin. Mikroglialar, yaklaşık %40 konfluens düzeyine ulaştıklarında, birbirlerinin üzerinde tek bir tabaka halinde büyüyen küçük, parlak küresel hücreler şeklinde görünürler ve hasat için hazırdırlar.
Mikrogliaları izole etmek için, flask laboratuvar tezgahına şiddetle vurulur. Bu çalkalama işlemi, mikrogliaların düşük yapışma özellikleri nedeniyle diğer glial hücrelerden ayrılmasına yardımcı olur. Flask kapakları paraform ile kapatılır ve karışık glial kültürler, sıcaklık kontrollü, nemlendirilmemiş bir döner çalkalayıcıda beş saat boyunca döndürülür.
Bu sürenin sonunda, mikrogliaların flask yüzeyinden ayrılıp ayrılmadığını görsel olarak kontrol edin. Ters faz kontrast mikroskobu altında mikroglialar, parlak, küresel ve serbest yüzen hücreler olarak görünür. Flaskın tabanına yapışık durumda kalan bir astrosit ve oligodendrosit tabakası olacaktır.
Ardından, mikroglia içeren süpernatantı steril konik bir santrifüj tüpüne toplayın ve paletleyin. Mikroglial peleti sıcak mikroglial büyüme ortamında süspande edin ve bir hemositometre plakası kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin. Hücreleri, plastik veya steril cam lameller üzerindeki 24 kuyucuklu plaka formatına ekin ve 24 saat bekletin.
Yüzen hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için besiyerini taze ve sıcak MGM ile değiştirin. Bu adım, hücrelerin hayatta kalması ve mikrogliaların kuiesan durumunun korunması için kritiktir; mikrogliaların saflığını değerlendirmek için hücreler bu yeniden besleme adımından hemen sonra deneylere hazır hale gelir. GFP'yi endojen olarak eksprese eden mikroglialardan türetilen hücre kültürleri, makrofaj antikoru IBA one ile boyanmış ve dapi ile karşıt boyama yapılmıştır.
Hücre çekirdeğini görselleştirmek için yapılan incelemede, hücrelerin %95'inden fazlası GFP IBA1 ve DPI kolokalizasyonu göstermiştir. LPS ile uyarıldıktan sonra mikroglialar, küçük bir bi fenotipinden ameboid benzeri bir şekle doğru belirgin bir morfolojik değişim geçirmiştir. P65 için yapılan immünohistokimyasal boyama, normal koşullar altında P65'in sitoplazma boyunca yaygın olarak lokalize olduğunu kanıtlamaktadır.
İzole edilmiş mikrogliaların biyokimyasal immünofonksiyonlarını koruduğunu doğrulamak için, Pam P 65'e iki saatlik maruziyetten sonra immünoreaktivite lokalizasyonu belirgin şekilde hücre çekirdeğine kaymıştır. PAM veya LPS maruziyeti sonrası pro-inflamatuar sitokin TNF alfa sekresyonu belirlenmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, en iyi sonuçlar için neonat farelerden kortikal mikroglia izolasyonunun nasıl yapılacağı konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olacaksınız.
Steril tekniğin korunması ve disekte edilen kortikal bölgedeki meningeal dokunun tamamen temizlenmesi önemlidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, işlem sırasında mikroglial immunofonksiyonun korunmasının önemini vurgulayarak, fare yenidoğanlarından kortikal mikroglia izolasyonu için bir prosedür tanımlamaktadır. İzolasyon yöntemi; beyin dokusunun mikrodiseksiyonunu, karışık glial hücrelerin kültürlenmesini ve ardından deneyler için mikrogliaların izole edilmesini içermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- İmmünoloji
Arka Plan
- Mikroglialar, merkezi sinir sisteminde (MSS) kritik bir rol oynar.
- İzolasyon yöntemleri, mikroglial hücrelerin fonksiyonelliğini etkileyebilir.
- İmmünofonksiyonun korunması, doğru deneysel sonuçlar elde etmek için esastır.
- Mikroglial aktivasyonu değerlendirmek için proinflamatuar stimüliler kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- Fare yenidoğanlarından mikroglia izole etmek için güvenilir bir protokol geliştirmek.
- İzole edilen mikrogliaların immunofenotiplerini ve fonksiyonelliklerini korumalarını sağlamak.
- Mikroglial biyolojisi üzerine yapılacak ileri düzey deneyleri kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Yenidoğan farelerden kortikal beyin dokusunun mikrodiseksiyonu.
- Karışık glial hücrelerin in vitro ortamda 17 ila 21 gün boyunca kültüre edilmesi.
- Karışık glial kültürlerden mikroglia izolasyonu.
- Mikroglial fonksiyonelliği değerlendirmek için immünofloresan mikroskopi ve ELISA kullanımı.
Temel Sonuçlar
- İzolasyon protokolü, yüksek saflıkta mikroglial kültürler sağlar.
- Mikroglialar, izolasyon sonrası immünofonksiyonel özelliklerini korurlar.
- LPS ve Pam 3 CSK 4 ile aktivasyon, fonksiyonelliğin korunduğunu göstermektedir.
- Floresan görüntüleme ve immünositokimya sonuçları doğrulamaktadır.
Sonuçlar
- Tanımlanan izolasyon yöntemi, fonksiyonel mikroglia elde etmek için etkilidir.
- İmmünofonksiyonun korunması, mikroglia biyolojisini incelemek için kritiktir.
- Bu protokol, mikroglia ile ilgili çeşitli deneysel düzeneklere uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
Fare neonatlarından fonksiyonel mikroglia izolasyonu, immünofenotipi ve inflamatuar stimülilere olan yanıt verebilirliği koruyarak nöroimmünoloji hedef validasyonunda mekanistik risk azaltmaya olanak tanır. Bu ex vivo model, MSS hastalık yollarıyla ilişkili sükunet ve aktivasyon durumlarını sürdürerek erken keşif aşamasındaki öngörü güvenilirliğini destekler. Söz konusu yöntem, immünomodülatör bileşiklerin taranması ve preklinik iş akışlarında hedef etkileşiminin değerlendirilmesi için hastalıkla ilişkili bir sistem sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: LPS ve Pam3CSK4 uyaran deneyleri aracılığıyla mikroglial aktivasyon yolaklarının sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: NF-κB p65 nükleer translokasyonu ve TNF-α sekresyon fonksiyonelliği korunmuş, yüksek saflıkta kortikal mikroglia sağlar.
- Öngörücü Değer: Sessiz durumdan proinflamatuar durumlara kadar immünofenotipik sadakati koruyarak hedef hipotez testlerini destekler.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bilimsel Değer: Glial kültür olgunlaşmasının 17–21 gün ardından, bileşik tarama işlemleri için standartlaştırılmış bir mikroglial tek katman sistemi sağlar.
- Operasyonel Değer: IBA-1/GFP kolokalizasyonu (>%95) aracılığıyla mikroglial saflığın kantifikasyonuna ve sitokin salınımı gibi fonksiyonel okumalara olanak tanır.
- Analiz Hazırlığı: İzole edilen mikroglialar, stimülilere karşı morfolojik ve fonksiyonel yanıtlar sergileyerek güvenilir doz-yanıt profillemesine imkan verir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Değer: Mikroglial fonksiyonelliği ex vivo koruyarak, nöroinflamatuar hedeflerin keşfinden preklinik validasyonuna kadar olan sürecin sürekliliğini destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Hedef aracılı yolak modülasyonunu değerlendirmek için kritik olan biyokimyasal fonksiyonelliği (NF-κB sinyalizasyonu, TNF-α salınımı) korur.
- Hastalık İlişkisi: Nörodejeneratif ve nöroinflamatuar hastalık araştırmaları için uygulanabilir olan dinlenme ve aktive olmuş mikroglia durumlarını modeller.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu izolasyon yöntemi, nöroimmünolojide etki mekanizması çalışmaları ve fenotipik tarama için tekrarlanabilir bir mikroglial platform sağlayarak, hedef doğrulamadan öncü bileşik belirlemeye kadar uzanan keşif sürecine uyum sağlamaktadır.
- Keşif Biyolojisi: İmmün challenge sonrası NF-κB translokasyonu ve sitokin salgılama analizleri aracılığıyla yolakların aydınlatılmasını destekler.
- Tarama: Rotary shaker izolasyonu sonrası tutarlı mikroglial verim, saflık ve fonksiyonel yanıt kapasitesi ile analiz standardizasyonuna olanak tanır.
- Analitik: Karşılaştırmalı durum analizleri için TNF-α salgılama seviyeleri ve p65 nükleer lokalizasyonu dahil olmak üzere kantitatif bağımlı değişkenler oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Korunan immünofenotip ve aktivasyon kinetiği aracılığıyla ex vivo mikroglial fonksiyonu in vivo uygunlukla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla MSS hedef doğrulama kampanyasında uygulanabilecek, yeniden kullanılabilir bir mikroglial izolasyon iş akışı kurar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Korunmuş mikroglial immünofenotip ve stimülüse yanıt veren fonksiyonellik aracılığıyla hedef doğrulamada öngörücü güven.
- Operasyonel Değer: Mekanik ajitasyon yoluyla standartlaştırılmış izolasyon, >95% saflık ve fonksiyonel bütünlüğe sahip tekrarlanabilir mikroglial kültürler sağlar.
- Stratejik Değer: In vivo durumları gösteren ex vivo mikroglial davranışı koruyarak nöroimmünoloji taramasındaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Portföy Etkisi: Fonksiyonel mikroglial analizlerde doğrulanmış hedef etkileşimine dayanarak, immünomodülatör hedeflerin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini mümkün kılar.
Uygulama Hususları
- Yenidoğan fare doku diseksiyonu ve steril glial kültür teknikleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Mikroglia izolasyonu ve doğrulaması için sıcaklık kontrollü döner çalkalayıcıya ve ters faz kontrast mikroskobuna bağımlıdır.
- Mikroglial verim ve saflığı sağlamak için ekipler arasında meningeslerin uzaklaştırılmasının ve kültür süresinin (17–21 gün) standardize edilmesi gerekir.
- Diğer model sistemlere adaptasyon, disosiyasyon zamanlamasının ve mikroglial adezyon özelliklerinin optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlama: Mikroglial verim, glial kültür kontaminasyonunu önlemek için meningeal dokunun tamamen uzaklaştırılmasına bağlıdır.
