Membran Kutup, Membran Dürüstlük ve Hücre içi İyon Konsantrasyonlarında İzleme değişiklikler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir bakteriyel sistemde membran dinamiklerindeki ve hücre içi iyon konsantrasyonlarındaki değişimleri izlemek için floresan boyaları kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle bakterilerin büyüme aşamasındayken, ilgili flor membranlar boyunca dengelenene kadar inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, bakteriler seçilen ajan ile işleme tabi tutulur ve floresansları izlenir.

Sonuçlar, indikatör boyaların floresanında gözlemlenen değişimlere dayanarak membran depolarizasyonundaki, membran bütünlüğündeki ve hücre içi iyon konsantrasyonlarındaki değişiklikleri gösterebilir. Bu tekniğin, ökaryotik sistemlerde kullanılan patch clamping gibi geleneksel elektrofizyoloji tekniklerine göre temel avantajı, membran dinamiğindeki ve hücre içi iyon konsantrasyonlarındaki değişimlerin artık bakterilerde floresan kullanılarak izlenebilmesidir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, boya konsantrasyonlarını optimize etmek çaba gerektirdiği için zorluk yaşayacaklardır.

Yükleme koşulları ve tespit ayarları Bakteri hücreleri ile başlayın. Yıkama solüsyonunda yeni çöktürülmüş pellet'i, mililitre başına 100 milyon CFU olacak şekilde en az bir mililitre PBS içinde yeniden süspande edin; bu miktar beş örnek için yeterlidir. Yıkanmış hücrelerden bir mililitreyi bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 25 µL 1 M filtre ekleyin.

Sterilize edilmiş glikoz stok çözeltisini ekleyin ve ardından hücreleri 37 °C'lik bir ısıtma bloğunda 15 dakika boyunca inkübe edin. Eklenen glikoz miktarı deneye göre değişiklik gösterebilir. 15 dakika sonra, 5 µL 50 µM dieback ve 10 µL PI çözeltisi ekleyin.

Hücreleri birkaç kez pipetleyerek iyice karıştırın. Ardından, bu hücre süspansiyonunu şeffaf bir 96 kuyucuklu plakanın beş örnek kuyucuğuna paylaştırın. Plakayı, dieback NP tespiti için ayarlanmış, önceden ısıtılmış bir plaka okuyucuya yerleştirin.

Şimdi, okumalar işlem öncesi değerlerine sabitlenene kadar 30 ila 40 dakika boyunca dakikada bir ölçüm alarak hücre membranları üzerindeki dieback dengelenmesini izleyin. Ardından plakayı dışarı çıkarın ve seçilen deneysel ajanı ekleyin. Plakayı hemen okuyucuya geri yerleştirin ve istenen süre boyunca dieback ile PI floresansını izlemeye devam edin.

Bu prosedür için yükleme tamponu hazırlanırken, PBS ve Probenecid eklemeden önce kısa süre vortexleyiniz. Bu çözeltileri ekledikten sonra tekrar vortexleyin ve iki x hücre süspansiyonunun bir mililitresini folyoyla sarın. Bir mililitre iki x yükleme tamponu ekleyin.

Bu miktar 10 örnek için yeterlidir. Tüm bu analizler boyunca, karışımı 37 derece Celsius su banyosunda, 75 dakika boyunca ışıktan koruyarak inkübe edin. Spesifik bakteri türüne ve diğer deneysel sistem değişkenlerine bağlı olarak, analizi ve bazal floresan tespit seviyesini optimize etmek için boya konsantrasyonunun ve inkübasyon süresinin ayarlanması gerekebilir.

İnkübasyon sonrası, hücreleri her yıkama için üç kez yıkayın. Hücreleri 2.400 Gs'de 10 dakika boyunca pelletleyin ve bir x pronic içeren iki mililitre PBS içinde yeniden süspande edin. Üç yıkamanın ardından, hücreleri 37 °C'de 30 dakika daha inkübe edin.

Bu, bakterinin içindeki estro'nun boyanın ester gruplarını hidrolize ederek boyayı hücre içinde aktif hale getirmesini sağlar. Ardından hücreleri çöktürün, snat'ı uzaklaştırın ve hücreleri 1x Probenecid içeren iki mililitre PBS içinde yeniden süspande edin. Gerektiğinde, bakterileri yeniden enerjiyle yüklemek için glikoz tekrar eklenebilir; her örnek için hücrelerden 200 mikrolitre'yi 96 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna yükleyin ve plakayı önceden ısıtılmış bir okuyucuya yerleştirin.

Öncelikle, uygun dalga boylarında ve bir dakika boyunca saniyede bir okuma hızında bir bazal okuma değeri belirleyin. Ardından plakayı çıkarın ve seçilen işlemden yaklaşık beş µL ekleyin. Buna.

Tedaviyi karıştırmak için pipetle hızlıca birkaç kez yukarı aşağı çekin ve plakayı hemen okuyucuya geri yerleştirin. İstenilen süre boyunca ölçüm almaya devam edin. Verileri analiz etmek için, her zaman noktası için birinci değerin ikinci değere bölünmesiyle floresan değerlerinin oranını hesaplayın ve oran değerlerini bir grafik üzerinde gösterin.

Hazırlık aşamasında, pH değerleri 6.5 ile 8.0 arasında değişen beş veya altı farklı yüksek potasyumlu tampon çözelti hazırlayın. Önceki prosedürde olduğu gibi, mid-log fazındaki bir kültür yıkamasından 2x yükleme tamponu hazırlamak ve hücreleri konsantre etmek için bir vorteks kullanın. Ardından, 4x hücre süspansiyonu oluşturmak için SNAT'ı iki mililitre BS ile değiştirin.

Bir mililitre dört x hücre süspansiyonunu, bir mililitre iki x yükleme tamponu ile birleştirin. Ardından hücreleri 30 °C'lik bir su banyosunda 40 dakika boyunca inkübe edin. Işıktan koruyun.

Şimdi hücreleri üç kez yıkayın. Hücreleri daha önce gösterildiği gibi peletleyin. Üç yıkamanın ardından, iki x prop Benin ve 1 mM glukoz içeren 4 mL PBS geri ekleyin ve santrifüj işlemini tekrarlayın.

Hücreleri 37 °C'de beş dakika daha inkübe edin. Arkaplan floresans filtresini belirlemek için, bakterileri uzaklaştırmak amacıyla enerjize edilmiş bakteri süspansiyonunun yaklaşık 500 µL'sini sterilize edin. Ardından, filtrattan 200 µL'yi bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın ve o kuyucuğun absorbsiyonunu bir dakika boyunca ölçün.

İn vivo bir kalibrasyon eğrisi elde etmek için, yüklü ve enerjilendirilmiş hücrelerden 500 µL santrifüjle çöktürün ve yeniden süspanse edin. Hücreleri, her bir örneğe farklı pH değerlerinde bir dizi yüksek potasyumlu tampon içine süspande edin ve her birine 20 µM risin ekleyin. Bu işlem, hücrelerin hücre içi pH değerini çevreleyen tamponun pH değerine eşitler.

Ardından numuneleri 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından numuneleri plaka okuyucudaki 96 kuyucuklu plakaya aktarın. Her bir kuyucuk için çalışma okuması oluşturmak amacıyla her numunenin floresansını birkaç dakika boyunca ölçün.

Bu verileri analiz etmek için arka plan floresans değerlerini çıkarın ve ardından birinci değeri ikinci değere bölerek floresans değerlerinin oranını hesaplayın; hücre içi pH'daki değişimleri ölçmek amacıyla kalibrasyon eğrisi oluşturmak için her pH tamponu için oran değerlerini grafiğe dökün. Enerjize edilmiş hücrelerden 200 µL'lik örnekleri bir plakaya yükleyin ve beş dakika boyunca her beş saniyede bir floresansı ölçün.

Bir örneğe 10 micromolar CCCP eklerken, diğer örneklere ilgilenilen ajanları eş zamanlı olarak ekleyin. CCCP, hücre içi pH'ın düşürülmesi için zamanla hizalanmış bir pozitif kontroldür. Plakayı hemen okuyucuya geri yerleştirin ve 10 dakika boyunca her beş saniyede bir floresans ölçümüne devam edin.

Ek bir kontrol olarak, bakterilerin pH değerini beş dakika daha tampon çözeltinin pH değerine eşitlemek için tüm örneklere 20 µM NI garrison ekleyin. Membran polaritesi incelenirken, boyanın membran üzerinden dengelenmesini sağlamak için bakterilerin die back ile yaklaşık 40 dakika inkübe edilmesi gerekir. Bu durum, floresansın sabit bir seviyeye gelene kadar istikrarlı bir şekilde azalmasıyla belirlenir.

PI dengeleme gerektirmez, ancak dieback ile birlikte membran yırtılmasının izlenmesine yardımcı olur. Polarite ile eş zamanlı olarak, bakterilerin depolarizasyonu ve yırtılması, her iki boyanın floresan yoğunluğundaki artışla belirtilir; saat 02:00'den önce iki floresan sinyalin oranı hesaplanır ve bu orandaki artış veya azalış hücre içi kalsiyuma karşılık gelir. PBFI için hücre içi potasyum, floresan oranları ile ölçülür.

Hücre içi hidrojen, B-C-E-C-F am'in floresans oranları kullanılarak ölçülür. Kalsiyum ionofor iyonomisin eklendiğinde, kalsiyum hücre içine akarak floresans oranında bir artışa neden olur. Valinomisin eklenmesinin ise ters etkisi vardır; potasyumun hücre dışına akmasına yol açar ve bu durum floresans oranındaki bir azalma ile belirtilir.

B-C-E-C-F, hücre içi pH ölçümüne olanak tanır; ilk kalibrasyon eğrileri, pH değerleri bilinen çeşitli tampon çözeltilerde oluşturulur. Boyanın floresan oranındaki azalma, pH'daki bir azalmaya karşılık gelir. Bu durum, proton kuvveti CCCP eklendiğinde siyah çizgide ve proton motive kuvveti dağıtıcısı eklendikten sonra mavi çizgide görülmektedir.

İkinci ok, hücre içi ve hücre dışı hidrojen konsantrasyonlarını dengeleyen nissin eklemesini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, bakteriyel hücrelerde membran depolarizasyonu, membran bütünlüğü ve hücre içi iyon konsantrasyonlarının nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ayrıca, bu protokolü diğer özellikleri ve bakteriyel hücreleri incelemek için bir başlangıç noktası olarak kullanabilmelisiniz.