Membran Kutup, Membran Dürüstlük ve Hücre içi İyon Konsantrasyonlarında İzleme değişiklikler Streptococcus pneumoniae Floresan boyalar kullanarak

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir bakteri sistemindeki zar dinamikleri ve hücre içi iyon konsantrasyonlarındaki değişiklikleri izlemek için floresan boyaları kullanmaktır. Bu, bakterilerin büyüme aşamaları sırasında, zarları boyunca dengelenene kadar ilgilenilen flor ile ilk kez kuluçkaya yatırılmasıyla elde edilir. Daha sonra, bakteriler tercih edilen ajan ile muamele edilir ve floresansları izlenir.

Sonuçlar, indikatör boyaların floresansında gözlenen değişikliklere bağlı olarak membran depolarizasyonu, membran bütünlüğü ve hücre içi iyon konsantrasyonlarındaki değişiklikleri gösterebilir. Bu tekniğin ökaryotik sistemlerde kullanılan yama klempleme gibi geleneksel elektrofizyoloji tekniklerine göre en büyük avantajı, zar dinamikleri ve hücre içi iyon konsantrasyonlarındaki değişikliklerin artık bakterilerde floresan kullanılarak izlenebilmesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü boya konsantrasyonlarını optimize etmek biraz çaba gerektirir.

Yükleme koşulları ve algılama ayarları Bakteri hücreleri ile başlayın. Yıkama çözeltisinde yeni peletlenmiş, önce peleti mililitre başına 100 milyon CFU için en az bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin, bu da beş numune için yeterlidir. Yıkanmış hücrelerin bir mililitresini bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 25 mikrolitre bir molar filtre ekleyin.

Sterilize edilmiş stok glikoz çözeltisi daha sonra hücreleri 37 santigrat derecelik bir ısıtma bloğunda 15 dakika inkübe edin. Eklenen glikoz deneye bağlı olarak değişebilir. 15 dakika sonra, 50 mikromolar geri dönüşten beş mikrolitre ve 10 mikrolitre PI çözeltisi ekleyin.

Hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Daha sonra bu hücre süspansiyonunu net bir 96 kuyulu plakanın beş numune kuyucuğuna bölün. Plakayı, geri dönüş NP algılaması için bir ön ısıtma plakası okuyucu setine yükleyin.

Şimdi, okuma ön işlem değerlerine stabilize olana kadar 30 ila 40 dakika boyunca dakikada bir kez ölçüm yaparak hücre zarları üzerindeki geri dönüş dengesini izleyin. Ardından plakayı çıkarın ve tercih ettiğiniz deneysel ajanı ekleyin. Plakayı hemen okuyucuya geri koyun ve istenen süre boyunca geri dönüş ve PI floresansını izlemeye devam edin.

Bu prosedür için yükleme tamponunu hazırlarken, PBS ve Probenecid'i eklemeden önce kısa bir süre girdap yaptığınızdan emin olun. Bu çözeltileri ekledikten sonra, tekrar vorteksleyin ve bir mililitre iki x hücreli süspansiyona folyoya sarın. Bir mililitre iki x yükleme tamponu ekleyin.

Bu 10 numune için yeterlidir. Karışımı 37 santigrat derece su banyosunda 75 dakika boyunca inkübe edin, tüm bu tahliller boyunca ışıktan koruyun. Spesifik bakteri türlerine ve diğer deneysel sistem değişkenlerine bağlı olarak, testi ve temel floresan algılama seviyesini optimize etmek için boya konsantrasyonunun ve inkübasyon süresinin ayarlanması gerekebilir.

İnkübasyondan sonra, hücreleri her yıkama için üç kez yıkayın. Hücreleri 10 dakika boyunca 2.400 Gs'de pelet haline getirin ve bir x pronik içeren iki mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Üç yıkamadan sonra, hücreleri 37 santigrat derecede 30 dakika daha inkübe edin.

Bu, bakteri içindeki estro'nun boyanın ester gruplarını hidrolize etmesini sağlayarak boyayı hücre içinde aktif hale getirir. Daha sonraki pelet, hücreler snat'ı çıkarır ve bunları bir x Probenecid içeren iki mililitre PBS'de askıya alır. Gerekirse, bakterilere yeniden enerji vermek için glikoz şimdi geri eklenebilir 200 mikrolitre hücre, her numune için 96 oyuklu bir plakanın bir kuyusuna yüklenir ve plakayı bir numunede bir ön ısıtma okuyucusuna yükler.

Öncelikle, uygun dalga boylarında ve bir dakika boyunca saniyede bir okuma hızında bir temel okuma oluşturun. Sonra plakayı çıkarın ve tercih edilen tedaviden yaklaşık beş mikrolitre ekleyin. Bunun için.

İşlemi karıştırmak için birkaç kez hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyin ve plakayı hemen okuyucuya geri koyun. İstenilen süre boyunca ölçüm yapmaya devam edin. Verileri analiz etmek için, değeri bir değere iki değere bölerek her bir zaman noktası için floresan değerlerin oranını hesaplayın ve oran değerlerini bir grafik üzerinde çizin.

Hazırlık olarak, pH değerleri 6.5 ila 8.0 arasında olan beş veya altı yüksek potasyum tamponu aralığı oluşturun. Önceki prosedürde olduğu gibi, iki x yükleme tamponunu bir orta log faz kültür yıkamasından hazırlamak ve hücreleri konsantre etmek için bir girdap kullanın. Ardından SNAT'ı iki mililitre BS ile değiştirin Dört x hücreli süspansiyon yapmak için.

Dört x hücreli süspansiyonun bir mililitresini iki x yükleme tamponunun bir mililitresi ile birleştirin. Şimdi hücreleri 30 santigrat derece su banyosunda 40 dakika inkübe edin. Işıktan koruyun.

Şimdi hücreleri üç kez yıkayın. Hücreleri daha önce gösterildiği gibi peletleyin. İki x prop Benin ve bir milimolar glikoz içeren dört mililitre PBS ekleyin ve üç yıkamadan sonra santrifüjlemeyi tekrarlayın.

Hücreleri 37 santigrat derecede beş dakika daha inkübe edin. Arka plan floresan filtresini belirlemek için, bakterileri uzaklaştırmak için yaklaşık 500 mikrolitre enerjili bakteri süspansiyonunu sterilize edin. Daha sonra 200 mikrolitre filtratı 96 Kuyulu bir plakaya aktarın ve bu kuyudan emilimi bir dakika boyunca ölçün.

Bir in vivo kalibrasyon eğrisi elde etmek için, yüklü ve enerjili hücrelerin 500 mikrolitre ALI watt'ını aşağı döndürün ve yeniden canlandırın. Bunları her numuneye farklı pH'lı bir dizi yüksek potasyum tamponunda süspanse edin, 20 mikromolar risin ekleyin. Bu, hücrelerin hücre içi pH'ını çevreleyen tamponun pH'ına dengeler.

Daha sonra numuneleri 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneleri plaka okuyucudaki 96 Kuyulu plakaya aktarın. Her biri için bir çalışma okuması oluşturmak için her numunenin floresansını birkaç dakika ölçün. Kuyu.

Bu verileri analiz etmek için, arka plan floresan değerlerini çıkarın ve ardından değeri bölerek floresan değerlerinin oranını hesaplayın. Hücre içi pH'daki değişiklikleri ölçmek için kalibrasyon eğrisini oluşturmak üzere her bir pH tamponunun oran değerlerini birer birer çizin. Enerji verilmiş hücrelerin 200 mikrolitrelik örneklerini bir plakaya yükleyin ve floresansı beş dakika boyunca her beş saniyede bir ölçün.

Eşzamanlı olarak, ilgilenilen ajanları diğer numunelere eklerken bir numuneye 10 mikromolar CCCP ekleyin. CCCP, hücre içi pH'ı azaltmak için zamana göre ayarlanmış bir pozitif kontroldür. Plakayı hemen okuyucuya geri koyun ve 10 dakika boyunca her beş saniyede bir floresan ölçmeye devam edin.

Ek bir kontrol olarak, bakterilerin pH'ını beş dakika daha tamponun pH'ına dengelemek için tüm numunelere 20 mikro azı dişi NI garnizonu ekleyin. Membran polaritesini keşfederken, boyanın membran üzerinde dengelenmesine izin vermek için bakterilerin yaklaşık 40 dakika boyunca kalıp geri döndürülerek inkübe edilmesi gerekir. Bu, seviyelenen floresandaki sürekli azalma ile gösterilir.

PI dengeleme gerektirmez, ancak geri dönüş ile birlikte, membran yırtılmasının izlenmesi için yararlıdır. Polarite ile eş zamanlı olarak, bakterilerin depolarizasyonu ve yırtılması, her iki boyanın floresan yoğunluğunda bir artış ile gösterilir, daha az 2:00 için iki floresan sinyalin oranı hesaplanır ve bu orandaki bir artış veya azalma hücre içi kalsiyuma karşılık gelir. PBFI için hücre içi potasyum floresan oranları ile ölçülür.

Hücre içi hidrojen, B-C-E-C-F floresan oranları kullanılarak ölçülür. Kalsiyum iyono, dört iyon, misin ilavesi üzerine, kalsiyum hücreye akar ve floresan oranının artmasına neden olur. Valmy ilavesi, potasyumun hücreden dışarı akmasına neden olan ters etkiye sahiptir, bu da floresan oranında bir azalma ile gösterilir.

B-C-E-C-F, hücre içi pH ölçümüne izin verir, önce kalibrasyon eğrileri bilinen pH'ın çeşitli tamponlarında yapılır. Boyanın floresan oranındaki bir azalma, pH'daki bir azalmaya karşılık gelir. Bu, CCCP kuvvetinin protonunun, siyah çizginin ve bir proton hareket kuvveti dağıtıcısının eklenmesinden sonra mavi çizginin eklenmesiyle görülür.

İkinci ok, hücre içi ve hücre dışı hidrojen konsantrasyonlarını dengeleyen nissin ilavesini gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, bakteri hücrelerinde zar depolarizasyonunu, zar bütünlüğünü ve hücre içi iyon konsantrasyonlarını nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu protokolü, diğer özellikleri ve bakteri hücrelerini incelemek için bir başlangıç noktası olarak da kullanabilmeniz gerekir.