Mühendislik Fibrin tabanlı Doku miyofibroblastlar ve Kısıtlar Uygulamasından Yapıları ve Hücre ve Kollajen (Re) Organizasyon tetikleyebilecek süzün

Bu prosedürün genel amacı, hücre ve kollajen yeniden organizasyonunu incelemek için kullanılabilecek fibrin bazlı yapılar oluşturmaktır. Bu, önce insan venöz safen hücrelerinin donör dokudan izole edilmesi ve kültürde genişletilmesi ile gerçekleştirilir. İkinci adım, Velcro şeritleri esnek membranlara yapıştırmaktır.

Altı kuyu plakasının dibinde, yapıyı tutacak olan merkezde kare bir alan oluşturmak için. Daha sonra, cırt cırtlı şeritler arasındaki boşluğa fibrinojen, trombin hücreleri ve floresan etiketli boncukların bir karışımı eklenir ve bir jel oluşturmak için polimerize olmasına izin verilir. Son adım, hücreleri koşullandırmak ve yapıya tek eksenli bir döngüsel gerinim uygulayarak veya statik gerilimi serbest bırakarak yönlendirilmiş matris oluşumunu indüklemektir.

Fibrin jelini Velcro direklerinden tek bir yönde keserek. Sonuç olarak, konfokal mikroskopi kullanılarak yapıları zaman içinde izleyerek hücresel ve kollajen yeniden yapılanmasındaki değişiklikleri tanımlayan sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, kollajen yeniden şekillenme alanında, kollajen oluşum hızı ve farklı hücre tipleri tarafından yeniden yönlendirme ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Başlamak için, materyalin ikincil kullanımına ilişkin yönergelere uygun olarak venöz saana magna'dan insan donör dokusu alın. Daha sonra Schnell ve arkadaşlarının protokolünü takip ederek insan venöz safen hücrelerini veya H VSC'leri dokudan izole edin ve bunları sıvı nitrojen içinde saklayın. Gerektiğinde, 250.000 hızlı çözülme H VSC'leri içeren bir şişeyi 15 mililitre ön ısıtma büyümesi olan bir T 75 şişesine yerleştirerek hücreleri genişletin.

440 mililitre gelişmiş DMEM, 50 mililitre fetal sığır serumundan oluşan ortam. Beş mililitre 100 X kalem streptokok ve beş mililitre 200 milimolar L glut maks. Hücreler birleşene kadar yaklaşık iki hafta boyunca her iki ila üç günde bir büyüme ortamını değiştirin.

Bir kez birleştikten sonra, hücreleri pasaja kadar hasat edin ve bölün. Dokuz. Planlanan deney için yeterli sayıda hücre olana kadar tripsin kullanmak. Her yapı için yaklaşık 1,5 milyon hücre gereklidir.

Yeterli sayıda hücre büyütüldüğünde, bunları %90 co akıcılığında hasat edin ve ardından hücreleri mililitre başına 15 milyon hücrede büyüme ortamında askıya alın. İhtiyaç duyulana kadar buzun üzerine koyun. Elastomer ve sertleştirici maddeyi 10'a bir oranında karıştırarak silikon yapıştırıcı hazırlayın.

Velcro'nun yumuşak tarafından yakalanan yedi milimetreye üç milimetrelik şeritleri esnek hücre plakalarının esnek zarına tutturmak için bu yapıştırıcıyı kullanın. Açık merkezli bir çapraz şekil oluşturmak için, yapıştırıcının sertleşmesini sağlamak için silikon yapıştırıcıyı gece boyunca 60 derecelik bir fırında kurutun. Daha sonra, her bir oyuğa beş mililitre% 70 etanol ekleyerek ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ederek plakayı sterilize edin.

Kuyuları steril PBS ile üç kez durulayın. Ardından PBS'yi kuyucuklardan ve Velcro şeritlerinden çıkarın. Yüzeyleri sterilize etmek için plakayı 30 dakika boyunca bir doku kültürü başlığının UV lambasının altına üstü açık olarak yerleştirin.

Bitirdikten sonra plakayı örtün ve kullanana kadar steril tutun. Daha sonra, kültürün ilk yedi günü boyunca 500 mililitre büyüme ortamına 130 miligram allik asit, iki fosfat ekleyerek doku mühendisliği ortamını hazırlayın. Ayrıca, fibrinin bozulmasını önlemek için mililitre epsilon aminokaproik asit başına bir miligram ekleyin, fibrinojeni mililitre doku mühendisliği ortamı başına 10 miligram gerçek protein konsantrasyonuna çözün Hafifçe karıştırarak aminokaproik asit ile takviye edin.

Sonra steril. Fibrinojen çözeltisini 0.22 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün ve kullanana kadar buz üzerinde saklayın. Daha sonra, aminokaproik asit ile takviye edilmiş doku mühendisliği ortamında stok trombini mililitre başına 10 uluslararası birimlik nihai konsantrasyona seyrelterek trombin çözeltisini hazırlayın ve kullanılana kadar buz üzerinde saklayın.

Daha sonraki adımda, yapılacak her doku yapısı için bir mikro santrifüj tüpüne daha önce hazırlanmış 100 mikrolitre hücre süspansiyonu. Hücreleri yedi dakika boyunca 350 kez G'de santrifüjleyin ve daha sonra süpernatanı atın, hücreleri 50 mikrolitre trombin çözeltisinde yeniden süspanse edin ve iç referans belirteçleri olarak kullanılmak üzere dört mikrolitre, mavi bir floresan polistiren mikroküre ekleyin. Daha sonra, 50 mikrolitre fibrinojen çözeltisini bir pipet ucuna çekin.

Pipetin hacmini 100 mikrolitreye yükseltin ve ardından 50 mikrolitrelik fibrinojen çözeltisini santrifüj tüpüne pipetleyin. Trombin ve hücre karışımı ile, kabarcık oluşumunu önlemek için 100 mikrolitrelik karışımı çekerek trombin ve fibrinojeni nazikçe karıştırın. Çözelti iyice karıştırıldıktan sonra, jel karışımını Velcro şeritlerinin içine ve arasına pipetleyin, fibrin jelleri için tipik jelian süresi kadar hızlı bir şekilde oluruz, bir kez karıştırıldıktan sonra 20 saniye mertebesindedir, yapıları 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin Jelleşmelerine izin vermek için nemlendirilmiş% 5 karbondioksit tamponlu inkübatörde.

Daha sonra her bir oyuğa aminokaproik asit içeren altı mililitre doku mühendisliği ortamı ekleyin ve plakayı tekrar inkübatöre yerleştirin. Medyayı ilk yedi gün boyunca her iki ila üç günde bir değiştirin. Bir hafta sonra, aminokaproik asit takviyesini ortamdan çıkarın ve jelleri doku mühendisliği ortamı ile kültürlemeye devam edin.

Kültürde ilk beş gün boyunca her iki ila üç günde bir değiş tokuş edilmesi, yapıların statik koşullar altında kollajen yeniden organizasyonunu indüklemek için lif kısıtlamaları nedeniyle iki eksenli olarak kollajen lifleri oluşturan statik zorlanma altında sıkışmasına ve yeniden düzenlenmesine izin verir. İlk olarak, hücreleri 12. günde bir hafta daha kültürleyin, doku yapısını iki Velcro şeridinden tek bir yönde gevşetin. Bu, fibrin sıkışırken ters yönde gerilmeye neden olur.

Alternatif olarak, döngüsel yükleme için, plakaları, altıncı günde bir conta ile donatılmış bir esnek hücre taban plakasındaki bir dizi yükleme direğinin üzerine yerleştirin, yükleme direkleri kuyuların esnek zarını destekleyecek ve direklerin tabanının tek bir yönde gerilme oluşturmak için aşağı çekilmesine izin verecektir. Ardından, yapıya döngüsel bir gerinim uygulamak için yazılım protokolünü ayarlayın. Burada gösterilen program, üç saatlik dinlenme ile dönüşümlü olarak, yapıyı üç saatlik periyotlar boyunca bir hertz'de sıfırdan %5'e kadar geren, bir sinüs dalgasına benzeyen aralıklı gerinim içindir.

Program hazırlandıktan sonra vakum pompasını açın ve programı başlatın. Kontrolör, programa uygun olarak yapılara döngüsel gerinim uygulamak için destek direklerinin etrafındaki zarları aşağı çeken sistemdeki vakum kuvvetini düzenleyecektir. Programı bir hafta boyunca çalıştırın, ortamı her iki ila üç günde bir değiştirmeye özen gösterin, bir haftalık şartlandırmadan sonra, üç gün boyunca gerilme yönünü değiştirmek için dikdörtgen direği 90 derece döndürerek kollajen yeniden organizasyonunu indükleyin.

Aktif gerçek zamanlı kollajen yeniden şekillenmesini görselleştirmek için hücre izleyici turuncu ekleyin. Sitoplazmayı ve CNA 35 OG 4 88'i boyamak için dört mikromolar konsantrasyon ekleyin. Kollajen liflerini görselleştirmek için bir mikromolar konsantrasyon ekleyin.

Bu problar hücre canlılığına veya kollajen oluşumuna müdahale etmeyecektir. Daha sonra hücreleri 37 santigrat derecede bir inkübatörde bir saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, kültür plakasını inkübatörden çıkarın ve hücreleri ve kollajeni görselleştirmek için konfokal bir lazer tarama mikroskobuna taşıyın.

Zaman içinde bu seviyelerdeki organizasyondaki değişiklikleri görmek için yüzeydeki ve iskeleye yaklaşık 60 mikrona kadar olan jellerin görüntülerini çekin. Ardından plakayı inkübatörün içindeki mekanik koşullandırma kurulumuna geri koyun. Uyaranlara yanıt olarak hücresel yeniden yapılanmanın ilerlemesini izlemek için bu prosedürü birkaç günde bir tekrarlayın.

Polimerizasyondan önce fibrinojen karışımına eklenen floresan mikro kürecikler, fibrin ağında sıkışıp kalır ve statik koşullar altında kültürlendiğinde aynı alanın farklı zaman noktalarında görselleştirilmesini sağlamak için referans belirteçleri olarak iyi çalışır ve dört direğin tümüne bağlanır. Fiber direk bağlantılarından ikisinin kesilmesinden üç gün sonra gerçek bir fiber veya hücresel oryantasyon görülemez. Kasılmanın neden olduğu tek eksenli gerilme, yeşil renkle gösterilen kollajen liflerini hizalamıştır.

Bir hafta boyunca tek bir yönde döngüsel olarak süzülen insan venöz safen hücreleri burada yapının yüzeyinde ve jelin 60 mikronunda gösterilmiştir. Gerilme yönü 90 derece döndürüldüğünde, üç gün sonra hücresel yanıtın yüzeyde dokunun çekirdeğinden daha hızlı olduğu bulundu. Mühendisliğe hakim olduktan sonra, bu FI bazlı doku yapıları yaklaşık iki saat içinde gerçekleştirilebilir.